免疫基础.ppt

免疫与免疫分析 Immunity and Immunoassay,welcome to immunological course,产品部,免疫的概念,免疫（immunity）是机体对“自己”和“非己”抗原的识别、应答和产生生物学效应的过程。 正常情况下是维持机体内环境稳定的生理性防御功能。,免疫的类型,非特异性免疫 （先天性免疫）,来源：是人在出生以后才产生的。 特点：只能对某一特定的病原体或异物起防御作用，对其它的病原体无效。（专一性）,特异性免疫 （获得性免疫）,来源：人类在长期进化的过程中逐渐建立起来的一种天然防御功能。 特点：是先天遗传的，不针对哪一种病原体，对多种病原体都有防御作用。（非专一性）,免疫系统的组成,骨髓、胸腺,免疫组织及器官,中枢免疫器官： 骨髓，胸腺 外周免疫器官： 淋巴结，脾脏， 黏膜伴随的淋巴组织,骨 髓（bone marrow),造血器官 各种免疫细胞的发源地 人类和哺乳动物B细胞发 育、分化、成熟的场所 免疫应答发生的场所,胸腺（thymus),位于前纵隔、胸骨后、心脏的上方 青春期时最大，随年龄增长而逐渐萎缩,免疫细胞,免疫细胞分为：T细胞，B细胞，NK细胞等。,外周免疫器官（peripheral immune organ),也称为二级免疫器官 是成熟T细胞、B细胞和其它免疫细胞定居和增殖的场所 发生免疫应答的场所 包括淋巴结、脾脏、粘膜相关淋巴组织和皮肤相关淋巴组织,淋巴结（lymph nodes),结构皮质 和髓质,脾脏（spleen),结构 人体最大的 免疫器官 白髓和红髓,人体的免疫系统会与自身成分发生免疫反应吗？为什么？,人体的免疫系统一般不会与自身成分发生免疫反应。但当自身细胞因某些特殊情况（如外伤、癌变等）而发生改变后，免疫系统就会与这些细胞发生免疫反应。,免疫是一把”双刃剑”,免疫功能：免疫防御 免疫自稳 免疫监视,抗 原 Antigen (Ag),抗原：是一类能刺激机体的免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应的免疫应答产物在体内或体外发生特异性结合的物质。,抗 体 Antibody (Ab),抗体： 机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。 具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白统称为免疫球蛋白(Ig)。所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都是抗体。,抗体,Derived from different B Lymphocytes cell lines,多克隆抗体,单克隆抗体,Derived from a single B cell clone,Batch to Batch variation affecting Ab reactivity & titre,mAb offer Reproducible, Predictable & Potentially inexhaustible supply of Ab with exquisite specificity,Enable the development of secure immunoassay systems.,NOT Powerful tools for clinical diagnostic tests,单克隆抗体（McAb）制备,HYBRIDOMA TECHNOLOGY,单克隆抗体的发展,1. TRANSGENIC DNA SPLICING / GENE KNOCK OUT,2. LIBRARIES a.BACTERIOPHAGE b. mRNA c. Cell Surface,单克隆抗体的应用,诊断应用 Biosensors & Microarrays 治疗应用 Transplant rejection Muronomab-CD3 Cardiovascular disease Abciximab Cancer Rituximab Infectious Diseases Palivizumab Inflammatory disease Infliximab 科研应用 Purification of drugs, Imaging the target 未来应用 Fight against Bioterrorism,抗原抗体反应特点及影响因素,特点：特异性，可逆性，比例性； 影响因素：温度，PH值，电解质。,免疫系统,免疫器官,免疫细胞,免疫分子,免疫功能,免疫应答,固有免疫,适应性免疫,体液免疫,细胞免疫,抗原,超敏反应,免疫学应用,免疫分析 Immunoassay,概念：利用抗原和抗体特异性结合反应的特点来检测标本中微量物质的方法。 特点：由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质，且灵敏度高，准确度好。,免疫自动化仪器分析,基本结构示意图,主机系统,样本处理 系统,发射光源 系统,信号检测 系统,自动稀释 自动进样 自动清洗,计算机系统,信号处理 数字转换,信号储存 分析报告,免疫分析类型,放射免疫分析（RIA） 酶联免疫分析（ELISA） 化学发光免疫分析（CLIA） 荧光免疫分析（FIA） ,化学发光自动免疫分析,化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。 化学发光免疫分析类型： 1.直接化学发光 2.酶促化学发光或持久发光,1.直接化学发光,A.吖啶酯发光 原理：纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物，在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下，快速发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度与待测抗原浓度成函数关系。 特点：发光过程在5秒内完成，激发发光程序简单，测试速度快，但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易水解，影响试剂稳定性。吖啶酯在标记能力上有缺陷，不适于标记大分子量的物质，导致缺少这类检测项目。 代表仪器：德国Bayer的ACS180,B.异鲁米诺发光 原理：HRP+鲁米诺-过氧化氢体 发光效应 特点：由于系统中加入了酶催化反应，使发光速度进一步增快，克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、易水解的缺点。 代表仪器：德国BykSangtec公司的LIAISON,C.电化学发光 原理：纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物，在三丙胺的作用下，发生氧化还原反应，发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。 特点：灵敏度高，适用性广，标记稳定，容易控制，但电场作用需特殊的测量池，每次测量完需清洗，易引起交叉污染，影响结果准确性，同时降低分析速度。 代表仪器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS1010和2010。,2.酶促化学发光或持久发光,原理：是将碱性磷酸酶标记在抗体或抗原上，纳米磁珠分离后的碱酶标记的抗原抗体复合物在发光底物AMPPD作用下，持续发出可见光，通过光电倍增管读取光信号。 特点：激发发光时间长，测试速度慢，因为酶易受环境温度的影响，试剂的稳定性不如直接化学发光好。 代表仪器：美国贝克曼公司的ACCESS，,荧光酶免疫分析（FEIA）,荧光：荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光能后，分子呈激发态而极不稳定，当其迅速回到基态时，以电磁辐射形式释放所有光能，这种发光称为荧光。 标记酶：碱性磷酸酶（ALP） 荧光基质：4-甲基伞形酮（4-MUP） 反应：ALP+4-MUP 4-MU 发光 代表仪器：东曹AIA，雅培AXSYM。,测定方法,竞争法： 夹心法：,测定方法,竞争法：其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的发光也愈少。 小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。,竞争法的原理,固相支持物表面,待测物,包被抗体,标记抗原,测定方法,夹心法： 一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物，和抗原依次反应。 这种双位点夹心法具有很高的特异性。,双抗体夹心法（三明治法）原理,固相支持物表面,包被抗体,标记抗体,待测物,免疫分析质量控制 Quality Control of Immunoassay,标准品（standard） 用于定标即标准曲线的绘制，它的一种或几种物理或化学性质已经确定，被用于校正仪器或证实一种测定方法的物质。 质控品（control） 是专门用于质量控制目的的标本或溶液，不能用于校准。,免疫分析标本,避免严重溶血 避免细菌污染 保存时间不宜太久 冰冻标本避免反复冻融,试剂常见问题：,试剂变质 标准品使用不当 样品杯问题 干扰问题 参数问题,免疫分析结果的干扰因素,温度,氧化剂,还原剂,光线,磁场,金属离子,防腐剂,杂质,本底物质,测定结果评价,准确度（accuracy） 准确度是指测得值与真值之间的符合程度。准确度以误差的大小来衡量。 精密度（precision） 精密度是指在相同条件下n次重复测定结果彼此相符合的程度。精密度的大小用偏差表示。,重复性（ repeatability ） 用相同的方法，同一试验材料，在相同的条件下获得的一系列结果之间的一致程度。 相同的条件指同一操作者，同一设备，同一实验室和短暂时间间隔。 再