p16ink4a基因的分子生物学研究进展(1).doc

p16ink4a基因的分子生物学研究进展张毅彬关键词：p16ink4a基因；CDK4 / 6；细胞周期；肿瘤发生【摘要】 抑癌基因p16ink4a在特异地抑制 CDK4及CDK6在控制细胞生长、抑制肿瘤发生、 促进细胞衰老等方面发挥重要的生物学作用，该基因失活后导致了细胞周期的调控失常,使得细胞异常增殖,导致了肿瘤的发生、发展，本文就近几年来有关它在染色体上的定位、结构以及在细胞增殖、癌变过程中的研究进展作一综述。p16ink4a基因最早作为肿瘤抑制基因由美国冷泉实验室在1994年发现，属于细胞周期依赖性激酶抑制基因INK4家族的一员1，在正常细胞中具有调控细胞周期的作用，负调节细胞增殖及分裂，在人类50%肿瘤细胞中发现有缺失、突变或者表观遗传上的沉默2。1p16ink4a基因的结构和定位人类p16ink4a基因位于第9号染色体断臂的2区1带，即9P21的CDKN2A位点，CDKN2A基因位点包含INK4A和ARF两个重叠基因，因阅读框不同分别编码蛋白p16ink4a和p14ARF，p16ink4a基因全长约8.5kb，由 3个外显子exon1（126bp）,exon2(307bp),exon3(11bp)加上2个内含子构成，其编码的p16ink4a蛋白由148个氨基酸组成，定位于细胞核内。2p16ink4a与细胞周期调控在正常增殖的组织细胞中，p16ink4a蛋白的表达处于一个较低的水平，并通过p16ink4a-CDK4/6-Rb途径调控细胞周期。Rb基因即成视网膜瘤基因，是一种重要的抗癌基因，细胞中的Rb基因在激活状态下可编码Rb蛋白，并通过Rb蛋白调控转录因子E2F的活性，从而最终调节细胞周期。处于G0/G1期细胞中的Rb蛋白处于去磷酸化状态，并与转录因子E2F组成复合体，从而阻断E2F与顺式作用元件的结合,进而阻遏基因的表达。如Rb蛋白与E2F结合后,可阻断编码DNA聚合酶、胸苷激酶、二氢叶酸还原酶等的相关基因的表达,使这些酶类不能合成,DNA的生物合成亦受阻，因此抑制了细胞的生长。当在有丝分裂信号的激活作用下，G1期细胞中的CDK4/6与cyclin D组成复合物，介导Rb蛋白磷酸化，磷酸化的Rb蛋白失去活性，释放出转录因子E2F，转录因子E2F与DNA启动子近端元件结合后,促进转录预始复合物(PIC)的组装,使结构基因稳定表达，细胞通过G1/S期检查点，从而促进细胞生长。p16ink4a的调控作用主要表现在p16ink4a蛋白直接与CDK4/6分子结合，从而竞争性抑制CDK4/6与cyclin D的结合，保持Rb蛋白的去磷酸化状态，进而使细胞停滞于G0/G1期无法进入S期启动染色体的复制以完成增殖活动3, 4，除此之外，p16ink4a还能扰乱CDK4/6与其他CDKI的结合，导致这些非p16的CDKI的释放，进一步抑制细胞周期5。当细胞出于一些较明显的异常状态时，如DNA损伤、原癌基因过度表达及细胞生理性老化时，就能启动p16ink4a的表达6。3p16ink4a基因与肿瘤在人类肿瘤中，在接近50%的肿瘤类型中发现p16ink4a基因有不同程度的失活7，p16在不同肿瘤中失活的评估几率如下：乳腺癌：20%；非小细胞肺癌：65%；结直肠癌：30%；膀胱癌：60%；头颈部鳞状细胞癌：50-70%；黑色素瘤：60%；白血病：60%；食道癌：70%；多发性骨髓瘤：60%；胰腺癌：85%8。在这些肿瘤中，许多p16失活的机制已经被阐明，包括基因纯合性缺失、杂合性缺失、点突变以及表观遗传上的启动子甲基化9, 10，p16的失活导致细胞过度增殖，并可使G1期未充分发育的细胞提前进入S期，引起增殖性疾病的发生，并且每一种肿瘤具有自己特有的失活类型，比如48%的胰腺癌样本中发现p16纯合性缺失，而在胃癌中，p16启动子甲基化是主要原因，比例高达34%，p16基因缺失和突变只占2%11，Chang等人发现膀胱癌中60%的p16基因启动子存在高度甲基化现象12，Hernandez等分析了4 2例慢性粒细胞白血病(CML)病人p16ink4a 基因外显子2的缺失和启动子甲基化情况，发现29%的淋巴细胞白血病急性变中存在p16ink4a基因的纯合性缺失，而慢性期和髓样细胞白血病中均未发现缺失，也未发现p16ink4a基因启动子的异常高甲基化，p16ink4a基因的缺失与临床特征无明显相关，提示p16ink4a基因的缺失与否并不能影响病人的预后13。Kwong等人分析了亚洲人种喉鳞状上皮细胞癌细胞系的p16ink4a的失活机制和功能，发现了启动子甲基化、外显子2和3的纯合性缺失、外显子1的框移突变导致了其转录失活和蛋白突变体的产生14。Grafstrom等运用实时定量PCR方法研究了86个病人p16ink4a基因的缺失情况及其与预后的关系，发现纯合性缺失是皮肤恶性黑色素瘤最重要的遗传学改变，且与不良预后密切相关15。另外，在小鼠肿瘤模型中, p16ink4a和 p14ARF 协同作用的缺失已经在一些肿瘤发生模型,包括在对特定致癌物质、黑素瘤、恶性胶质瘤和胰腺癌的反应中确立。此外，尽管大量的研究表明p16ink4a作为一个肿瘤抑制基因在肿瘤中的表达是下调的，但是也有部分报道认为p16ink4a在肿瘤中有过表达的情况，例如在子宫颈鳞癌和结肠癌的研究中，有报道p16ink4a在肿瘤细胞中过表达的现象发生16，并且p16ink4a高表达与病毒感染有关，如在人类乳头瘤病毒HPV相关口腔鳞状细胞癌中，高风险类型的HPV感染口腔细胞后，HPV所表达的E7蛋白能与细胞中Rb蛋白结合，阻止Rb与转录因子E2F结合，因此E2F具有活性，引起细胞分裂，又因为Rb-E2F复合物能负反馈抑制p16的表达，而E7蛋白与Rb蛋白结合后，Rb-E2F复合物不足，所以导致了p16ink4a高表达17, 18。而在非HPV感染的头颈部鳞癌中，p16ink4a低表达，癌细胞分裂活跃，而HPV感染的头颈部鳞癌中, p16ink4a因E7蛋白的缘故而高表达19，但即使p16ink4a在癌细胞中高表达，仍无法对抗癌细胞的异常增殖20。不过，这种p16ink4a高表达的口腔肿瘤对放射疗法的敏感性更高，并且p16ink4a可作为口腔癌临床预后的标志物，p16ink4a高表达阳性类型的预后较p16ink4a高表达阴性的更好21。另外，在肿瘤癌前病变组织中也可以监测到p16ink4a的高表达，可以认为这种变化是为了抑制病变的继续发展22。4p16ink4a与细胞衰老 细胞衰老也称细胞老化,一般是指细胞在信号转导作用下不可逆地脱离细胞周期并丧失增生能力后进入的一种相对稳定状态。细胞衰老是生物体中普遍存在的一种不可逆的生长停滞现象,是器官衰老的基础,存在于任何生命的任何时期,在不同情况下其速率与程度有所差别。己有研究证明基因是细胞衰老的关键效应物，是遗传控制程序中的主要环节，它通过定途径调控细胞周期，影响细胞的生物钟细胞寿命和端粒长度，而非激活端粒酶起作用，细胞衰老的遗传原因有很多种,其中有一个原因是突变的癌基因所产生的信号导致细胞衰老。目前发现这种现象与p16ink4a- Rb和p14ARF-p53这2条途径有关, Rb和p53是衰老信号通路网络中的 2个重要的控制点23。在人类肾脏组织细胞和皮肤细胞的衰老过程中都显示出p16ink4a的表达上升24，提示这个肿瘤抑制基因在细胞衰老中的重要作用。除此之外，有报道发现p16ink4a在衰老的成纤维细胞中过度表达25，在氧化应激和DNA损伤中也有被报道有过表达现象的发生26, 27。Janzen等发现p16ink4a的表达在HSCs 、NSCs和胰腺干细胞中都显示了其促进衰老和抗增生能力,这表明在这些干细胞中p16ink4a的表达能够通过抑制增生和自我更新而促进衰老,是引起衰老的原因之一28, 29。Han 等研究发现p16ink4a蛋白能增加p21蛋白的稳定性，p21蛋白则通过转录因子SP1 激活p16ink4a基因的表达，二者协同抑制细胞周期，细胞周期的停滞则是细胞衰老的前提，说明p16ink4a基因可能通过促进p21基因的表达导致细胞衰老30. 尽管诸多的报告显示p16ink4a与细胞衰老有千丝万缕的联系，但目前p16ink4a在细胞衰老过程中的完整的具体机制尚未明了31。5p16ink4a基因表达的调控作为调控因子，已知有一些肿瘤相关因子或分子信号通路影响p16ink4a的表达。其中最好的研究就是通过激活 Ras 及其下游效应器B-Raf的突变来诱导 ERK/MAPK通路。已有研究证明RAS活化可能导致p16ink4a表达,包括ERK介导的 Ets1/2活化诱导p16ink4a的表达和Jun介导的转录因子DMP 1活化诱导p14ARF的表达，另外polycomb 家族 ( PcG) 基因 ( BMI - 1、Cbx 7、Mel 18) 等也抑制p16ink4a的表达。在成纤维细胞中,Ets1、Ets2转录因子可通过与p16ink4a启动子中的Ets结合位点(GGCC)结合而使其激活,促进p16ink4a转录。在低代龄(30代)成纤维细胞中大量存在的Ets2对p16ink4a的诱导,可被Ras-Raf-MAPK激酶信号所加强,同时可被Id1的直接作用所抑制32。E蛋白是一类含有bHLH结构域并通过与E-box结合来激活转录的蛋白家族,它包括E12、E47、E2-2、HEB4个成员。p16ink4a启动子内含有2个E-box结构，E蛋白以其bHLH结构域结合这两个E-box,上调p16ink4a的转录水平,诱导衰老表型出现。Id1也是E-box结合蛋白序列特异性转录抑制因子33。在细胞中, 具有锌指结构的Sp(specificityprotein)家族转录因子与GC盒相互作用，目前已知有Sp1Sp88种蛋白质。p16ink4a启动子无TATA盒,其启动子上GC含量丰富,且含有5个Sp家族转录因子结合位点,Sp家族中转录因子Sp1通过与这些GC盒结合来促进p16ink4a的转录24。LI等认为p16ink4a启动子-426到-433区域含有一个HMG盒包含蛋白1（HBP1），其与p16ink4a启动子的结合能上调p16ink4a的表达34。哺乳动物的AP1蛋白能以同源二聚体或异源二聚体的形式组成bZIP蛋白，包括C-JUN、junB等等，在小鼠p16ink4a启动子区域中发现3个AP1样结合位点，bZIP蛋白与AP1样位点结合后能促进p16ink4a的表达35。Id家族可抑制Ets蛋白对p16ink4a的转录激活作用。在成纤维细胞中,Ets1和Ets2可通过与p16ink4a启动子中的Ets结合位点结合,促进p16ink4a转录,但同时可被Id1的直接作用所抑制。因此,在该细胞中虽然大量表达Ets2,但可能由于Id1抵消了Ets2对p16ink4a的促进作用,使p16ink4a在年轻细胞中只有低水平表达;而在衰老细胞中,Ets2和Id1水平下降,Ets1水平上升,这样仍可使p16ink4a的表达显著增加32。甲基化对p16ink4a的转录有负调控作用，其中p16ink4a基因5端启动子区及第一、二外显子的CpG岛甲基化使其不能完成转录是导致抑癌基因失活的重要原因, 如脑部肿瘤、乳腺癌、结肠癌、头颈部肿瘤、肺小细胞肺癌和非霍奇金病等疾病中都有相关报道36。polycomb 家族 ( PcG) 基因通过染色质修饰调控靶基因的转录抑制子，与细胞的增殖、分化和肿瘤发生有密切关系，从生化和功能上它可以分成两个主要的核心蛋白复合体PRC1(Polycomb repressive complex 1)和PRC2(Polycomb repressive complex 2)，BMi1、Cbx7、Ring1b以及Phc2都属于PcG基因，如BMi1基因的靶基因就是CDKN2A位点，在小鼠模型和细胞实验中，都确认了BMi1能下调p16ink4a及p14ARF的表达37。6其他 在细胞的其他一些活动过程中，p16ink4a也扮有相关作用，例如细胞凋亡、细胞侵袭、血管生成等等，并且这些活动与它在肿瘤中的过表达有一定联系。另外在红细胞发育过程中，p16通过调节bcl-X与NF-KB通路来促进红细胞分化和凋亡38。Harada发现在恶性神经胶质瘤中，p16ink4a能下调VEGF的表达，从而抑制肿瘤的血管生成过程39。7展望 在这篇综述中，我们简单地阐述了p16ink4a基因的结构、功能、相关疾病的关系以及众多转录因子对其复杂的正、负调控，尽管在探索P16分子在细胞中的相关作用及表达产物的功能研究上已经取得一定的成果，但我们仍未全面了解清楚，尤其是p16ink4a与细胞衰老发生的机制方面还需要更多的探索与研究，拓展其在细胞和机体中以及在更多不同疾病中相关功能的认识，无疑将有助于人们更好的掌握细胞生长规律，这样才能为新的治疗方法和策略指明方向。参考文献：1.Kamb, A., et al., A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. 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