课件：蛋白质和氨基酸测定学时资料.ppt

蛋白质和氨基酸测定,思考题 、硫酸、硫酸铜及硫酸钾在消化中起了什么作用？样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？ 2、甲醛法测定氨基酸的原理？ 3、考马斯亮蓝比色法及Lowry比色法测定蛋白质的原理？ 4、茚三酮比色法测定氨基酸的原理及影响因素？,1,蛋白质含量低大头娃娃,蛋白质含量“高”，肾结石,为何测定蛋白质 1、重要的营养物质 婴幼儿配方乳粉:蛋白质18%； （GB10765-1997） 婴幼儿配方乳粉、 :蛋白质12-18%； （GB10766-1997）,2,椰子汁中蛋白加热沉淀,黄酒贮藏中的沉淀大部分为蛋白质,2、影响食品色、香、味及结构,面筋蛋白：面包粉33%；蛋糕粉: 22%馒头粉25%-30%（ SB/T-93 ）,3,第一节 蛋白质的定量测定 定量方法：凯氏定氮法及分光光度法。 一、凯氏定氮法 奶粉中测得氮含量为2.12%,蛋白质含氮为16%，奶粉中蛋白质含量? 换算系数通常6.25，牛乳及制品为6.38，大豆及制品为5.71等。,4,丹麦化学家Johan Kjeldahl（1883）发明的，当时只用H2SO4分解试样，需长时间，后来Gunning改进，在消化时加入K2SO4使沸点上升从而加快分解速度。后来,5,1、原理 样品与硫酸、催化剂加热消化，蛋白质分解，其中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵，加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后以盐酸滴定。 硫酸钾之目的：提高沸点，加快有机物分解； 硫酸铜之目的：催化剂、消化终点的指示剂（CuSO4蓝绿色如果没消化完全，则为Cu2SO4）、蒸馏前加入碱量合适否的指示剂。2CuSO4+C=Cu2SO4+SO2+CO2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+SO2+2H2O,6,2、过程消化、蒸馏、吸收、滴定,（1）消化 小火至泡沫消失加大火力至透明无黑粒，摇动使瓶壁炭粒溶于硫酸中继续消化30min绿色,7,（2）蒸馏与吸收,常量凯氏定氮,微量凯氏定氮,改良微量凯氏定氮,8,A、蒸馏完全判断 经验时间：常量凯氏定氮约30min，微量定氮装置中是指示剂变色后，再蒸馏10min，提离液面，再蒸馏1min； 萘氏试剂遇氨气呈红棕色。 配制：3.5gKI+1.3gHgCl2 溶于70ml水，加4mol/lNaOH 30ml。 B、吸收 用2%或4%硼酸作为吸收液，应注意接收管浸没在吸收液中。 C、常量、半微量、微量概念,9,常量：0.1g，10mL； 半微量：0.01g-0.1g ， 1mL-10mL ； 微量：0.1mg-10mg，0.01mL-1mL。 eg:称样0.85g,消化后，直接蒸馏，取出消化液，定容至100mL，取其中的10mL蒸馏,常量凯氏定氮,改良微量凯氏定氮,10,（3）滴定 (NH4)2B4O7+HCl+H20NH4Cl+H3BO3 用盐酸标准溶液滴定吸收有氨气的硼酸液。 指示剂：0.1%甲基红+0.1%溴甲酚绿 终点判定 2%硼酸溶液，蓝绿色灰色 4%硼酸溶液，蓝绿色酒红色 主要与混合指示剂的变色范围有关： pH4.0红色 =5.1灰色 6.2绿色,11,样品中被恶意添加硫酸铵、氯化铵，？ 样品中被恶意添加硝酸铵，？ 样品中被恶意添加碳酸铵，？ 样品中被恶意添加尿素、三聚氰胺，？,N含量66.67%,12,策略一：甲醛法测定样品消化前铵盐含量 4NH4+ 6HCHO =(CH2）6N4 H+ + 3H+ + 6H2O OH- 六次甲基四胺（弱碱，pH8.7） (NH4+是极弱的酸，不能直接用NaOH滴定） 过程 ：样品+适量蒸馏水NaOH中和游离酸（甲基红指示剂，红色变橙色，pH为4.46.2 ）加入甲醛充分摇匀, 静置5min用NaOH标准溶液进行滴定（酚酞指示剂，pH为8.09.6 ）,13,注意： A、中和游离酸时只能用甲基红指示剂，如果甲醛中有甲酸，宜用NaOH先中和，此时指示剂用酚酞。 B、但要注意，甲醛也能和氨基酸发生反应，且能使酸性相对凸显。 C、碳酸铵不能用这种方法测定，因为生产的碳酸为弱酸，不能用NaOH滴定，况且CO2会挥发。 D、硝酸铵中NO3-中的N不能被直接测出，但可以通过分子式中的定量关系求出。,14,策略二：牛奶中铵盐的定性检测 2NH4+ + 2I- + 2ClO- = NHI2 + NH3 + 2Cl- + 2H2O 过程：奶样5ml，加入KI约0.25g，缓慢逐滴加入含NaClO5%的NaOH混合试剂，并同时观察奶样与最后所加试剂两者界面处的颜色变化，若出现棕灰至黑色浑浊，表明样品掺有铵盐。 （于琴，董文宾，赵旭博，郑 丹. 鲜奶中铵盐快速检测新方法研究.中国乳品工业. 2004，32，8.）,15,策略三：非蛋白质有机物物中的N，改用别的方法来测定蛋白质或别的方法测定恶意添加物。 三聚氰胺检测（GB/T22388-2008） HPLC（高效液相色谱法）、HPLC-MC、GC-MS HPLC A、提取 超声波及振荡下，三氯乙酸、乙腈混合提取，三氯乙酸沉淀蛋白，离心除杂。 B、净化,阳离子固相萃取柱，用水、甲醇洗脱除杂，氨化乙醇洗脱，收集洗脱液，备用。,16,C、测定 C8或C18柱 流动相：柠檬酸、辛烷磺酸钠、乙腈组成 流速1mL/min，柱温40，进样量20L 波长240nm 。,17,二、分光光度法,18,备注1：,19,双缩脲法,备注2： （1）lowry法的原理 色泽的变化主要缘于钼、钨化学价的降低，该物质的吸收波长在550-750nm之间，当蛋白质浓度在1-100g/ml时，用750nm或660nm，当蛋白质含量更高时，用550nm。 没有铜离子时，色泽由蛋白质中的酪氨酸及色氨酸残基含量决定，其次是半胱氨酸和组氨酸残基含量决定，铜离子将肽键聚合在一起，从而加速了电子的传递。 干扰物质较多：柠檬酸，tris，甘氨酸，组氨酸，谷氨酸，EDTA，葡萄糖，果糖，高浓度的尿素，硫酸铵等都有影响。,20,（2）试剂组成（/hansen/protocols/lowry.htm） Lowry A: 2% Na2CO3 in 0.1 M NaOH Lowry B: 1% CuSO4 in diH2O Lowry C: 2% sodium potassium tartrate (NaKC4H4O6 4H2O) Lowry stock reagent 49 ml Lowry A 0.5 ml Lowry B 0.5 ml Lowry C Folins Reagent: Phenol reagent - 2N (Folin - Ciocalteau reagent) 主要成分为：3H2OP2O513WO35MoO310H2O 3H2OxP2O514WO34MoO310H2O （ /wiki/Folin%E2%80%93Ciocalteu_reagent ）,Folin phenol试剂还可以测定酚类物质的含量（郑鸿元 许光辉 李凤珍等 .土壤微生物分析方法手册. 中国农业出版社，1986.）,21,（3）该法的历史 吴宪博士（18931959年）是国际著名生物化学家、中国近代生物化学事业的开拓者和奠基人于1922年发现Folin phenol reagent能测定蛋白质 (Wu, H. (1922) J. Biol. Chem. 51, 3339) 。 Lowry发现，在此前，先让蛋白质与铜发生发生络合反应（双缩脲法 ），能提高反应的灵敏度(Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R. J.(1951) J. Biol. Chem. 193, 265275）。,22,23,可编辑,第二节 蛋白质定性（略）,定性蛋白质主要是通过显色反应完成。 常用显色剂：氨基黑10B、溴酚蓝、考马斯亮蓝、酸性品红、氨基萘酚磺酸。 另外对于糖蛋白及脂蛋白都有专门的显色剂。,24,第三节 氨基酸定性,一、一般显色反应 茚三酮法：蓝紫色。 二、个别氨基酸的显色反应（略） 精氨酸的坂口反应、胱氨酸和半胱氨酸的显色反应等。,25,第四节 氨基酸定量,一、甲醛滴定法 1、原理 酸性的-COOH，碱性的-NH2，使氨基酸成为中性的内盐，加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，用碱滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量。 2、大约过程 加碱中和酸（pH 8.2）、加入甲醛，加碱滴定。当加入甲醛后，溶液的pH值还在8.2吗？当样品中存在4+时, 则测定结果偏大偏小？如何排除这种影响？,26,阮富升. 铵盐对甲醛法测定酱油氨基氮含量的影响. 中国调味品. 第8期1999年8月. 甲醛不但与氨基酸的氨基起反应,同时也与4+起反应，增 加了反应体系的酸性，这部分酸性不能代表氨基酸的羧基的酸性。 因此，以氢氧化钠标准溶液滴定时，会消耗更多的氢氧化钠标准 溶液，使氨基氮计算结果升高。,4NH4+ 6HCHO =(CH2）6N4 H+ + 3H+ + 6H2O,27,二、比色法,1、茚三酮法 氨基酸与茚三酮生成蓝紫色化合物二酮茚胺，该物在570nm有最大吸收（但脯氨酸和羟脯氨酸由于氨基被取代，生成物显黄色440nm有最大吸收）。,28,茚三酮反应的适宜pH为5-7 所有-氨基酸和蛋白质都有此反应，但有此反应的不一定都是-氨基酸和蛋白质，比如-丙氨酸、氨、许多一级胺与茚三酮都呈阳性。（郑继平，汤华，陈银华 .现代生物学实验指导. 中国农业出版社，2007.）但色泽不一定一样，比如，-氨基酸呈黄色，苯胺橙红色。（杨桂法等. 有机化学分析. 湖南大学出版社，1996. ）,29,但课本P140所谈及的及GB/T 8314-2002茶游离氨基酸总量测定时：-氨基酸在pH8.0的条件下与茚三酮共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定的波长下测定其含量。 茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化，使用前用活性炭吸附被氧化物而纯化。,30,2、邻苯二甲醛法（O-Phthalic aldehyde ,OPT) 邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，碱性溶液中，与氨基酸产生荧光物质，激发光波长为340nm，发射光波长为455nm。 灵敏度比茚三酮高，但荧光强度与氨基酸种类有关，对半胱氨酸、胱氨酸和赖氨酸等的荧光值偏低，和脯氨酸和羟脯氨酸不反应，尿素、尿酸及氨等不发生类似反应。,31,3、三硝基苯磺酸法（TriNitroBenzene Sulfonic acid ）,32,与茚三酮相比：灵敏度相当，且不受NH4+的影响，但不能与Pro反应，可以和Cys的-SH反应，为此，TNBS前，碱性条件下30保温数小时，使-SH都氧化成-S-S-后，再测定。 碱性条件下测定的优势是可以用420nm，在可见光范围内，劣势是每种氨基酸的消光系数不同；酸性条件下的优势是每种氨基酸的消光系数同，但需紫外光。,33,4、丹磺酰氯法（dansyl chloride） 丹磺酰氯是5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯（5-dimethylaminonaphthalene-1 -sulfonyl chloride）的简称。丹磺酰氯与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物(激发波长298nm，发射波长546nm），也常用于多肽链的N末端氨基酸的鉴定。,34,5、 2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）法 DNFB也叫做Sanger试剂，DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸）,35,36,1.0 mL 的0.2 mol/L NaHCO3,1.0 mL 的 1% DNFB (1.0mL 溶解在100mL的1,4-dioxane) ，1.0 mL 样品液, 黑暗处60 ，40min, 加入0.5 mL of 1 mol/L HCl终止反应，加入5mL乙酸乙酯萃取，静置10min,420nm测定，氨基酸浓度0.021.00 mg/mL有良好的线性关系 （Lin Chen，et al. A novel colorimetric determination of free amino acids content in tea infusions with 2,4-dinitrofluorobenzene. Journal of Food Composition and Analysis 22 (2009) 137141）。,几种比色法的比较,37,第五节 氨基酸分离及测定 一、蛋白质的水解 酸水解：5.7mol/L盐酸，密封的水解管中，105-115水解20h以上。盐酸水解后，色氨酸全部被破坏。 碱水解：5mol/L NaOH，充氮气后填充管，110水解22h，测定时，用6mol/L盐酸中和至pH6-7后测定，碱水解时，多数氨基酸破坏，仅色氨酸稳定，因此专用于色氨酸的测定。 磺酸水解：4mol/L甲基磺酸，并加入色氨酸保护剂，水解后，用3.5mol/L NaOH中和至中性，可以测定除半胱氨酸以外的所有氨基酸。 酶解：保持所有的氨基酸不被破坏，但水解不全，且酶本身也是蛋白质，对测定有干扰。 （颜真. 蛋白质研究技术. 西安：第四军医大学出版社，2007）,38,二、氨基酸的薄层层析法 、原理 制备样品，点其于薄层板，双向上行法展开，组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，氨基酸得到分离。后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，通过比移值（）定性，斑点颜色深浅大致定量。,39,、过程 （）薄层板制备 吸附层析:如硅胶、氧化铝、聚