升温对‘水院1号’和大连养殖刺参非特异性免疫影响的研究.doc

升温对水院1号和大连养殖刺参非特异性免疫影响的研究 曹学顺，丁君，白雪秋，常亚青 （大连海洋大学/农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023） 摘要：为获知升温对水院1号和大连养殖刺参相关免疫酶活性及MDA含量的影响，实验设置不同温度梯度(16、20、24、28)，分别对水院1号和大连养殖刺参体腔液中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、溶菌酶(LSZ)的活性及丙二醛(MDA)含量进行测定。结果显示：（1）在升温过程中，水院1号和大连养殖刺参体腔液中CAT、SOD、POD活性均呈先升高后降低的趋势。CAT活性范围分别为77.160151.76、24.61751.740U/mL；SOD活性范围分别为0.0700.154、0.0560.100U/mL；POD活性范围分别为2.3603.470、1.4072.407U/mL。水院1号和大连养殖刺参体腔液中LSZ活性均呈先升高再降低又升高的趋势，活性范围分别为9.74130.898、8.55428.006U/mL。水院1号刺参体腔液中MDA含量随着水温升高逐渐降低，其含量范围为42.33146.563nmol/mL，大连养殖群体刺参体腔液中MDA含量呈先降低后升高的趋势，变化范围为46.07947.329nmol/mL。（2）在升温过程中，水院1号刺参体腔液中CAT、SOD、POD和LSZ活性变化较大连养殖群体刺参的变化差异大，其中CAT和POD活性变化差异显著(P0.05)。在28水温下，水院1号刺参MDA含量显著小于大连养殖群体刺参MDA含量(P0.05)。研究表明，刺参能够对水温升高及时地做出生理免疫反应，通过调节非特异性免疫酶活性来清除机体内多余的活性氧，保护机体免受环境改变造成的损害。研究发现，水院1号刺参较大连养殖群体刺参反应更为灵敏，对高温的适应性更强。本研究为探讨刺参对高温适应性和对水院1号品种推广具有一定意义。 关键词：刺参；升温；免疫酶；丙二醛 ：S968.9文献标志码：A论文编号：xx-0269 TheStudyofRisingTemperatureonSerumNon-specificImmuneinShuiyuanNO.1Sea CucumberPopulationsandtheCulturedSeaCucumberPopulations CaoXueshun,DingJun,BaiXueqiu,ChangYaqing (DalianOceanUniversity,KeyLaboratoryofMariculture&StockEnhancementinNorthChinasSea,MinistryofAgriculture,CollegeofFisheriesandLifeScience,Dalian116023,Liaoning,China) Abstract:Theexperimentstudiedthechangeofnon-specificimmuneinrisingtemperature(16,20,24,28).TheactivitiesofCAT,SOD,POD,LSZandthecontentofMDAinShuiyuanNO.1seacucumberandDalianculturedseawereanalyzed.Theresultshowthat:(1)inrisingtemperature,thechangeofCAT,SOD,PODweretrendtoincreasedandtodecreasedinShuiyuanNO.1seacucumberandDalianculturedseacucumber,theactivitiesofCATwere77.160-151.76U/mLand24.617-51.740U/mL,theactivitiesofSODwere0.070-0.154U/mLand0.0560.100U/mL,theactivitiesofPODwere2.360-3.470U/mLand1.407-2.407U/mL.ThechangeofLSZwasfirstincreasedandthendecreasedandincreased,theactivitiesofLSZwere:9.741-30.898U/mLand8.554-28.006U/mL.ThecontentofMDAinShuiyuanNO.1seacucumberwastrendtoincreased,thechangeofMDAwas42.331-46.563nmol/mL.ThecontentofMDAinDalianculturedseacucumberwastrendtodecreasedandtoincreased,thechangewas46.079-47.329nmol/mL.(2)Inrisingtemperature,thechangeofCAT,SOD,POD,LSZinShuiyuanNO.1seacucumberweremoresensitivethaninDalianculturedseacucumber,andthechangeofCATandPODhadsignificantdifference(P0.05).In28,thecontentofMDAinShuiyuanNO.1seacucumberwassignificantlylessthaninDalianculturedseacucumber(P0.05).ThestudyindicatedthatApostichopusjaponicus(Selenka)couldmakecertainphysiologicalimmuneresponsetoelevatedtemperatures,toridthebodyofexcessfreeradicalsbyregulatingtheimmunedefenseenzymeactivity,toprotectbodyfromdamagecausedbyenvironmentalchange.ShuiyuanNO.1seacucumberwasmoresensitiveandhadhightadaptationinhightemperaturethanDalianculturedseacucumber.TheexperimentwasimportanttostudythehightemperatureadaptationofApostichopusjaponicus(Selenka)andtopromoteShuiyuanNO.1seacucumber. Keywords:Apostichopusjaponicus(Selenka);Heating;Immune;Malondiadehyde 0引言 水温作为最重要的生态因子之一，对刺参生长和生理生态特征起到非常重要的作用1。刺参所能适应的水温范围为030，最适生长温度为15182。超出适宜水温可造成刺参体内自由基代谢紊乱，自由基在体内大量累积，继而影响刺参体内免疫系统的防御能力，损害刺参健康。温度过高或过低都会抑制刺参生长，增加发病率1。另外在夏季水温升高时，刺参为适应高温环境会进入夏眠，停止摄食，体重减轻，且刺参体腔液非特异性免疫酶活性发生明显变化3。因此，研究升温对刺参体腔液中免疫酶活性的影响对于探讨其对高温环境的适应机制和健康养殖具有一定借鉴意义。 刺参对水温的适应具有特殊性和复杂性，与刺参年龄及规格有关，规格越大，其适宜生长温度越低1。目前温度对水生动物的生理影响的研究比较广泛。WangF等3-4研究了夏眠期间刺参体腔液内免疫酶活性变化，Ji等5研究了升温与夏眠过程中刺参的免疫生理反应，刘伟等6初步探讨了温度骤降和缓降对刺参体腔液中主要免疫酶的影响，Dong等7研究了在不同幅度的日变温处理下，刺参体内CAT和SOD活性变化，An等8研究了高温下刺参食物吸收率和食物转化率的变化，Dong等探讨了高温驯化下刺参的热耐受性9及对其它生态因子的耐受能力7。另外也有学者研究了褐牙鲆10、中华绒螯蟹11、青蛤12-13、虾夷扇贝14、贻贝15等水生动物体内非特异性免疫酶活性与温度之间的关系。 xx年大连海洋大学培育出的刺参新品种水院1号是国家审定通过的第1个刺参养殖新品种，具有苗种成活率高、生长快、肉刺多等特点6,16。本研究以水院1号刺参和大连养殖群体刺参为材料，研究在水温缓升条件下，两群体刺参体腔液中非特异性免疫酶活性和MDA含量的变化，为探讨刺参对高温的适应机制和刺参健康养殖具有参考价值，同时也为研究水院1号对高温条件的适应性及对其的推广有一定意义。 1材料与方法 1.1实验材料 实验选用大连海洋大学农业部北方海水增养殖 重点实验室培育的水院1号刺参(158.63g32.46g)和xx年购于大连某养殖场的刺参(148.42g25.21g)。实验开始前取水院1号刺参和大连养殖群体刺参各30头，分别暂养于控温水槽中2周，养殖温度为16，正常养殖管理。 1.2升温模式及取样 利用控温水槽将养殖刺参水温从16开始升温，每天水温升高1，每个温度点维持1天，实验持续16天，分别在16、20、24、28时取水院1号刺参和大连养殖群体刺参各5头，抽取刺参体腔液，放入-80冰箱保存，留作待测样本。 1.3刺参体腔液中免疫酶及丙二醛含量测定 每个待测样品设置3个平行，实验采用CAT、SOD、POD、LSZ的酶活性测试盒及MDA含量测试盒（南京建成生物研究所）检测刺参体腔液中相应的免疫酶活性及MDA含量，利用Epoch酶标仪（美国Biotek公司）测定酶活性及MDA含量。 1.4数据处理 实验所得数据利用Excel软件进行初步，后用SPSS17.0软件中单因素方差分析处理各温度点下刺参体腔液中CAT、SOD、POD、LSZ的活性及MDA含量的数据，利用Duncan多重比较分析同群体不同温度点间和不同群体间刺参各非特异性免疫酶活性和MDA含量的差异显著性，显著性水平设置为P0.05。 2结果与分析 2.1升温对水院1号和大连养殖刺参体腔液中CAT活性的影响 水院1号和大连养殖刺参体腔液中CAT活性变化结果见图1。随着水温升高，水院1号和大连养殖刺参体腔液中CAT活性均呈先升高后降低的趋势。随着水温升高，大连养殖群体刺参CAT活性20时达到最高，为68.05U/mL；28时CAT活性降到最低，为17.84U/mL(P0.05)。“水院1号”刺参CAT活性变化趋势与大连养殖群体刺参CAT活性变化一致，在24时CAT活性达到最高，为200.99U/mL；在28时CAT活性显著降低，达到77.160U/mL(P0.05)。水院1号刺参体腔液中CAT活性在各温度点均大于大连养殖群体刺参CAT活性，在24和28水温下，水院1号刺参CAT活性显著高于大连养殖群体刺参CAT活性(P0.05)。 2.2升温对水院1号和大连养殖刺参体腔液中SOD活性的影响 水院1号和大连养殖刺参体腔液中SOD活性变化见图2。随着水温升高，水院1号和大连养殖刺参体腔液中SOD活性均呈先升高后降低的趋势。随着水温升高，大连养殖群体刺参体腔液中SOD活性逐渐升高，在24时达到最高，为0.100U/mL；28时SOD活性降到最低，为0.056U/mL，显著低于24时SOD活性(P0.05)。水院1号刺参SOD活性在24时达到最高，为0.154U/mL；28时，SOD活性降到最低，为0.070U/mL，显著低于24时SOD活性(P0.05)。 2.3升温对水院1号和大连养殖刺参体腔液中POD活性的影响 水院1号和大连养殖刺参体腔液中POD活性变化见图3。随着水温升高，水院1号和大连养殖刺参体腔液中POD活性均呈先升高后降低的趋势。大连养殖群体刺参体腔液中POD活性在20水温时达到最高，为2.407U/mL，显著高于其他3个温度点下POD活性(P0.05)；28时POD活性最低，为1.407U/mL。水院1号刺参体腔液中POD活性在20时达到最高为3.470U/mL；28时POD活性降到最低，为2.360U/mL；20与24时POD活性差异显著(P0.05)。升温过程中，水院1号刺参在16、24及28水温下POD活性均显著高于大连养殖群体刺参POD活性(P0.05)。 2.4升温对水院1号和大连养殖刺参体腔液中LSZ活性的影响 水院1号和大连养殖刺参体腔液中LSZ活性变化见图4。随着水温升高，水院1号和大连养殖群体刺参体腔液中LSZ活性均呈先升高再降低又升高的趋势。水温20时，大连养殖群体刺参体腔液中LSZ活性达到最高，为28.006U/mL；24时降到最低，为8.554U/mL，显著低于20时LSZ活性(P0.05)；28时，LSZ活性有所升高，为22.523U/mL。水院1号刺参在20时LSZ活性达到最高，为30.898U/mL；24时，LSZ活性显著降低(P0.05)，为9.741U/mL；28时，LSZ活性升至24.201U/mL。升温过程中，水院1号刺参LSZ活性在各温度点均大于大连养殖刺参LSZ活性，但差异不显著(P0.05)。水院1号刺参体腔液中MDA含量随着水温升高逐渐降低，其含量值分别为46.563、46.079、45.455、42.331nmol/mL，28时MDA含量显著降低(P0.05)。水温28时，水院1号刺参体腔液中MDA含量显著小于大连养殖群体刺参体腔液中MDA含量(P0.05)。 3讨论 3.1升温对水院1号刺参和大连养殖群体刺参免疫酶活性的影响 在自然生长过程中，随着环境温度的变化，刺参机体的生理免疫等反应会发生一定的变化。温度升高，会导致刺参代谢水平的变化，增加活性氧的形成，过量的活性氧会打破其和抗氧化系统之间的平衡，导致氧化胁迫，引起机体组织损伤17。在刺参抗氧化系统中，CAT和SOD是最先和最重要的防御机制18。CAT是生物体内过氧化物酶体的标志酶，能够催化过氧化氢分解，防止膜脂过氧化。SOD是第1个对抗活性氧自由基的抗氧化酶，参与清除体内超氧阴离子自由基(O2-)，可以防机体损伤和衰老19。本研究结果显示，随着水温升高，水院1号和大连养殖刺参体腔液中CAT和SOD活性均呈先升高后降低的趋势，这与Ji等5、Dong等7、徐东东等10、洪美玲等11的研究结果一致。说明在升温过程中，刺参能够通过提高CAT和SOD活性来清除多余的活性氧，在无脊椎动物中CAT和SOD活性随温度升高变化趋势具有一致性。当水温从24升至28时，刺参机体内CAT和SOD活性均降低，分析原因可能是刺参经历温度过高导致CAT和SOD活性受到抑制。 POD也是抗氧化系统中的关键酶，能够催化过氧化氢反应，与CAT、SOD一起在环境胁迫下清除机体内多余的活性氧自由基保护细胞。吴丹华等20报道了在低温胁迫下三疣梭子蟹血清中POD活性呈先升高后降低的趋势。目前还未见在高温下刺参POD活性变化的报道。本研究显示，随着温度升高，刺参体腔液中POD活性也呈现先升高后降低的趋势，表明刺参为防御机体免受升温的刺激，机体提高了POD活性来适应高温，在28水温下，POD活性显著降低(P0.05)，推测是因水温过高，POD活性受抑制。 LSZ是吞噬细胞杀菌的物质基础，能够清除侵入体内的异物，达到保护机体的目的21。温度对LSZ活性变化起着重要影响22。Wang等3的研究结果表明刺参LSZ活性从夏眠前期至夏眠期逐渐升高，11月底显著下降。华育平等23的研究表明史氏鲟血清中LSZ活性随着温度升高而升高，Langston等24报道了升温会造成大西洋鰈鱼血清内LSZ酶活性增强。王天坤等认为处于免疫临界温度范围内，克氏原螯虾LSZ活性随温度升高而升高，超出范围时，因温度胁迫产生应激反应，导致生理功能失调，机体免疫力下降，感染疾病25。本实验结果显示，升温过程中刺参LSZ活性先升高后降低又升高，推测刺参体腔液中免疫酶的作用也有一定的次序，随着水温升高机体内CAT、SOD和POD活性降低后，LSZ活性升高，保护机体免受损伤。 MDA含量可以反映生物机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度26。研究发现，随着水温升高，水院1号刺参体腔液中MDA含量逐渐降低，大连养殖群体刺参体腔液中MDA含量先降低后升高，与CAT、SOD、POD的变化趋势相反，与张喆等27研究结果相似。大连养殖群体刺参MDA含量在28下达到最高，推测是由于刺参在高温胁迫下，CAT、SOD和POD活性受到抑制，不能及时清除机体内产生过多的活性氧，引发脂质过氧化作用，导致MDA含量增加。 3.2升温过程中水院1号刺参和大连养殖群体刺参免疫酶活性变化的差异 研究发现，在升温过程中，水院1号刺参和大连养殖群体刺参能够通过调节非特异性免疫酶活性来适应温度升高造成的影响，保护机体免受损伤。随着水温升高，水院1号刺参体腔液中CAT、SOD、POD和LSZ活性变化较大连养殖群体刺参的变化大，其中CAT和POD活性变化差异显著(P0.05)，表明水院1号刺参能够对水温升高做出更大应激反应，通过调节免疫酶活性来平衡机体内氧化过程与抗氧化系统，保护机体免受损害，表现出对高温的适应性。水院1号刺参MDA含量在各温度点均小于大连养殖群体刺参MDA含量，且在28水温下差异显著(P0.05)，表明在升温过程中水院1号刺参的机体细胞受损程度小于大连养殖群体刺参，水院1号刺参对高温的适应性较普通刺参强。因此，水院1号的推广更有意义。 参考文献 1董云伟,董双林.刺参对温度适应的生理生态学研究进展J.中国海洋大学学报:自然科学版,xx(5):908-912. 2于东祥,宋本祥.池塘养殖刺参幼参的成活率变化和生长特点J.中国水产科学,1999,6(3):109-110. 3WangFY,YangHS,GabrHR,etal.ImmuneconditionofApostichopusjaponicusduringaestivationJ.Aquaculture,xx,285(1):238-243. 4王芳雨.刺参Apostichopusjaponicus生态免疫与夏眠的基础研究D.青岛:中国科学院海洋研究所.xx. 5JiTT,DongYW,DongSL.Growthandphysiologicalresponsesintheseacucumber,Apostichopusjaponicus(Selenka):AestivationandtemperatureJ.Aquaculture,xx,283(1):180-187. 6刘伟,常亚青,丁君.温度缓降和骤降对刺参水院1号和大连养殖群体非特异性免疫影响的初步研究J.水产学报,xx,37(9):1342-1348. 7DongYW,DongSL,MengXL.Effectsofthermalandosmoticstressongrowth,osmoregulationandHsp70inseacucumber(ApostichopusjaponicusSelenka)J.Aquaculture,xx,276(1):179-186. 8AnZH,DongYW,DongSL.EffectsofhightemperatureandrationonthegrowthofjuvenileseacucumberApostichopusjaponicus(Selenka)J.Aquaculture,xx,272:644-648. 9DongYW,DongSL.Inducedthermotoleranceandtheexpressionofheatshockprotein70inseacucumberApostichopusjaponicusSelenkaJ.FisheriesScience,xx(74):573-578. 10徐冬冬,楼宝,詹炜,等.高温胁迫对褐牙鲆生长及肝脏抗氧化酶活性的影响J.水产学报,xx,34(7):1099-1103. 11洪美玲,陈立桥,顾顺樟,等.不同温度胁迫方式对中华绒螯蟹免疫化学指标的影响J.应用与环境生物学报,xx,13(6):818-822. 12李晓英,董志国,薛洋,等.温度骤升和窒息条件对青蛤酸性磷酸酶和溶菌酶的影响J.水产科学,xx,28(6):321-324. 13李晓英,沈睿杰,董志国,等.温度骤升和窒息胁迫对青蛤抗氧化酶活性的影响J.中国饲料,xx(1):39-42. 14贲月,郝振林,丁君,等.高温对虾夷扇贝体腔液免疫酶活力的影响J.水产学报,xx,37(6):858-862. 15Borkovi?SS,?aponji?JS,Pavlovi?SZ,etal.TheactivityofantioxidantdefenceenzymesinthemusseliMytilusgalloprovincialisfromtheAdriaticSeaJ.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartC:Toxicology&Pharmacology,xx,141(4):366-374. 16ChangY,ShiS,ZhaoC,etal.Characteristicsofpapillaeinwild,cultivatedandhybridseacu