基于微流控芯片的尿路感染细菌鉴定及抗生素敏感性测试.pdf

第 4 4卷 2 0 1 6年 4月 分析化学 ( F E N X I H U A X U E ) 研究报告 C h i n e s e J o u rna l o f An a l y t i c a l C h e mi s t r y 第4期 6 1 06 1 6 D OI ： 1 0 1 1 8 9 5 j i s s n 0 2 5 3 - 3 8 2 0 1 6 0 0 3 5 基于微流控芯片的尿路感染细菌鉴定及抗生素敏感性测试 齐明月 杜 燕 刘未平 陈 斌 梁广铁 徐邦牢 刘大渔 ( 广州医科大学附属广州市第一人民医院检验医学研究室， 广州 5 1 0 1 8 0 ) 。 ( 广东 省临床分子医学及分子诊断重点实验室 ，广州 5 1 0 1 8 0 ) 摘要发展了一种微流控芯片纸基细菌分析技术 ， 用于多重细菌鉴定与抗生素敏感性测试。制备了阵列培 养池芯片， 以滤纸作为衬底固定显色培养基和抗生素。利用 P V D F疏水薄膜止流阀， 将尿液样品引入芯片并 分隔于不同培养池。借助于培养池阵列的空间分辨力， 实现多重细菌分析。根据特异性显色结果实现细菌鉴 定， 通过实时显色强度分析实现细菌定量， 依据抑制显色反应的最低抗生素浓度确定抗生素敏感性。以 3种 泌尿系统感染常见病原菌( 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌和粪肠球菌) 为模拟测试对象进行分析， 结果表明， 芯 片方法可以在 1 8 h内实现对 3种细菌的同时鉴定及 6种抗生素敏感性测试。对照实验显示， 芯片法与传统 方法细菌鉴定和抗生素敏感性测试结果一致性分别为 9 4 1 和 9 3 9 。本研究建立的微流控芯片细菌分析 方法简便快速， 非常适合于医疗资源匮乏条件下的细菌分析。 关键词 微流控芯片；细菌鉴定； 抗生素敏感性测试 ； 快速检测 1 引 言 尿路感染是非常常见的感染性疾病 l 2 j ， 多由细菌引起 ， 最常见的是大肠埃希菌 ， 其次为粪肠球菌、 铜绿假单胞菌、 葡萄球菌属细菌和肺炎克雷伯菌等 J 。尿路感染可引起局部和全身不适症状， 严重者 可导致肾功能衰竭， 甚至感染性休克， 因而需要及时诊断和治疗。临床治疗尿路感染病例时， 医生需要 了解病原菌的种类、 数量以及对于抗生素的敏感性， 以便进行针对性治疗 4 J 。因此， 临床上的细菌检 测平 台， 需具备多重病原菌快速定性与定量分析以及抗生素敏感性测试的功能 。 传统的尿路感染病原菌鉴定及抗生素敏感性试验( A n t i b i o t i c s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g ， A S T ) 主要采用平 板培养法 ， 但是耗时较长( 一般需 2 3天) I 6 ， 不利于及时诊断和抗 生素选择指导 。近年开发 出了尿 路感染病原菌检测新方法， 如免疫荧光法 、 干化学分析法_ 8 J 、 流式细胞法 、 聚合酶链式反应 ( P C R) n 。 。 、 质谱法 1 及新一代测序技术 等 ， 虽然可 以显著缩短检测时间， 但这些方法大多依赖于大 型或者精密设备， 难以在基层医疗单位推广。因此， 亟需简便、 快速的尿路感染病原菌检测方法。 近年发展起来的微流控芯片细菌分析技术 较之传统方法具有很多优势。首先， 芯片细菌分析 平台小巧便携 ， 操作简便 ， 非常适合于现场快速检测_ 2 0 ； 其次 ， 芯片微分 析平 台有利 于提高测试通量和 降低试样消耗量 l 2 。 ， 便于实现高通量分析 ； 此外 ， 大多数芯片细菌分析方法可以免去预增菌步骤 ， 因而 可以显著缩短分析时间 。因此， 微流控芯片技术为细菌分析提供了一种理想 的解决方案。然而， 目 前报道 的微流控芯片细菌分析大多只针对单一种类细菌检测_ l 。 卫 。 。 ， 无法满足临床上对病原菌 的分析 需求。 本研究组在前期工作 中进行了微流控芯片上多重细菌鉴定 的初步探索。在此基础上 ， 本研究将 多重细菌鉴定与 A S T结合， 为芯片病原分析方法用于临床诊疗奠定基础。在芯片上进行多重细菌分析 与 A S T ， 要求同步完成多重生化反应 ， 因而需要解决包括多重试剂的引入、 多重反应的有效分隔以及多 重检测指标 的判定问题 。针对上述问题 ， 本研究发展了一种微流控芯片纸基细菌分析方法 ， 在芯片培养 池中以滤纸作为衬底组合固定菌种特异性显色培养基和抗生素。滤纸成分为纤维素， 具有疏松多孔结 构， 不仅具有良好的生物相容性， 而且易于固定试剂 。借助于芯片集成P V D F 疏水薄膜止流阀， 引入 2 0 1 6 - 0 1 1 4收稿 ； 2 0 1 6 -0 2 - 0 3接受 本 文系国家 自然科学基 金 ( N o s 8 1 3 7 1 6 4 9，8 1 2 7 1 7 3 0 ， 8 1 5 0 1 8 3 1 ) 、 广东 省 自然 基金 ( N o 2 0 1 4 A 0 3 0 3 1 3 6 7 7 ) 及 广州 市科 技计 划项 目 ( N o 2 0 1 0 U1 一 E 0 0 6 8 1 ) 资助 E ma i l ： b a n g l a o x u 1 6 3 c o rn 第 4期 齐明月等： 基于微流控芯片的尿路感染细菌鉴定及抗生素敏感性测试 6 1 5 表 1 芯片法与传统方法获得的大肠杆菌( + ) 标本 A S T结果比较( n = 7 ) T a b l e 1 C o mp a r i s o n o f E c o l i p o s i t i v e s a mp l e s AS T r e s u l t s o b t a i n e d u s i n g t h e mi c r o c h i p me t h o d a n d c o n v e n t i o n a l me t h o d ( n = 7 ) “ s ” 、 “ I ” 、 “ R ” 对应 M I C解释结果： 敏感、 中介和耐药。表中所列数字为对应不同M I C 解释结果的样本数。 “ S”，“I ”，“ R” i n d i c a t e s MI C i n t e r p r e t a t i o n s ，s u s c e p t i b l e，i n t e r me d i a t e a n d r e s i s t an t ，r e s p e c t i v e l y Nu mb e r s l i s t e d i n t h e t a b l e a r e n u mb e rs o f s a m p l e r e s p o n d e d t o d i ff e r e n t mi n i ma l i n h i b i t i o n c o n c e n t r a t i o n( MI C)i n t e r p r e t a ti o n s 4 结 论 本研究发展了微流控芯片多重细菌鉴定和 A S T方法 ， 具有操作简便 、 耗时短、 低消耗和高通量的优 势， 适合于医疗资源匮乏条件下的细菌分析。后续工作将进一步扩展检测对象范围， 以提高该技术的实 际应用性能。 Re f e r e n c e s 1 H o n r a d o C， D o n g T S e n s o r s( B a s e 1 ) ， 2 0 1 4 ， 1 4 ( 8 ) ：1 3 8 5 1 - 1 3 8 6 2 2 Ma c h K E， Wo n g P K， L i a o J C T r e n d s P h a r m a c o 1 S c i ， 2 0 1 1 ， 3 2 ( 6 ) ： 3 3 0 - 3 3 6 3 G r a h a m J C， G al l o w a y A ， C l i n P a t h o 1 ， 2 0 0 1 ， 5 4 ( 1 2 ) ： 9 1 1 - 9 1 9 4 WA N G Ho n g - R u ， B A O X i a o R o n g ， Y U A N Y i Q u n C h i n e s e J o u r n a l o fN o s o c o m i o l o g y ， 2 0 1 4 ， 2 4 ( 0 8 ) ： 1 8 5 9 1 8 6 1 11 l 2 1 3 1 4 l 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 王宏儒，鲍晓荣， 袁轶群 中华医院感染学杂志， 2 0 1 4， 24( 0 8 ) ：1 8 5 9 1 8 6 1 L u o X， S h e n K，L u o C， J i H， O u y a n g Q， C h e n Y B i o m e d Mi c r o d e v i c e s ， 201 0 ，1 2 ( 3 ) ： 4 9 9 - 5 0 3 Me i s t e r L ，M o r l e y E J ， S c h e e r D，S i n e r t R A c a d E m e r g Me d ， 201 3 ， 2 0 ( 7 ) ： 6 3 1 6 4 5 Ma t o s P i r e s N M， D o n g T S e n s o r s( B ase 1 ) ， 2 0 1 3 ，1 3 ( 1 2 ) ：1 5 8 9 8 - 1 5 9 1 1 D e v i l l 6 W L ，Y z e r m a n s J C， v a n D u i j n N P， B e z e me r P D， v a n d e r Wi n d t D A， B o u t e r L MB MC U r o 1 ， 2 0 0 4， 4： 4 P i e r e t t i B，B r u n a t i P ，P i I l i B，C o l z a n i C，C o n g e d o P ，R o c c h i M，T e r r a mo c c i R ， C l i n Mi c r o b i o 1 ，201 0 ， 4 8 ( 1 1 ) ： 3 9 9 0 - 3 9 9 6 C o mu t P L ， B o i s s e t S ， R o m a n e t J P ， Ma u fi n M， C a r r i e a j o A， B e n i t o Y， V a n d e n e s c h F ， C h i q u e t C S u r v O p h t h a l m o 1 ， 2 0 1 4 ， 5 9 ( 3 ) ： 2 8 6 3 0 3 N a k a n i s h i T R i nsh o B y o r i ， 2 0 1 5， 6 3 ( 4 ) ： 4 6 5 4 7 1 F o u r n i e r P E， D r a n e o u r t M， C o l s o n P ， R o l a i n J M， L a S c o l a B， R a o u h D N a t R e v Mi c r o b i o 1 ， 2 0 1 3 ，l l ( 8 ) ： 5 7 4 - 5 8 5 D o n g T， Z h a o X A n a 1 C h e m ， 201 5， 8 7 ( 4 ) ： 2 4 1 0 - 2 4 1 8 F e n g S，Do n g T，Ya n g ZI EE EEn g Me d Bi o 1 S o c C o ， Pr o c ，2 0 1 4：3 1 1 4 3 1 1 7 L e e W ，Kw o n D，C h o i W ，J u n g G Y，J e o n S S c i R e p ，20 1 5，5：7 7 1 7 He J ， Mu X， G u o Z， H a o H， Z h a n g C， Z h a o Z ， Wa n g Q E u r C l i n Mi c r o b i o 1 I n f e c t D i s ， 201 4 ， 3 3 ( 1 2 ) ： 2 2 2 3 - 22 3 0 K a l a s h n i k o v M， C a m p b e l l J ， L e e J C ，S h a r o n A， S ane r - B u d g e A F V i s E x p ， 201 4 ，( 8 3 ) ： e 5 0 8 2 8 T o k e l 0。 Y i l d i z U H，I n c i F， D u r m u s N G， E k i z O O，T u r k e r B，C e t i n C，R a o S ，S r i d h a r K， N a t a r a j a n N，S h a f i e e H， Da n aA，De mi r c i US c i Re p ，2 0 1 5，5：9 1 5 2 C i r a N J ， Ho J Y，D u e e k M E， We i b e l D B L a b C h p ， 201 2 ，1 2 ( 6 ) ：1 0 5 2 1 0 5 9 F u n e s - H u a c c a M， Wu A， S z e p e s v a r i E， R a j e n d r a n P ， K w a n Wo n g N， R a z g u l i n A， S h e n Y， K a s i r a J ， C a mp b e l l R， D e r d a RL a b C h p ， 201 2 ，1 2 ( 2 1 ) ： 4 2 6 9 4 2 7 8 S u n P ， L i u Y，S h a J ， Z h a n g Z ，T u Q， C h e n P ， Wang J B i o s e n s B i o e l e c t r o n ， 2 0 1 1 ， 2 6 ( 5 ) ： 1 9 9 3 - 1 9 9 9 S a k a m o t o C ，Y a ma g u e h i N， N a s u MA p p 1 E n v i r o n Mi c r o b i o 1 ， 2 0 0 5 ， 7 1 ( 2 ) ：1 l 1 7 - 1 1 2 1 6 l 6 分 析 化 学 第 4 4卷 2 4 2 5 WEN Xi a o Xi a ，XU B a n g L a o， W A NG We i Xi n，L I A NG Gu a n g T i e ，C HE N Bi n，YA NG Yi n Me i ， L I U Da Yu C h i n e s e J A n a 1 C h e m ， 2 0 1 4 ， 4 2 ( 6 ) ： 7 9 1 7 9 8 文小霞， 徐邦牢，王伟鑫， 梁广铁 ， 陈 斌，杨银梅， 刘大渔分析化学， 2 0 1 4 ， 4 2 ( 6 ) ： 7 9 1 7 9 8 C a t e D M，A d k i n s J A， M e t t a k o o n p i t a k J ，H e n r y C S A n a 1 C h e m ， 2 0 1 5 ， 8 7 ( 1 ) ：1 9 4 1 S t e d t f e l d R D， T o u d o u s s e D M， S e y r i g G，S t e d t f e l d T M， K r o n l e i n M， P r i c e S ， A h m a d F ， G u l a r i E， T i e d j e J M， H a s h s 。 h a m S A L a b Ch e ， 2 0 1 2， 1 2 ( 8 ) ： 1 4 5 4 1 4 6 2 2 6 J o k e r s t J C， A d k i n s J A， B i s h a B ，Me n t e l e M M， G o o d fi d g e L D，H e n r y C S A n a 1 C h e m ， 2 0 1 2 ， 8 4 ( 6 ) ： 2 9 0 0 _ 2 9 0 7 2 7 C l i n i c a l a n d L a b o r a t o r y S t a n d a r d s I n s t i t u t e ，P e Tf o r m a n c e S t a n d a r d s f o r A n t i m i c r o b i a l S u s c e p t i b i l i t y T e s t i n g T w e n t y T h i r d I n f o r ma t i o n a l S u p p l e me n t ww c l s i o r g 2 0 1 3 Ur o pa t ho g e n i c Ba c t e r i a I d e n t i fic a t i o n a nd An t i b i o t i c S us c e pt i b i l i t y Te s t i n g o n a M i c r o flu i d i c Chi p Q I Mi n g Y u e ， D U Y a n ， L I U We i P i n g ， C H E N B i n ，L I A N G G u a n g - T i e 。 ， XU Ba n g La o l _ L I U Da - Yu ， ( D e p a r t m e n t o fLab o r a t o r yMe d i c i ne，G u a n g z h o u F i r s t P e o p l e H o s p i t a l ， A f fi l i a t e d H o s p i t a l o f G u a n g z h o u Me d i c a l U n i v e r s i t y ， G nan g z h o u 5 1 0 1 8 0 ， C h i na ) f C l i n i c a l Mo l e c u l a r Me d i c i ne a n d Mo l e c u l a r D i a g n o s i s K e y Lab o r a t o r y of G nan g d o n g P r o v i n c e ， G u a n g z h o u 5 1 0 1 8 0 ， C h i na ) Ab s t r a c t A mi c r o fl u i d i c c h i p a s s a y wa s d e s c ri b e d f o r b a c t e ri a i d e n t i f i c a t i o n a n d a n t i b i o t i c s u s c e p t i b i l i t y t e s t ( A S T) F i l t e r p a p e r p a d s w e r e e m b e d d e d i n a r r a y e d m i c r o c h a m b e r s ，w i t h i m m o b i l i z e d a n t i b i o t i c s a n d c h r o mo g e n i c m e d i u mB y t a k i n g a d v a n t a g e o f t h e p o l y v i n y l i d e n e fl u o ri d e( P V D F )me mb r a n e b a s e d v a l v e s ， ur i n e s a mpl e i n t r o d uc e d wa s d i s t ribu t e d i n i n di v i d u a l c h a mb e r s wi t h o u t c r o s s c o n t a mi n a t i o nTh e s i mu l t a n e o u s a n aly s i s o f mu l t i p l e b a c t e ri a wa s a c h i e v e d b y u s i n g t h e c u l t u r e c h a mb e r a r r a y d e s i g n T h e i d e n t i f i c a t i o n o f a b a c t e r i u m w a s b a s e d o n i t s s p e c i fi c c o l o r i me t r i c r e s u l t T h e d e n s i t y o f a b a c t e ri u m w a s d e t e r mi n e d b y r e a l t i me mo n i t o rin g c o l o r i n t e n s i t y i n t h e c h a mb e r a n d i t s s u s c e p t i b i l i t y t o a n a n t i b i o t i c wa s d e t e rm i n e d r e l y i n g o n t h e l o we s t a n t i b i o t i c c o n c e n t r a t i o n t h a t i n h i b i t e d t h e e o l o r i me t ric r e a c t i o n A s e t o f t hr e e c o mmo n u r o p a t h o g e n i c b a c t e r i a we r e s e l e c t e d a s mo d e l s t o t e s t t h e mi c r o fl u i d i c a p p r o a c h Ou r r e s u l t s s h o we d t h a t t h e d e v e l o p e d mi c r o fl u i d i c a s s a y w a s a b l e t o c o mp l e t e b a c t e r i a i d e n t i f i c a t i o n a n d t h e s i x a n t i b i o t i c AS T i n 1 8 h I n c 0 mp a ri s o n wi t h t h e c o n v e n t i