研究海马神经元谷氨酸损伤

1 / 8 研究海马神经元谷氨酸损伤 摘要： 目的：本研究通过观察体外培养的大鼠胚胎海马神经元在谷氨酸损伤后，细胞活力变化及细胞损伤的方式，初步探讨谷氨酸对神经元的损伤机制。方法：通过 MTT，观察不同浓度 (62.5 M 、 125 M 、 250 M 、 500 M) 的谷氨酸损伤后不同时间（ 6 h、 12 h、 18 h、 24 h)海马神经元活力的变化。经相差显微镜观察谷氨酸对海马神经元胞体及突起的影响。通过 TUNEL、 Hoechst 染色比较正常培养组和损伤组的凋亡率，分析谷氨酸对海马神经元的损伤作用。结果：MTT 结果显示 ，谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性，在所观察的剂量范围内，随着谷氨酸浓度的增加，作用逐步增强，至 500 M 达峰值，随着损伤后孵育时间的延长，海马神经元活力逐渐下降。 TUNEL 和 Hoechst 染色结果也显示， 125 M 谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性，主要引起海马神经元的凋亡。结论：谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性 ,且这种作用呈现剂量相关性。中等剂量（ 125 M ）谷氨酸损伤主要引起海马神经元的凋亡。 关键词： 谷氨酸 海马神经元 TUNEL 脑卒中以高死亡率和高 致残率严重威胁着人类的健康和社会劳动能力。在脑缺血过程中，各种神经递质发2 / 8 生一系列变化，如脑内氨基酸类神经递质大量增加，特别是缺血中心区域。兴奋性氨基酸如谷氨酸 (glutamate, Glu)和天冬氨酸 (aspartic, Asp )的过量释放是缺血性脑损伤的重要病理机制。据报道谷氨酸受体拮抗剂对脑缺血损伤有很好的保护作用 1。同样，抑制性氨基酸对脑缺血有保护作用，可拮抗兴奋性氨基酸的毒性 2。很多学者认为，兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸的平衡失调是缺血性脑损伤的原因之一 3。 海马是边缘系统的重要组 成部分，在学习、记忆、情绪反应及植物性神经功能等方面有重要作用，是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一，在结构上具有高度序化板层结构和神经元相对独立分布等特点。海马是神经元高度集中的部位，锥体神经元是海马区的主要成分，体外培养的海马神经元，对许多致病因素和化学损害较为敏感，因此在研究神经系统疾病的病理机制及治疗方法中均以海马作为病理模型，如缺血 /缺氧、癫痫、衰老和兴奋性毒素等均可引海马的特异性损害。在脑缺血模型中，海马神经元最早出现较严重的损害，并且海马缺血性损害和兴奋性神经毒有关，这可能和海马神经元含有高 密度的谷氨酸能受体有关 4。 本研究采用胎鼠海马神经元的无血清体外培养，获得高纯度的神经元。通过高分子量神经丝蛋白（ neurofilament high molecular weight， NF-H）和神经胶质酸性蛋白（ glial 3 / 8 fibrillary acidic protein, GFAP）染色，鉴定海马神经元的纯度；通过相差显微镜观察谷氨酸对海马神经元胞体及突起的影响；通过 MTT 检测在不同浓度谷氨酸损伤后，不同时间海马神经元存活率；同时通过 TUNEL（ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）， Hoe-chst 比较损伤组和正常培养组凋亡率，探讨谷氨酸对海马神经元的损伤机制，为筛选抗谷氨酸兴奋毒性药物提供实验模型。 1 材料和方法 1.1 材料 动 物 ： 采 用 健 康 孕 18 19 天Sprague-Dawley (SD)大鼠，由南通大学实验动物中心提供；抗体：抗 GFAP、 NF-H 抗体购自 Sigma 公司；其他试剂和材料： Neuronbasal 培养基、 B27、 DMEM 培养基购自 Gibco 公司，胰蛋白酶、 Hoechst33342 购自 Sigma 公司， TUNEL 试剂盒购自 Promega 公司。 1.2 方法 1.2.1 海马神经元的原代培养 5 孕 18 19 天 SD 大鼠复合麻醉剂麻醉，无菌条件下取胎鼠脑，置于解剖液中，解剖显微镜下仔细去除脑膜，取出双侧海马，于 0.125%的胰酶 37 消化 10 min，用完全培养基（ 90%DMEM+10%FBS）终止消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度大约为 106/ml，接4 / 8 种于事先用多聚赖氨酸包被的 24 孔 /96 孔细胞培养板。 4 h后换成无血清的神经元培养基（ 98 neurobasal medium2 B27）置 5%CO2、饱和湿度、 37 培养箱培养 7 8 天。 3天半换液。 1.2.2 免疫细胞化学 海马神经元按上法培养 7 天后，吸去培养液，用 PBS 洗涤一次，加入 4%多聚甲醛 500 l ，室温下固定 30 min，去除固定液，用 PBS 室温下洗涤 10 min3 次。用含 10%羊血清、 0.3% Triton X-100 的 PBS 液在 37 条件下封闭 60 min，吸去封闭液。滴加一抗（ rabbit anti-NF-H polyclonal antibody， 1200 ， rabbit anti-GFAP polyclonal antibody， 1300 ）， 4 放置过夜， PBS 洗。滴加二抗（ FITC goat anti-rabbit IgG， 1200 ），室温、避光放置 2 h， PBS 洗。以 Hoechst（ 5 g/ml ）标记细胞核，PBS 洗。实验中设不加一抗的空白对照组，除以 PBS 代替rabbit anti-NF-H polyclonal antibody，其余步骤同上。在激光共聚焦显微镜下观察免疫荧光细胞化学检测结果。随机计数 500 个细胞，计算 NF-H 阳性细胞百分率。 Hoechst 33342染色检测细胞凋亡时，用 4%多聚甲醛固定细胞 30 min，PBS 洗细胞两遍，各组加入 Hoechst 33342 染液（ 5 g/ml ）室温染色 10 min，在倒置荧光显微镜下观察各组凋亡细胞数。每组设 3 个复孔，每孔随机取五个视野，实验重复 3 次。 1.2.3 海马神经元谷氨酸损伤处理 6 海马神经元5 / 8 按上法培养 7 8 天后，吸出原来的培养基，用 Lockes 液洗涤细胞 3 次，每次 5 min。 以 Lockes 液配制 125 M 谷氨酸，其中添加 1 M 甘氨酸。正常对照组（ Lockes 不含有 125 M 谷氨酸）和实验组均作用 15 min，撤除，再用Lockes 液洗涤细胞 3 次，每次 5 min。重新加入原来的培养基，继续培养。 1.2.4 MTT 检测 海马神经元以 1106 个 /ml 接种细胞于 96 孔培养板中，每孔 0.1 ml。 5%CO2 培养箱中培养 78 天。加入谷氨酸损伤，分别于损伤后 12 h、 18 h、 24 h。每孔加 10 l MTT （ 5 mg/ml）放入 37 ， 5% CO2 培养箱中培养 4 h。然后每孔加入 100 l 20% SDS ，培养箱中培养 20h。酶标仪上 570 nm(参考 波长 490 nm)处测定 OD 值。每个实验组设 8 个复孔，实验重复 3 次。 1.2.5 TUNEL 法检测细胞凋亡 7 海马神经元在 24 孔板上按上法培养 7 8 天。实验分 2 个实验组进行，损伤组用 125 M 谷氨酸按上述损伤方法处理。谷氨酸处理后 18 h 吸去培养液，用 4%多聚甲醛固定细胞 30 min，室温下用新鲜 PBS洗细胞两遍。再用 0.2%Triton X-100 通透细胞 5 min。每孔加入 100 l Equilibrate Buffer ，室温下作用 5 10 min。然后每孔加入 45 l Equilibr ate Buffer， 1 l rTDT ， 5 l dNTP ， 1 l rTDT 酶，避光， 37 孵育 60 min。加入6 / 8 2SSC 作用 15 分钟，终止反应。并且在室温下，用新鲜 PBS 。最后加入 0.5 g/ml PI 染液，染色 10 min。用纯水洗。采用共聚焦显微镜观察，计数。每组设 3 个复孔，每孔随机取5 个视野，实验重复 3 次。 2 结 果 2.1 海马神经元的培养 倒置显微镜下观察，海马神经元分离培养不久后即贴壁，胞体表面光洁，呈锥形或椭圆形，有均匀一致的反光，且折光性明显（图 1A， B）。 2.2 免疫荧光细胞化学染色 用无血清的神经元培养基（ 98 neurobasal medium 2 B27）培养 7 8 天，免疫荧光细胞化学染色可以看到 NF-H 阳性细胞占绝大多数，GFAP 阳性占 2.17%，培养的海马神经元纯度达 95.4%以上。可以用于后续实验。结果见图 2。 2.3 不同浓度谷氨酸对海马神经元的兴奋性毒性 海马神经元培养 7 8 天后，用不同浓度的谷氨酸损伤神经元，24 h 后采用 MTT 法观察各组细胞活力，结果显示：与正常对照组相比，随着谷氨酸浓度的增加，海马神经元活力显著下降，呈剂量依赖性 (图 3A)（ P 均 2 Snider BJ, Du C, Wei L, et al. Cycloheximide reduces infarct volume when administered up to 6 h after mild focal ischemia in ratsJ. Brain Res, 2001, 917(2):147-157. 3 Wang X, Shimizu-Sasamata M, Moskowitz MA, et al. 7 / 8 Profiles of glutamate and GABA efflux in core versus peripheral zones of focal cerebral ischemia in miceJ. Neurosci Lett, 2001, 313(3):121-124. 4 徐慧君，主编 . 神经生物学 M. 第 1 版 . 苏州：苏州大学出版社， XX： 143-157. 5 Jiang H, Guo W, Liang X, et al. Both the establishment and the maintenance of neuronal polarity require active mechanisms: critical roles of GSK-3beta and its upstream regulators J. Cell, XX, 120(1):123-135. 6 Almeida RD, Manadas BJ, Melo CV, et al. Neuroprotection by BDNF against glutamate-induced apoptotic cell death is mediated by ERK and PI3-kinase pathwaysJ. Cell Death Differ, XX, 12(10):1329-1343. 7 Peng YP, Qiu YH, Lu JH, et al. Interleukin-6 protects cultured cerebella granule neurons against glutamate-induced neurotoxicityJ. Neurosci Lett, XX, 374(3):192-196. 8 Lipton SA, Possible role for memantine in protecting retinal ganglion cells from glaucomatous damageJ. Surv Ophthal