药物分析第四章药物的含量.ppt

第四章 药物的含量 测定与分析方法的验证,主要内容,序 言 药物含量的基本知识 第一节 定量分析方法的分类 第二节 药物分析方法的验证 第三节 分析样品的制备,定义：系指药物中所含主成分的量，是评价药物质量的重要指标。 意义：是评价药物质量的主要手段，也是药品质量标准的重要内容。,1. 药物的含量,2. 药物含量的测定,测定方法：化学法、物理学法、生物学法、微生物学法等。,分类：含量（测定）、效价（测定）； 注意：效价测定的方法建立与验证过程各具特殊性，本章主要讨论基于化学学或物理学原理的“含量测定”。,3. 含量测定的分析方法,要求：操作简便、结果准确、重现性好。 方法选择：容量分析法，光谱分析法，色谱分析法, 化学原料药：因纯度较高、杂质较少，强调结果的准确与重现，通常要求方法具有更高的准确度和精密度，首选容量分析法； 多数具有特征结构或取代基的化学原料药可不经特殊处理，使用适当的溶剂溶解后直接测定；, 药物制剂：因组分复杂，干扰较多，限度较宽，强调方法的灵敏度和专属性或选择性，多采用具有分离能力的色谱分析法，在无干扰时也可选用光谱分析法； 药物制剂的前处理方法着重考虑的是处方组成中干扰组分的排除。,一、容量分析法,定义：将已知浓度的滴定液（标准物质溶液）由滴定管滴加到被测药物的溶液中，直至滴定液与被测药物反应完全（通过适当的方法指示），然后根据滴定液消耗的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系式计算出被测药物的含量。,第一节 定量分析方法的分类,一、容量分析法,终点判定：通过指示剂颜色变化，或者电子设备的电位或电流突变来指示滴定终点； 滴定误差：滴定终点和化学计量点不一定恰好符合，二者之差称为滴定误差，应该尽量减小滴定误差。,（一）容量分析法的特点与适用范围,特点,简便易行：所用仪器价廉易得，操作简便快速,耐用性高：影响测定的试验条件与环境因素少,结果准确：误差低于0.2%，满足准确度高样品,专属性差：对相近杂质干扰缺少选择，适用于主成分含量较高的样品分析,适用范围：广泛应用于化学原料药的测定，较少应用于药物制剂的测定。,例如,（二）容量分析法的有关计算,1.滴定度,定义：每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物的质量，ChP用毫克（mg）表示。,用碘量法测定维生素C的含量时，ChP规定：每1ml碘滴定液（0.05mol/L）相当于8.806mg的维生素C（C2H8O6）。,用B来滴定A,2.滴定度的计算,滴定液,被测药物,摩尔质量/分子量,参与反应的质量,摩尔浓度,滴定度,计算有一个从质量到物质的量，再到浓度再到滴定度的转变过程。,计算通式,示例一 计算维C的滴定度T,碘量法测定维C含量M(C6H6O6)=176.13，m(I2)=0.05mol/L,mB=0.05mol/L,1,1,MA=176.13,示例二 异烟肼的滴定度,溴酸钾法测定异烟肼含量M(C6H7N3O)=137.14， m溴酸钾=0.01667mol/L,3.含量的计算,滴定方式：直接滴定法、间接滴定法,直接滴定法,在实际工作中，滴定液的浓度可能与药典规定的浓度并不一致，所以应该进行校正。,直接读取,药典规定,校正系数,取样量,校正方式,间接滴定法,间接滴定法,不直接对待测物进行滴定，而采用间接途径滴定。,生成物滴定法,示例三 葡萄糖酸锑钠的含量测定,本法先用葡萄糖酸锑钠与碘离子反应生成碘，再用碘与硫代硫酸钠反应生成碘离子，相当于用硫代硫酸钠在滴定葡萄糖酸锑钠，故要找出它们两者的量反应关系，也就是a和b,请读取,请校正,Sb5+2S2O32-,滴定度T的计算示例如下,剩余滴定法,关键点：求出滴定液A作用于药物反应的实际量。 滴定过程通常需进行空白试验校正。,供试品,第一滴定液,第二滴定液,剩余滴定法,当不进行空白校正时：,剩余滴定法,当进行空白校正时：,没有药物存在时，滴定液A全部与滴定液B反应,药物存在时，剩余滴定液A全部与滴定液B反应,示例四 司可巴比妥钠的含量测定,已知：称样量：W=0.1022g；司可巴比妥钠M=260.23；司可巴比妥钠与溴反应摩尔=1:1；硫代硫酸钠浓度校正因子=1.038； 供试品滴定Vs=15.73ml；空白试验滴定V0 =23.21ml。,练习 非那西丁含量测定,精密称取本品0.3630g加稀盐酸回流1小时后，放冷，用亚硝酸钠液（0.1010mol/L）滴定，用去20.00ml。每1ml亚硝酸钠液（0.1mol/L）相当于17.92mg的C10H13O2N，请计算非那西丁的含量。,光谱分析法,药典收载,紫外可见分光度法,原子吸收分光光度法,红外分光度法,荧光分析法,火焰光度法,本章讲授,紫外可见分光度法,荧光分析法,二、光谱分析法,（一）紫外-可见分光度法,光谱条件：基于物质对紫外区(200400nm)和可见光区(400760nm)的单色光辐射建立起来的光谱分析法； 科学基础：朗伯-比尔定律,E为单位浓度、单位液层厚度时的吸光度,主要特点,灵敏度高：可达10-7g/ml 10-4g/ml； 准确度高：RSD（%）为2% 5%； 简便易行：仪器价格低廉，操作简单，易普及； 专属性差：应用范围广，不受一般杂质的干扰，但对结构相近的有关物质缺乏选择性。,仪器校正和检定,波长校正,汞灯中较强谱线，如237.83、253.65、275.28、296.73、313.16、334.15、365.02、404.66、435.83、546.07、576.96nm等或用仪器中氘灯486.02、656.10nm进行校正,利用钬玻璃在279.4、287.5、333.7、360.9、418.5、460.0、484.5、536.2、637.5nm处的尖锐吸收峰, 吸光度检定,吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定； 操作：取120干燥至恒重的基准K2CrO7 60mg，用0.005mol/LH2SO4溶解并稀释至1000ml，在规定波长处测定并计算其吸收系数，结果如下：, 杂散光检查,将试剂按规定配制成水溶液，置1cm石英吸收池内，在规定波长处测定透光率，应符合规定。, 对溶剂的要求,测定供试品之前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求； 操作：将溶剂置1cm石英吸收池中，以空气为空白测定其吸光度，要求如下：,截止波长：是指用1cm光径的吸收池装溶剂，用空气为参比，改变照射波长，当吸收度A1时，此时的波长称为该溶剂的截止波长，也称极限波长。, 测定方法,对照品比较法 吸收系数法 计算分光光度法 比色法,吸收度：供试品溶液的A值应在0.30.7； 常用方法,对照品比较法,分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液的中所含被测药物的量应为供试品溶液中被测成分规定量的10010%，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长下测定吸光度。按下式计算结果：,吸收系数法,按各品种项下方法配制供试品溶液，在规定波长处测定其吸光度，在意该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。, 计算分光光度法（不宜做含量测定） 比色法（显色使最大吸收波长移至可见光区）,特点： 灵敏度高，可达10-1210-10g/ml 要求低浓度下测定 须做空白测定 荧光弱的药物可衍生化后测定,(二)荧光分析法,浓度与荧光强度的线性范围较窄，故（Rx-Rxb)/（Rr-Rrb)应在0.52之间为宜，如有超过，应调节溶液浓度后再测。,三、色谱分析法,2.分类,按分离原理：吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、分子排阻色谱法等； 按分离方式：纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等,高灵敏度：可达10-1510-12g/ml； 高专属性：检测信号具有较高专属性，实现选择性检测； 高效能与高速度：在较短时间内对多组分进行定量分析。,1.特点,1.对仪器一般要求,色谱柱：反相色谱，正相色谱 检测器：紫外，蒸发光散射检测器，质谱等 流动相,2.系统性试验,色谱柱的理论板数： 分离度： 系统重复性：RSD(2%以内） 拖尾因子：,(一)高效液相色谱法,1.内标法,As：内标物质峰面积或者峰高 AR: 对照品的峰面积或者峰高 Cs: 内标物质浓度 CR：对照品浓度,As：内标物质峰面积或者峰高 Ax：供试品的峰面积或者峰高 Cs：内标物质浓度 f：校正因子,可避免因样品前处理及进样体积误差对结果的影响,示例一 炔诺酮滴丸的含量测定,2. 外标法,外标法简便，但要求进样量准确及操作条件稳定； 采用定量环或自动进样器进样较好；,（二）气相色谱法,1.对GC仪器一般要求,载气：氮气。 色谱柱：填充柱或毛细管柱。 检测器：一般用FID。 进样：直接进样，顶空进样。,2.系统性试验 参照HPLC规定。,应用示例： Ch.P(2015)收载的月桂卓酮、维生素E及其片剂、注射剂、甲酚皂溶液等均采用GC法中的内标法加校正因子测定含量。,3.测定方法,内标法：加校正因子测定主成分含量； 外标法：标准曲线法，外标一点法 标准溶液加入法,内标法（手动进样）：,外标法（自动进样可采用）：,标准溶液加入法（顶空进样）：,第二节 分析样品的制备,分析目的与样品制备,样品制备常用方法,(一)直接测定法,葡萄糖酸钙 EDTA配位滴定 葡萄酸锑钠 间接碘量法,适用范围：金属原子不直接于碳原子相连或某些C-M键结合不牢固的有机金属药物。,一、不经有机破坏的前处理方法,1、酸水解法,适用范围：常用于水难溶的含金属的有机物。与适当的无机酸共热，可将不溶性金属盐类水解置换为可溶性盐。,EDTA配位滴定,(二)水解法,2、碱水解法,银量法 返滴定,适用范围：含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物。,(三)还原法,适用范围：碘原子直接与芳环连接的含碘有机化合物。,碘他拉酸,二、经有机破坏的分析方法,1.适用范围： 含氮有机药物前处理； 生物制品分析中用于氮（包括蛋白质）、磷、硫柳汞及氯化钠测定的前处理； 生物制品中金属元素测定时生物基质的去除。,(一)湿法破坏,分解剂/消化剂,辅助分解剂,凯氏定氮法,测定含有氨基和酰胺结构的药物,2.分类,硫酸+硫酸盐有机破坏,3.凯氏定氮法原理,将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被“消化”成CO2和H2O，有机结合的氮转化为无机氮，与过量的硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，经碱化后释放出氨气，随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。,常量法含氮量 2530mg 半微量法含氮量 1.02.0mg,凯氏定氮法（CHP收载）,3.凯氏定氮法原理,消解 蒸馏与吸收 测定,消解 硅玻璃或硼玻璃硬质茄形烧瓶（凯氏烧瓶）； 30-50ml（半微量法）；500ml（常量法）；,H2SO4：氧化剂、炭化剂和固氨 a. 硫酸盐，提高消解液沸点 K2SO4、Na2SO4 b. 催化剂：硫酸铜 c. 辅助氧化剂：HClO4或H2O2（30）,蒸馏与吸收,半微量氮测定蒸馏装置图,滴定,(二)干法破坏,用于含卤素、硫、磷有等有机药物定量分析的前处理； 分类：高温炽灼法、氧瓶燃烧法。,1.高温炽灼法,含待测元素的有机物经高温灼烧灰化，使待测元素转化为无机元素或可溶性无机盐的方法。 用于含卤素、含磷药物的检查。 常加无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。,2.氧瓶燃烧法,系指将含有待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭燃烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分解为CO2和H2O，待测元素根据电负性的不同转化为不同价态的氧化物（或无氧酸），被吸收于适当的吸收液中（多以酸根离子形式存在），再根据其性质和存在方式选择方法进行分析。,氧瓶燃烧法是快速分解有机结构的最简单方法。它不需要复杂的设备，在极短的时间内即可使有机结合的待测元素定量转化无机形式。 各国药典收载采用。 适合于含卤素，硫，磷等元素的有机药物分析前处理。,燃烧时待测物转化成不同价态的无机物以供测定,滤纸包装样品,（1）仪器装置,（2）吸收液的选择,吸收液选择要根据待测元素的种类与所选用的 分析方法，选择适当的吸收液可使样品燃烧分 解所生成的不同价态的待测元素定量地被吸收 并转变为单一价态，以满足分析方法的要求。,应用示例：碘苯酯的测定（p188),其他样品制备方法,提取分离法 萃取浓缩法：溶剂萃取法，固相萃取法 化学衍生物法,第三节 药物分析方法的验证,验证目的：证明采用的方法适合相应检测要求； 分析项目：鉴别试验、杂质定量或限度检查、含量测定、溶出度、释放度等 验证指标：准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性 分析项目与验证指标（p169表4-3),一、准确度（accuracy）,指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用回收率（%）表示。,(一)含量测定方法,回收试验,加样回收试验,多用于原料药,多用于制剂,33，至少9个测定结果,（二）数据要求,二、精密度(Precision),系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之接近的程度。,表示：偏差(d)、标准偏差(SD)、 相对标准偏差(RSD),重复性：同一实验室,同一人多次测定的精密度 中间精密度：同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度 重现性：不同实验室，不同人测定的精密度,三、专属性(Specificity),指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。,目视法 信噪比法 S/N=3 标准偏差法,四、检测限(Limit of Detection, LOD),药物能被检出的最低浓度,五、定量限(Limit of Quantitation, LOQ),药物能被定量测定的最低浓度，检测结果应有一定 精密度和准确度。,信噪比法 S/N=10,涉及定量测定的检测项目都需要对范围进行验证。,六、线性 (Linearity),待测结果(响应值)与试样中被测物的浓度或量直接成正比关系的程度，是定量测定的基础。 Y=a+bx （r=0.9999),七、范围(Range),能达到一定精密度，准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。,变动因素：被测溶液的稳定性等。 液相色谱：流动相的组成和pH，商品柱的品牌，柱温等,八、耐用性(Robustness),测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。耐用性表明测定结果的偏差在可接受范围内，测定条件的最大允许变动范围。,各种含量测定方法对效能指标的要求,1.容量分析法 用原料药精制品(含量99.5 %)或对照品考察方法精密度，RSD0.2%；回收率一般99.7100.3%之间。 2.UV法 用适当浓度的精制品进行测定，其RSD1%。制剂的测定，回收率一般应在98102之间。 3.HPLC法 要求RSD2，回收率98102%之间。,课堂练习,1三氯叔丁醇采用银量法测定含量，其样品前处理方法为（ ） A. 碱性条件下水解 B. 碱性条件下还原 C. 酸性条件下还原 D. 酸性条件下水解 E. 以上都不是,2测定碘与苯相连的含卤素有机药物（如碘苯酯）的含量测定时，通常选用方法是（ ） 直接回流后测定法 B. 直接溶解后测定法 C. 氧瓶燃烧后测定法 D. 碱性还原后测定法 E. 原子吸收分光光度法,3回收率属于药物分析方法验证指标中的（ ） 精密度 B. 准确度 C. 检测限 D. 定量限 E. 线性,4中国药典规定紫外分光光度法测定中，溶液的吸收度应控制在（ ） 0.002.00 B. 0.3 1.0 C. 0.2 0.8 D. 0.11.0 E. 0.30.7,5检测限与定量限的区别在于（ ） A. 定量限的最低测得浓度应符合精密度要求 B. 定量限的最低测得量应符合准确度要求 C. 检测限是以信噪比（2：1）来确定最低水平，而定量限是以信噪比（3：1）来确定最低水平 D. 定量限的最