GB15193.14-2003致畸试验.pdf

I CS 0 7 .1 0 0C 5 3中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB 1 5 1 9 3 . 1 4 - 2 0 0 3 代替 G B 1 5 1 9 3 . 1 4 -1 9 9 4致畸验T e r a t o g e n i c i t y s t u d y2 0 0 3 - 0 9 - 2 4 发布2 0 0 4 - 0 5 - 0 1 实施华 人 民 共 和 国 卫 生 部国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB 1 51 9 3 . 1 4 - 2 0 0 3前言本标准全文强制。本标准代替G B 1 5 1 9 3 . 1 4 -1 9 9 4 致畸试验 。本标准与G B 1 5 1 9 3 . 1 4 -1 9 9 4 相比主要修改如下:在“ 范围” 中增加了受试物的具体内容: 食品生产、 加工、 保藏、 运输和销售过程中所涉及的可能 对健康造成危害的化学、 生物和物理因素， 检验的对象包括食品添加剂( 含营养强化剂) 、 食品 新资源及其成分、 新资源食品、 辐照食品、 食品容器与包装材料、 食品工具、 设备、 洗涤剂、 消毒 剂、 农药残留、 兽药残留、 食品工业用微生物等;在试剂中， 增加了剥皮用的染色液茜素红溶液;在“ 实验动物” 中: 去掉了有关小鼠和兔的内容;在“ 剂量及分组” 中: 增加了各剂量组设计的原则要求和急性毒性试验给予受试物最大剂量( 最 大使用浓度和最大灌胃容量) 无死亡而求不出L D s 。 时的剂量设计方法;在“ 操作步骤” 中: 孕鼠处死和检查中去掉有关小鼠和兔的内容; 胎鼠骨标本的制备与检查增加 剥皮后的制备方法; 增加了“ 致畸试验应检查的内容和应记录内容， 4 个表格自 本标准实施之日 起， G B 1 5 1 9 3 . 1 4 -1 9 9 4 同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位: 浙江医科大学、 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人: 黄幸纤、 李悠慧、 耿桂英。本标准于1 9 9 4 年首次发布， 本次为第一次修订免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB 1 5 1 9 3 . 1 4 - 2 0 0 3致 畸 试 验范围 本标准规定了预测环境有害物质对人体产生胚胎毒性及致畸性试验方法。 本标准适用于评价食品生产、 加工、 保藏、 运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的致畸作用， 检验的对象包括食品添加剂( 含营养强化剂) 、 食品新资源及其成分、 新资源食品、 辐照食品、 食品容器与包装材料、 食品工具、 设备、 洗涤剂、 消毒剂、 农药残留、 兽药残留、 食品工业用微生物等。2 原 理 母体在孕期受到可通过胎盘屏障的某种有害物质作用， 影响胚胎的器官分化与发育， 导致结构和机能的缺陷， 出现胎仔畸形。因此， 在受孕动物的胚胎着床后， 并已开始进人细胞及器官分化期时投与受试物 ， 可检出该物质对胎仔的致畸作用3 仪器与试剂3 . 1 仪器与器材 实验室常用设备、 生物显微镜及体视显微镜、 游标卡尺( 百分尺) 。3 . 2 试荆 实验用水为蒸馏水。3 . 2 . 1 甲醛、 冰乙酸, 2 , 4 , 6 一 三硝基酚、 氢氧化钾、 甘油、 水合氯醛、 茜素红。3 . 2 . 2 茜素红贮备液: 茜素红饱和液, 5 0 %乙酸饱和液5 . 0 m L ， 甘油1 0 . 0 m L , 1 % 水合抓醛6 0 . 0 m L混合， 放人棕色瓶中。3 . 2 . 3 茜素红应用液: 取贮备液 3 m L -3 m L ， 用 1 g / 1 0 0 m L -2 g / 1 0 0 m L氢氧化钾液稀释至1 0 0 0 m L ， 存于棕色瓶中。3 . 2 . 4 茜素红溶液: 茜素红。 . 1 g , 氢氧化钾1 0 g , 蒸馏水1 0 0 0 m L ,( 剥皮用染色液)3 . 2 . 5 透明液A : 甘油2 0 0 m 工 一 、 氢氧化钾1 0 g , 蒸馏水7 9 0 m L混合3 . 2 . 6 透明液B : 甘油与蒸馏水等量混合。3 . 2 . 7 固 定液( B o u in s 液) , 2 , 4 , 6 - 早 硝 基酚 ( 苦味 酸 饱和 液 ) 7 5 份、 甲 醛2 0 份、 冰乙 酸5 份。4 实验动物 常用试验动物为大鼠。选用健康、 性成熟( 9 0天1 0 0天) 大鼠， 雌性未交配过的大鼠8 0只一9 。 只， 雄性减半。5 剂量及分组 至少设 3 个试验组。高剂量原则上应使部分孕鼠( 和/ 或胎鼠) 出现毒性作用， 如体重减轻等， 低剂量组不应引起明显的毒性作用， 各剂量组可采用 1 / 4 , 1 / 1 6 , 1 / 6 4 L D , , 。急性毒性试验给予动物受试物最大剂量( 最大使用浓度和最大灌胃容量) 无死亡时， 以3 0 天喂养试验的最大未观察到有害作用剂量为高剂量组， 以下设2 个剂量组 另设阴性对照组。对某种新的动物， 初次试验可设一阳性对照组。每组至少1 2 只孕鼠。常用阳 性对照物有敌枯双( 0 . 5 m g / k g 体重一1 . 0 m g / k g 体重) 、 五氯酚钠( 3 0 m g / k g体重) 、 阿斯匹 林( 2 5 0 m g / k g 体重一3 0 0 m g / k g 体重) 及维生素A ( 7 5 0 0 p g / k g 体重一1 3 0 0 0 y .g / k g 体 91免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB 1 51 9 3 . 1 4 - 2 0 0 3重) 等6 操作步骤6 . 1 “ 受孕动物” 的检查和给受试物时间 性成熟雌、 雄大鼠按1 : 1 ( 或2: 1 ) 同笼后， 每日 早晨观察阴栓( 或阴道涂片) ， 查出阴栓( 或精子) ，认为该鼠已交配， 当日 作为“ 受孕” 零天。如果 5天内未交配， 应更换雄鼠。检出的“ 孕鼠” 随机分到各组， 并称重和编号， 在受孕的第 7天1 6 天， 每天经口给予受试物( 按 0 . 5 m L / 1 0 0 g体重一1 . 0 m L / 1 0 0 g 体重计) 。 受孕的。 , 7 , 1 2 , 1 6 , 2 0 天称体重， 并计算给受试物的量。 动物交配期室温在2 0 0 C -2 5 为宜， 环境安静， 必要时增加麦芽和蛋糕等营养物质。6 . 2 孕鼠处死和检查 于大鼠妊娠第2 0 天直接断头处死。剖腹取出子宫称重， 记录并检查吸收胎、 早死胎、 晚死胎及活胎数。6 . 3 活胎鼠检查 逐一记录胎仔性别、 体重、 体长， 检查胎鼠外观有无异常。胎鼠体表检查项目见表 t o 表 1 致畸试验胎鼠体表检查项目头部躯干部四肢 无脑症 脑膨出 头盖裂 脑积水 小头症 颜面裂 小眼症眼球突出 无耳症 小耳症 耳低位 无额症小额症 下额裂 口唇裂 胸骨裂 胸部裂 脊椎裂脊椎侧弯脊椎后弯 脐痛尿道下裂 无肛门短尾 、 卷尾 无尾 腹裂多肢无肢短肢半肢多指无指并指短指缺指6 . 4 胎鼠骨标本的制作与检查 将每窝1 / 2 的活胎( 奇数或偶数) 放人9 5 ( 体积分数) 乙醇中固定2 周3 周， 取出胎仔流水冲洗数分钟后放人 1 g / 1 0 0 mL - - 2 g / 1 0 0 m L的氢氧化钾溶液内( 至少 5 倍于胎仔体积) 8 h -7 2 h ， 透明后放人茜素红一 S应用液中染色6 h -4 8 h ， 并轻摇 1 次/ 天一2次/ 天， 至头骨染红为宜。再放人透明液 A中1 天2 天， 放人透明液B中2 天3 天， 待骨骼染红而软组织基本褪色， 将标本放人小平皿中， 用透射光源， 在体视显微镜下作整体观察， 然后逐步检查骨骼测量头顶间骨及后头骨缺损情况， 然后检查胸骨的数目， 缺失或融合( 胸骨为6 个， 骨化不全时首先缺第5 胸骨、 次为缺第2 胸骨) 肋骨通常 1 2 对一1 3 对， 常见畸形有融合肋、 分叉肋、 波状肋、 短肋、 多肋、 缺肋、 肋骨中断。脊柱发育和椎体数目( 颈椎7 个， 胸椎 1 2 个一1 3 个， 腰椎 5 个6 个， 底椎 4 个， 尾椎 3 个5 个) 有无融合、 纵裂等。最后检查四肢骨。 将胎鼠去皮、 去内脏及脂肪后， 放人茜素红溶液染色， 当天摇动玻璃瓶 2 次一3 次， 待骨骼染成红色时为止。将胎鼠换人透明液 A中1 天一2天， 换入透明液 B中2天3 天。待胎鼠骨骼已染红， 而软组织的紫红色基本褪去， 可换置甘油中。( 剥皮法) 9 2免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB 1 51 9 3 . 1 4 - 2 0 0 3胎鼠骨骼检查项目见表2表 2 致畸试验胎鼠骨骼检查项 目枕骨一 骨 化 中 心 、 发 育 不 全脊柱骨 数 目 、 融 合 、 纵 裂 、 部 分 裂 开 、 骨 化 中 心 数 、 发 育 不 全 、 缩 窄 、 脱 离 、 形 状骨盆弓数目、 骨化中心数、 形状异常、 融合、 裂开、 缩窄、 脱离四肢骨形状、 数 目腕骨骨化中心数掌 骨一 形 状趾骨形状肋骨一 数 目 、 形 状 、 融 合 、 分 叉 、 缺 损 、 发 育 不 全胸骨形状、 完全缺损、 胸骨节融合、 裂开、 形状异常、 发育不全6 . 5 胎鼠内脏检查 每窝的1 / 2活胎鼠放人B o u i n s 液中固定 2 周， 作内脏检查。先用自来水冲去固定液， 将鼠仰放在石蜡板上， 剪去四肢和尾， 用刀片在头部横切或纵切共 5刀， 再剖开胸腔和腹腔。按不同部位的断面观察器官的大小、 形状和相对位置。正常切面见图1 图 1 大鼠头部正切面图 a ) 经口从舌与两口角向枕部横切( 切面1 ) ， 可观察大脑、 间脑、 正脑、 舌及领裂。 b ) 在眼前面作垂直纵切( 切面2 ) ， 可见鼻部 c ) 从头部垂直通过眼球中央作纵切( 切面3 ) 0 d ) 沿头部最大横位处穿过脑作切面( 切面4 ) , 以上切面的目的可观察舌裂、 双叉舌、 额裂， 眼球、 鼻畸形、 脑和脑室异常。 e ) 沿下颗水平通过颈部中部作横切面5 ， 可观察气管、 食管和延脑或脊髓。 以后自腹中线剪开胸、 腹腔， 依次检查心、 肺、 横隔膜、 肝、 胃、 肠等脏器的大小、 位置， 查毕将其摘除再检查肾脏、 输尿管、 膀胧、 子宫或翠丸位置及发育情况。然后将肾脏切开， 观察有无肾盂积水与扩大。 试验胎鼠内脏检查项目见表3 0 表 3 致畸试验胎鼠内脏检查项目头部( 脊髓)胸部腹部嗅球发育不全 侧脑室扩张第三脑室扩张 无脑症 无眼球症 小眼球症 角膜缺损 单眼球 右位心房中隔缺损室间隔缺损 主动脉弓食道闭锁气管狭窄 无肺症 多肺症肺叶融合 隔病气管食管篓 内脏异位肝分叶异常肾上腺缺失 多囊肾 马蹄肾 膀胧缺失 肇丸缺失 卵巢缺失 卵巢异位 子宫缺失子宫发育不全 肾积水 肾缺失输卵管积水免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 把 1 5 1 9 3 . 1 4 - 2 0 0 36 . 6 试验记录 致畸试验记录内容见表4表 月 致畸试验记录内容动物交配给受试物期解剖检查时胎仔检查 动物编号动物种、 品系交配时周龄 确认受孕 临床症状进食进水量受试物及溶剂 剂量 给样途径 给样期限 母体解剖所见 卵巢重量 黄体数 着床数 胎盘重量胎仔子宫内位置 死胎数 活胎数 胎仔重体表检查骨骼检查内脏检查7 数据处理 各种率的统计用X “ 检验， 孕鼠 增重用方差分析或非参数统计， 胎鼠身长、 体重、 窝平均活胎数、 子宫连胎重量用 t 检验。胎鼠的数据以窝为单位进行统计。结果应能得出受试物是否有母体毒性和胚胎毒性、 致畸性， 最好能得出最小致畸剂量为比较不同有害物质的致畸强度， 可计算