课件：基因诊断和基因治疗.ppt

Gene diagnosis and gene therapy,基因诊断(gene diagnosis)： 以DNA和RNA为诊断材料， 应用分子生物学技术方法，直接检查基因的结构、或表达是否异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。,一、诊断下列两种类型疾病：,1、内源基因的变异 基因结构的异常 基因致病 基因表达的异常 2、外来生物的入侵,基因诊断的特点： 1.特异性高，针对性强： 使用基因探针通过分子杂交进行高特异性分析以基因作为检测对象，属于病因诊断或发病原因分析。 2. 灵敏度高: 用放射性同位素、酶或化学发光试剂标记探针，有很高的检测灵敏度，PCR扩增也有很高的灵敏度。 3.早期诊断：无临床表现 4.取样方便：不受组织时相限制 5.安全高效：不必培养高危病菌病毒，还可分亚型 6. 适应范围广：可检测内源性基因和外来基因。,二、基因诊断的遗传标记,1. 人类基因组中存在三类主要的遗传变异 （1）第一代多态性标记是RFLP（限制性片段长度多态性) (2)第二代短串联重复多态性（short tandem repeat polymorphism STRP） (3)第三代多态性标记是单核苷酸的多态性SNP,第一代多态性标记是RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）,第二代多态性标记是短的串联重复序列 包括小卫星DNA和微卫星DNA，其多态性主要来自重复序列拷贝数的变化,小卫星DNA由15-65bp的基本单位串联重复而成，长度一般不超过20kb。 重复次数（小卫星DNA区的长度）在人群中是高度变异的；按照孟德尔的规律遗传,微卫星DNA/简短串联重复（STR、STRP或SSLP） 重复单元2-8bp，通常重复10-60次,CTAGCTTATATATATATATATATATATATAAGCTTGC,第三代多态性标记是单核苷酸的多态性 （single nucleotide polymorphism，SNP）,SNP：是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。,人类999的基因密码是相同的，而差异不到01，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由“单一核苷酸多样性”（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础,从而说明人类不同“种属”之间并没有本质上的区别。,SNP与RFLP和STR标记的主要不同之处在于，它不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记。,三、人类疾病与基因密切相关,1、基因结构改变导致蛋白质的结构或数量发生变化导致疾病 2、基因表达异常 3、病原生物基因入侵导致疾病 4、可遗传的基因组变异导致人类疾病易感性差异,四、基因诊断中常用的分子生物学技术,核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blotting） 免疫组织化学诊断,基因诊断中常用的分子生物学方法比较,遗传病的基因诊断 Gene Diagnosis of Hereditary Diseases,（一）镰状细胞贫血病,一、血红蛋白病,1.镰状红细胞贫血患者基因诊断-ASO杂交法 2.HBS的限制性内切酶谱分析 3.HBS的PCR-RFLP分析,正常的（N）的ASO探针： 5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 突变的（M）的ASO探针： 5-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3,1.镰状红细胞贫血患者基因诊断 ASO杂交法,M N,M N,M N,M N,5,3,正常基因,1.15kb,(CCT GAG G),突变基因,1.35kb,(CCT GTG G),镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析,Mst酶切位点（CCTNAGG）,2. HBS的限制性内切酶谱分析,目 录,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带者,患者,镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析,目 录,PCR-SSCP技术检测DNA突变,传染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Diseases,一、病毒性疾病,甲型肝炎病毒（HAV） HAV系RNA病毒，利用RT-PCR技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。 乙型肝炎病毒（HBV） 设计保守区序列引物，扩增各型HBV DNA片段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型HBV DNA，以便分型。 丙型肝炎病毒（HCV） HCV为正链RNA病毒，先反转录成cDNA，再进行巢式PCR检测HCV。,肿瘤的基因诊断 Gene Diagnosis of Malignant Tumors,一、原癌基因与抑癌基因的检测,1原癌基因的检测 ras 基因家族由H-ras、K-ras和N-ras组成。最常见的突变是第12、13、59或第61位密码子的点突变。 胰腺癌、结肠癌、肺癌以K-ras突变为主，如第12位密码子突变，由编码甘氨酸的GGT突变为TGT、GTT或GAT，少数突变为GCT。 急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。,PCR及PCR-SSCP分析：扩增ras 基因第12位密码子点突变部位，再用SSCP技术进行分析，或者直接测序确定患者ras原癌基因的点突变。 核苷酸杂交技术（如ASO）：检测ras基因第12位密码子点突变。,2. ras原癌基因突变常用的检测方法,3抑癌基因p53的检测,p53基因以密码子第175位、第248位、第249位、第273位及 第282位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的p53基因蛋白。 p53的基因诊断方法有 （1）PCR-SSCP分析技术 （2）DNA序列分析 （3）PCR-RFLP分析,基因治疗 Gene Therapy,基因治疗：指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。,（一）基因置换（gene replacement）,定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。,目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。,一、基因治疗的策略,转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。 基因同源重组技术又称为基因打靶（gene targeting),基因同源重组技术,（二） 基因添加（gene augmentation）,定义: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。,类型:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能； 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。,（三）基因干预（gene interference） 定义： 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。 反义RNA，核酶，RNAi等,定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。 应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。,（四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy),自杀基因的作用机制,（五）基因免疫治疗,通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。,2019/9/1,39,可编辑,二、基因转移技术,基因治疗的两种途径,体内法基因治疗 体外法基因治疗,基因转移(gene transfer)技术,1.病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移,1.病毒介导的基因转移系统,病毒载体 介导的基因转移效率较高，也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载体。,反转录病毒的结构及生活周期,（1）反转录病毒,RNA病毒 HIV 病毒的复制,两端各有一长末端重复序列LTR。,反转录病毒前病毒的结构特点,LTR由U3、R和U5三部分组成。,病毒有三个结构基因,5端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。,含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点。,在U3内有增强子和启动子； U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ； 在R内还有poly(A)加尾信号。,gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原； pol基因，编码反转录酶； env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。,反转录病毒载体的制备和转染,反转录病毒介导的基因转移系统,1)反转录病毒载体： 它可以克隆并表达外源治疗基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。,2）辅助细胞株(如PA317)： 能合成包装蛋白，用于反转录病毒载体包装。,反转录病毒载体的特点,1）反转录病毒包膜上糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使反转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。,2)前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。,3) 病毒颗粒以出芽的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。,反转录病毒载体的主要缺点,1）随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险； 2）反转录病毒载体的容量较小，只能容纳7kb以下的外源基因。,（2）腺病毒(adenovirus)载体 腺病毒是双链DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。,腺病毒的优点,基因导入效率高，对人类安全；,宿主范围广；,基因转导与细胞分裂无关；,重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；,腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。,腺病毒载体缺点,宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。,靶向性差。,不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。,（3）腺病毒相关病毒载体 单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。,AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具反转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。,AAV载体的缺陷,常用基因治疗载体,7.5kb,2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA转移至细胞内，并进行表达。 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。,脂质体介导的基因转移示意图,（2）受体介导转移技术,将DNA通过多聚阳离子与细胞配体偶联，多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。,受体介导转移技术示意图,（3）基因直接注射技术 将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%40%； 将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； 肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子 。,基因直接注射法的优点,制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易； 排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用； 导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点； 基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。,三、基因干预 （gene interference） （一）反义RNA（antisense RNA） （二）干扰RNA RNAi （三）核酶技术,四、基因治疗的应用研究,（一）遗传病的基因治疗研究,(一)遗传病基因治疗必须符合以下要求 1.在DNA水平明确其发病原因及机制； 2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传； 3.该基因的表达不需要精确调控； 4.该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥其生理作用； 5.该遗传病不经治疗将有严重后果(如不治疗难以存活等)。可供选择并符合上述4条以上要求的不过只有30余种遗传病。,腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏症 珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 血友病和其他血浆蛋白缺乏症 苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征 家族性高胆固醇血症 囊性纤维化病,腺苷酸脱氨酶（ADA）基因缺乏症,（二）恶性肿瘤基因治疗研究,（1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；,（2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；,（3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修