维生素类药物的分析.ppt

第十四章 维生素类药物的分析,维生素： 是维持人体正常代谢机能所必需的微量营养物质。人体不能合成维生素。,VitA、D2、D3、 E、K1 等,脂溶性,水溶性,VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、泛酸,分类：,-H 维生素A醇 -COCH3 维生素A醋酸酯 -COC15H31 维生素A棕榈酸酯,R :,第一节 维生素A的分析,全反式,维生素A 325.5 100% 全反式 新维生素Aa 328 75% 2顺 新维生素Ab 320.5 24% 4顺 新维生素Ac 310.5 15% 2，4顺 异维生素Aa 323 21% 6顺 异维生素Ab 324 24% 2，6顺,相对生物效价,顺反异构,（一）结构：具有共轭多烯侧链的环己烯,一、结构与性质,VitA2,VitA3,共轭多烯侧链易发生脱氢、脱水、聚合反应,鲸醇,环氧化物,VitA醛,VitA酸,CHCl3,（二）性质,1.溶解性：易溶于有机溶剂和植物油等，不溶于水 2.不稳定性 3.紫外吸收特性 4.与三氯化锑呈色,（一）三氯化锑反应,条件： 无水、无醇,CHCl3,二、鉴别试验,SbCl3,水,SbOCl,乙醇可使碳正离子的正电荷消失,蓝色,紫红,BP（2008）,max为326nm 一个吸收峰,max为350390nm 三个吸收峰,去水VitA（VitA3）,VitA,USP 显色剂 磷钼酸 规定斑点颜色和Rf值,BP 对照品法 显色剂 三氯化锑,立体异构体 氧化产物及光照产物 合成中间体 去氢维生素A（ VitA2） 去水维生素A（ VitA3）,UV法（三点校正法）,（一）,三点校正法 1. 前提条件： （1）杂质的吸收在310340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小； （2）物质对光的吸收具有加和性。,测定对象：VitA醋酸酯,第一法 等波长差法,第二法 等吸收比法(皂化法),测定对象：VitA醇,2. 波长的选择： （1） 1 VitA的max（如VitA酯 328nm） （2） 2 3 分别在1的两侧各选一点,第二步：求,3、测定法 （1）基本步骤: 第一步：A选择，A328测定或A328校正,第三步 求效价,第四步：求标示量,A*D*换算因数*W,换算因数：,单位E 数值所相当的效价数,（由纯品计算而得）,判断 是否在326329nm之间,改用第二法,是,否,求算 并与规定值比较,1、,维生素A醋酸酯-第一法（等波长差法）,A值的选择：,规定值 差值,判断差值是否超过,第二法,第二法,计算 A328（校正）,用A328计算,有超过0.02,无超过,f,VitAD胶丸中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.08262g/丸）的内容物 0.2399g 至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一20 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为,A300 ：0.354 A316 ：0.561 A328 ：0.628 A340 ：0.523 A360 ：0.216,A300 /A328 ：0.555 A316/A328 ：0.907 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.811 A360/A328 ：0.299,求本品中维生素A的含量？,A300 /A328 ：0.564 A316/A328 ：0.893 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.833 A360/A328 ：0.344,0.555 0.907 1.000 0.811 0.299,+ 0.01 0.01 0 + 0.02 + 0.04, ,= = = = =,水溶性,脂溶性,2、维生素A醇-等吸收比法（皂化法、6/7A法,判断max是否在323327nm之间,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算,是,否,0.73,0.73,0,3%,3%,f,（二）高效液相色谱法,色谱柱：硅胶； 流动相：正己烷-异丙醇（997：3） 检测波长：325nm 流 速: 1.2ml/min 内 标：VA醋酸酯,三氯化锑比色法,（三）,优点： 简便 快速,max 618nm620nm,标准曲线法,氨基嘧啶环CH2噻唑环(季铵盐),第二节 维生素B1的分析,HCl,Cl-,一、结构与性质,（一）结构,1. 溶解性：易溶于水，水溶液呈酸性。,3. UV共轭双键max = 246nm,二、性质,2. 硫色素反应,4. 与生物碱沉淀试剂反应,5.氯化物的特性,专属性反应,二、鉴别试验,硫色素，蓝色荧光,2H,VitB1,H+,H+,H+,H+,S元素反应,H+,Cl-,三、含量测定,冰醋酸+醋酐，电位法指示终点,（一）,非水溶液滴定法,UV法,（二）,= 421,A = ECL,片剂、注射剂,NaOH,+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇,+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇,S,d,A,b,对照液,供试液,d,S,b,A,C样,-,-,=,C标,（1）灵敏度高，线性范围宽 （2）专属性强，氧化产物及代谢产物不干扰，可用于制剂分析，体液分析等。,第三节 维生素C的分析,L抗坏血酸,（一）结构,二烯醇 内酯 两个手性碳（C4,C5）,（二）性质,1. 溶解性：易溶于水水溶液呈酸性 2. 酸性：一元酸，C3OH的pKa = 4.17，C2OH的 pKa = 11.57 3. 旋光性：手性C（C4、C5） 4. 还原性 5. 水解反应： 6. 具糖的性质：具糖类的性质与反应 7. UV特征,*,*,有活性,有活性,无活性,二烯醇结构-还原反应,利用还原性：与氧化剂的反应,（一）与AgNO3反应,（二）与2，6 - 二氯靛酚反应,氧化型,与碱性酒石酸铜反应,USP,与KMnO4反应,（三）与其他氧化剂反应,四、薄层色谱法: Rf值,（蓝色）,（五）糖类的反应,BP,0.01mol/L HCl,（六）UV,三、杂质检查,（一）溶液的澄清度与颜色检查,（二）铁、铜离子的检查,维生素C原料药 片 剂 注射剂,维生素C原料药,糠醛缩合呈色,原子吸收法,（三）草酸的检查：氯化钙,指示剂 淀粉,（一）碘量法,四、含量测定,原理：利用Vc强的还原性,H+,取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。,2、方法,原料药,（2）酸性环境 稀醋酸,（1）新沸冷H2O,减慢VitC被O2氧化速度,（3）立即滴定,赶走水中O2,减少O2的干扰,3、讨论,4. 附加剂干扰的排除,片剂 过滤,(二) 2，6 - 二氯靛酚滴定法,1、原理,2、方法,自身指示终点法,（2）快速滴定 2min内,（1）酸性环境 HPO3-HAc,稳定VitC,防止其他还原性物质干扰,（3）亦可剩余比色测定,（定量过量）,（测剩余染料）,3、讨论,（4）缺点,需经常标定,贮存一周,专属性强，多用于含 Vc的制剂和食品的分析,（5）优点,（三）高效液相色谱法,血浆中维生素C的测定(稳定性） 标准溶液包括样品预处理过程均需加入偏磷酸，偏磷酸同时可用于血样中的蛋白沉淀；当天取血当天测定；处理好的样品亦需冰箱保存,第四节 维生素D的分析,一、结构与性质,（一）结构,维生素 D2(麦角骨化醇),维生素D3(胆骨化醇),1.性状：无色针状结晶或白色结晶性粉末；无臭，无味。 2.溶解性：宜溶于有机溶剂，在植物油中略溶，在水中不溶。 3.不稳定性：含有多个烯键，所以极不稳定，宜氧化变质，效价降低，毒性增强。,（二）性质,4旋光性 维生素D2 6个手性碳原子 维生素D3 5个手性碳原子 5显色反应：甾类化合物 氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色 6紫外吸收特性：无水乙醇 265nm,醋酐 硫酸,二、鉴别试验,（一）显色反应,1与醋酐-浓硫酸反应,氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色,醋酐 硫酸,2与三氯化锑反应,本品,1,2-二氯乙烷,三氯化锑试液,橙红色,粉红色,3其它显色反应,维生素D,三氯化铁,橙黄色,二氯丙醇 乙酰氯,绿色,（二）比旋度鉴别,无水乙醇溶液,维生素D2,比旋度为102.5至107.5,维生素D3,比旋度为105至112,（三）其它鉴别方法,薄层色谱法、HPLC法 制备衍生物测熔点,紫外、红外吸收光谱,（四）维生素D2、D3的区别反应,维生素D2,维生素D3,96%乙醇,10ml,取0.1ml,乙醇1ml 和85%硫酸5ml,红色max570nm,黄色 max495nm,三、杂质检查,（一）麦角甾醇的检查,维生素D290%乙醇溶液,洋地黄皂苷溶液,不得发生浑浊或沉淀,（二）前维生素D的光照产物,四、含量测定,正相高效液相色谱法,（一）维生素D测定法,含量以单位表示 每单位相当于维生素D 0.025g,注意：计算的是维生素D及前维生素D经折 算成维生素D的总量,测定在半暗室及避免氧化的情况下进行,第一法：无干扰杂质,第二法：有VA及其他杂质干扰,第三法：用第二法时，前 VD峰受杂质干扰 仅VD峰可分离,第一法,内标物：邻苯二甲酸二甲酯,色谱条件及系统适用性试验：,填充剂：硅胶 流动相：正己烷-正戊醇（997：3） 检测波长：254nm,无干扰杂质,维生素D3,光照,前维生素D3 反式维生素D3 维生素D3 速甾醇D3,与维生素D3的比保 留 时 间,分离度,1.0,1.0,溶液组成,先后进样5次，维生素D3 峰面积的 RSD2.0 %,0.5 0.6 1.0 1.1,系统适用性试验,校正因子测定：,维生素D的校正因子: f1=Asmi/Aims,前维生素D折算成维生素D的校正因子:,f2=（Asmr-f1msAr1）/（Ar2ms）,含量测定：计算维生素D及前维生素D折算成 维生素D的总量,mi=（f1Ai1+f2Ai2）ms/As,第二法,第一步：皂化提取,有VA及其他杂质干扰,第二步：分离收集,供试品溶液A,RP-HPLC,维生素D 前维生素D 维生素A及其他杂质,叠峰,分离,收集,供试品溶液B,维生素D及前维生素D,第三步：按第一法进行含量测定（内标法）,挥干,内标的正己烷溶液,溶解,第三法,第一步：皂化提取,同第二法得供试品溶液A,第二步：,供试品溶液A,RP-HPLC,维生素D 前维生素D 维生素A及其他杂质,叠峰,分离,供试品溶液C,收集,挥干,异辛烷溶解,90、1.5h,挥干,正己烷溶解,前维生素D 维生素D,第三步：用第一法色谱条件按外标法计算含量,用第二法时，前 VD峰受杂质干扰,苯并二氢吡喃醇,第五节 维生素E的分析,一、结构与性质,（一）结构,*,*,*,生物效价 右旋体 ： 消旋体 = 1.4 ：10,dl生育酚醋酸酯,（二）性质,1、溶解性：易溶于有机溶剂，不溶于水,4、UV,2、水解性：酯键易水解,3、氧化性,（一）,硝酸反应,橙红色,二、鉴别试验,（橙红色）,生育红,生育酚,HNO3,强氧化剂,三氯化铁联吡啶反应,（二）,生育酚,对-生育醌,红色,Fe3+,O,max = 284nm,min = 254nm,0.01%无水乙醇中,薄层板 硅胶G,展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1）,显色剂 硫酸（105 5）,（五）其他鉴别方法 红外、气相色谱法,（二）生育酚,三、杂质检查,1. 原理：游离生育酚还原性，硫酸铈滴定,2. 试剂：硫酸铈滴定液（0.01mol/L） 指示剂：二苯胺（亮黄灰紫）,（一）酸度：游离醋酸,四、含量测定,GC法,（一）,GC特点,1、,选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好,挥发性低、不稳定、极性强衍生化。易受样品蒸气压限制,固定液硅酮（OV-17） 担体硅藻土或高分子多孔小球 柱温265 检测器氢火焰离子化检测器(FID) 内标正三十二烷,内标法加校正因子定量,2、VitE测定的色谱条件,几种常用的固定相 非极性：OV-1、SE-30、HP-1（100%二甲基聚硅氧烷），分析：溶剂、石油产品、药物，按沸点出峰；一般使用温度：-60340。 非极性：SE-54、HP-5、DB-5（5%二苯基95%二甲基聚硅氧烷），分析：环境样品、香料；使用温度：-60325。,中等极性：OV-17、HP-50+（50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷）。用途：酯类及其它极性适中的药物；一般使用温度：25340。 极性：PEG-20、Carbowax20M、INNOWAX（聚乙二醇）。用途：香料、酸类、胺类、溶剂。一般使用温度： 40280,毛细管色谱柱选择,样品容量与柱内径、膜厚及溶解度关系，记住相似相溶原理 一般厚膜柱适合分析低沸点样品；薄液膜适合分析高沸点化合物，同时固定相流失少。 检测器：主要有热导检测器（通用）、氢火焰离子化检测器、电子捕获检测器,样品 dl生育酚 固定相十八烷基