大肠杆菌中胞外分泌N糖蛋白的生产.doc

大肠杆菌中胞外分泌N糖蛋白的生产Adam C. Fisher,1Charles H. Haitjema,2 Cassandra Guarino,3,4 Eda C elik,3 Christine E. Endicott,3Craig A. Reading,1Judith H. Merritt,1A. Celeste Ptak,5Sheng Zhang,5and Matthew P. DeLisa2,3,4*摘要空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）的pgl基因组编码的一个完整的N蛋白糖基化的途径，这个途径能官能地移到大肠杆菌上去。在这个系统中，我们分析N糖基化，细菌中膜迁移和受体蛋白折叠之间的相互作用。我们开发了一个重组N 聚糖受体肽标签，允许不同的重组蛋白的N-糖基化，蛋白质在能糖基化大肠杆菌分子的周质中表达。用这种糖基化标签，一个明显不同之处在糖基化模型中被观察到了，周质蛋白决定了内膜迁移的模型（i.e., Sec，信号识别颗粒SRP，或双精氨酸迁移TAT导出），这种现象表明蛋白质导出方式可以影响N -糖基化效率。我们也建立工程培养基蛋白定位到周质外的环境，比如外膜，膜囊，和细胞外培养基，这些可以作为N糖基化培养基。两者合计，我们的结果表明，空肠弯曲菌N -糖基化的组织与大肠杆菌中的不同的分泌机制是亲和的，有效扩大重组大肠杆菌N 糖组。此外，这个简单的糖基化标签策略扩大了糖工程工具箱和打开了细菌合成一大批重组糖蛋白结合物的大门。前言天冬酰胺连接（N连接）蛋白糖基化是至关重要的且保留在真核生物有机体中。它是最普遍的所有蛋白质翻译后修饰，影响到近70%的真核蛋白质组。结合到真核分泌和膜蛋白上的聚糖附属物可影响蛋白的折叠和稳定性，齐聚，抗水解，排序，和运输。N -连接的糖基化发生在内质网（ER）中且涉及到内质网膜脂质载体上多糖的装配,其次是转移到特定的天冬酰胺残留的目标多肽上。最初， N 连接糖基化只发生在真核生物中。然而， N -糖蛋白现在已经被描述到生活的所有领域，包括古菌和最近的细菌，其中最具特征的例子是人类胃肠菌空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）。在空肠弯曲菌中，参与这个途径的基因组包括一个17-kb命名为pgl的蛋白糖基化基因。迄今，超过40种周质和膜糖蛋白已被确定为空肠弯曲菌，且大多数这些绑定到N -乙酰半乳糖胺（GalNAc）-特效血凝大豆凝集素（SBA）。质谱和核磁共振共振（NMR）的研究显示，N连接聚糖就是GlcGalNAc5Bac，这里Bac是细菌糖胺（2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧葡萄糖）。这个分支七糖通过按次序添加在脂质载体上的激活核苷酸糖以及细胞质内膜表面的十一碳烯焦磷酸酯来合成。一旦装配完，脂连的七糖通过假定的ATP结合盒（ABC）运输人PglK快速翻转通过膜。七糖通过一种叫PglB的寡糖传输酶（OST）催化转移到了周质培养基蛋白上。PglB是单个完整的膜蛋白，和催化真核亚基OST STT3有明显的顺序相似性。PglB把七糖固定在天冬酰胺酸上，以D/E-X1-N-X2-S/T为基本图案（在这里X1，X2是除脯氨酸外的任意残基），一种相似于真核细胞糖基化位点的位点。近期Wacker和合作者把整段空肠弯曲菌（C.jejuni）pgl基因转移到大肠杆菌上，赋予这些分子使蛋白质糖基化的能力。天然空肠弯曲菌（C. jejuni）糖蛋白例如Peb3和AcrA能通过Sec途径定位到周质，在具有糖基化能力的大肠杆菌中N糖基化。AcrA通过双精氨酸转运途径（Tat）运输时也能N糖基化，Tat途径因为能通过内膜导出折叠蛋白的能力而众所周知。除了周质蛋白，一些天然空肠弯曲菌（C.jejuni）N-糖蛋白基于生物信息分析被预测为完整的膜蛋白。共同的，这些早期的研究表明空肠弯曲菌（C.jejuni）N-连接糖蛋白组织与不同的分泌机理亲和，能容忍从不折叠多肽到完整折叠蛋白域（虽然高度复杂且溶剂暴露）。然而受到膜迁移和细菌上受体蛋白折叠的影响，糖基化还没有被完全完成。定位到周质外的蛋白，例如外膜或细胞外培养基是否与N糖基化亲和还不知道。因此，本文的目的在于研究不同分泌和细胞外蛋白培养基在带有pgl基因大肠杆菌分子中N糖基化的程度。为了解决这个问题，我们开发了一种基因编码N聚糖受体多肽标签（GT），它能附加在末端或植入重组蛋白内部位置。许多用GT来修饰的重组蛋白在表达pgl基因的大肠杆菌菌株中可靠地被糖基化了。当GT被用来和通过不同输出途径（e.g., Sec,信号识别颗粒SRP，或Tat）定位到周质上的蛋白质结合时，我们发现这些蛋白质在糖基化模型中的一个明显不同之处，这取决于他们在内膜上迁移的模式。在所有测试的事例中，通过GT的N聚糖附属物没有对蛋白质活性产生任何可测量的影响。最后我们发现定位到不同位点的蛋白质是很容易被N糖基化的，这些位点包括周质，外膜，膜囊和细胞外培养基。材料和方法细菌菌种和生长条件 所有这个研究用到的菌种都在表1中列举了。大肠杆菌DH5用作质粒的克隆，大肠杆菌菌株CLM24 (16)用在所有糖蛋白表达实验中除非特别标记。由于分子表面糖蛋白的标记，大肠杆菌菌株BW25113 waaL:Kan被使用（3）。为了外膜膜囊的准备，大肠杆菌菌株CE8032通过P1vir噬菌体的转导来生产。简单来讲，卡那霉素标记的等位基因能在受体分子JC8031中转导，其中JC8031是一种有很多小泡的tolRA的突变菌株，等位基因能从BW25113 waaL:Kan 中得到。由于YebF影响分泌研究，MC4100菌株由于有最小的麦芽糖结合蛋白（MBP）漏损率而被使用，其中有15个普通的大肠杆菌菌株被测试，其中一个衍生菌株在它早期成长阶段没有MBP漏损率。晚上大肠杆菌要用新鲜的Luria-Bertani（LB）培养基来稀释，再加抗生素和0.2%葡萄糖，在30或37下培养。在对数中期时（光密度在600nm），培养基换成了没有葡萄糖且含有抗生素的LB溶液，蛋白质的表达受到100 M异丙基-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷（IPTG）pTrc99A-基质表达载体或0.2%阿拉伯糖pBAD基质表达载体的诱导。诱导反应在25或30下持续24h。抗菌素用以下浓度：100 g/ml氨苄青霉素（Amp），25 g/ml 氯霉素（Cm）,和50 g/ml Kan。质粒构造 质粒pTrc-GT-6-His是以植入合成的DNA来克隆的，该DNA编码GT（集成DNA技术IDT）和一个在XbaI 和HindIII pTRC99A之间的六His（6-His）主题。DNA编码malE, spmalE（在那sp代表信号顺序/多肽），sptorA-malE ,spdsbA-malE 和spmalE被分别植入到SacI 和XhoI ofpTrc-GT-6-His 来制造 pTrc-MBP-GT, pTrc-spMBP-GT, pTrc-spTorA-MBP-GT, pTrc-spDsbA-MBP-GT, 和pTrc-spMBP-GT。编码spmalE的DNA被克隆进pTrc-spMBP-GT的SalI位点来制造pTrc-spMBP-GT-MBP。编码GT-MBP的DNA然后被克隆回SacI 和 AfeI位点的pTrc-MBP-GT来制造pTrc-spMBP-GT-MBP-GT。编码Top7的DNA被克隆进pTrc-spDsbA-MBP-GT的XbaI 和XhoI位点来制造pTrc-spDsbA-TOP7-GT。编码sptorA-gfpmut2的DNA被克隆进pTrc-GT-6-His的SacI和BamHI位点来制造pTrc-spTorA-GFP-GT。编码26.10 IgG重链和轻链双版本的DNA通过pMAZ360-26.10的PCR扩大来得到且通过AvrII和 SpeI消化。PCR产品被克隆进pTrc-spDsbA-TOP7-GT，pTrc-spDsbA-TOP7-GT已经被XbaI 和SpeI切断来移动Top7编码的基因。最终的质粒是pTrc-spDsbA-26.10LC-spPelB-26.10HC-GT，表达带有DsbA信号肽的轻链，带有PelB信号肽的重链和一个C-终点的GT。pTrc-spDsbA-Fc质粒通过克隆人类IgG1的Fc区变成pTrc-spDsbA-MBP-GT的XbaI 和HindIII来制造。pTrc-spDsbA-Fc DQNAT质粒也用相同的方法来制造，除了Fc基因，Fc基因编码Q295D, Y296Q和 S298A的点突变且通过在SaccharomycesCerevisiae中的同性质重组克隆进pMQ70（49）然后克隆进pTrc-spDsbA-MBP-GT的XbaI 和HindIII位点。质粒pBAD18-CjaA通过放大来自C. jejuni的cjaA基因来制造（由Brendan Wren提供）。cjaA的PCR放大在质粒pBAD18的NcoI 和 NotI位点被克隆，包括在NotI 和PsiI之间的旗表位末端。质粒pBAD24-OmpX-GT通过植入在质粒pBAD24-OmpX*-His KpnI 和SpeI 位点的GT顺序来制造（在这里*表示一个OmpX的突变形式，OmpX包含包含一个植入多肽到loop 2的克隆位点）这样的GT多肽末端定位在丝氨酸残基OmpX的细胞loop 2外的53和54号位。这跨膜循环能够容忍短肽插入不影响Ompx表面表达（44）。一个在KpnI 和 SpeI位点侧面的GQSGQ键也被产生了。一双顺反子结构的共表达OmpX-GT和PglB的是由放大pglB从空肠弯曲杆菌的基因组DNA，并插入得到的PCR之间的产品XbaI和SBFI的质粒pBAD24。接下来，OmpX-GT Nco位和Xma之间插入在相同的质粒，但用其自己的核糖体结合位点相同的一个上游的pglB 。质粒pBAD18- ClyA-GT构建成pTrc-GT-6-His通过第一插入的PCR-amplifiedclyA基因-His的SacI和XhoI位之间。整个ClyA-GT-6-His，它的结构是通过PCR扩增和插入之间的SacI和HindIII位点在pBAD18。YebF质粒pTrc99A的衍生物。对于这些，E.大肠杆菌一套YebF PCR扩增并克隆在pTrc99A的Sac和Xba位之间。对照组同样由克隆YebF的N-末端信号肽（spYebF）或构造运用于大肠杆菌表现系统的YebF缺乏成熟的域的N-末端信号肽（spYebF）SacI和XbaI位于pTrc99A上。 GT或MBP-GT的融合，再加入每个YebF Xba和Sal位点之间，Sal和Hind位点之间插入。本研究质粒的序列的所有构建的DNA测序被证实。工程蛋白质溶液内消化 在溶液中消化MBP-GT进行如前所述（63）无还原和烷基化反应。 A蛋白样品（200克）溶解在总量为100升变性溶液含有6.0 M HCl和50毫摩尔Tris，pH值为8.0，并孵育在56下为45分钟。样品1:5稀释于50 mM乙酸铵碳酸氢盐，pH值7.8。然后，以10克胰蛋白酶（Promega）或1克的lysC（西格玛）被添加到的MBP-GT或ACRA-4（ACRA含有四种可能的糖基化位点）的溶液，分别在的酶 - 底物的比率为1:20（重量/重量）。蒸煮16小时在37下进行，并停止通过加法为0.5（体积/体积）的三氟乙酸（TFA）。摘要脱盐固相萃取使用的是9月包装盒（Waters公司），并洗脱的胰蛋白酶肽，蒸发至干，用SpeedVac离心SC110。将样品重新溶解在200升含0.1甲酸的用2乙腈得到20pmol/l的储备液。纳米喷射的质谱分析 MBP-GT进行了分析，输注纳升电质谱（MS）分析如下。酶分析在2pmol/l的浓度在50乙腈稀释样品中。MS分析之前，用0.1甲酸。将样品（6升）装入一个独立的玻璃尖（交付的LTQ Orbitrap XL配备了一个纳米级的离子源质谱仪。该示例一项调查显示MS扫描和分析，调整和正离子模式，串联质谱（MS/ MS）的扫描选择的离子使用的Orbitrap作为一个质量分析仪。使用碰撞诱导解离（CID）碎片，分辨率为60000。该仪器被操作时，所得到的数据进行分析。所有的实验中使用的喷雾电压为1.8千伏，毛细管温度设定到150，碰撞能量被设置为20用于MS / MS实验。最大扫描时间被设置为50 ms，且结果2至3微扫描的为每个扫描相加。调查MS扫描和一个单独的糖基化的肽的MS / MS扫描，20分钟获得的质量范围从m/z200到m/z2 的数据。数据分析进行采集的原始数据的使用Xcalibur 2.0.7软件。 对20分钟的MS和MS / MS谱进行了总结。纳米LC-MS/MS分析 消化ACRA-4样品（4升）分别注射使用著名的自动进样器上的C18柱（Dionex公司）上线脱盐，然后分离在PepMap18反相（RP）的纳米柱（3米，75米15厘米; Dionex公司），并在洗脱60-min梯度的5至45乙腈在0.1甲酸中，在275升/分钟。“纳米液相色谱法（nanoLC）列线连接到一个混合型三重四极杆线性离子阱质谱仪。MS进行数据采集分析1.4.2软件（应用生物系统公司）的前体离子（PI）扫描触发，依赖于信息的采集（IDA）。跨质量监测氧鎓离子的HexNAc的前体离子在m / z204.08扫描波长为0.2 ，M / Z =650到1600，用于检测糖肽含有N-acetylhexo胺单元的范围。纳流喷雾电压为2.0千伏，使用在正离子去簇电压设置为50eV，用氮气作为碰撞气体。在IDA分析中，每个前体离子扫描和增强分辨率扫描后，选定两个至三个最高强度的离子在多个电荷态下作为串联质谱（MS / MS），根据不同的电荷状态和m / z值的检测离子滚动碰撞的能量。所有由前体离子扫描获得的MS / MS谱检测到的糖肽离子，用1.4生物分析软件解释并手动检查（美国应用生物系统公司）。细胞分离和蛋白质纯化。为了分离细胞内的糖蛋白，在5000转15分钟4下离心沉淀相等数目的细胞，在加有1克（体积/体积）的Triton X-100和1毫克/毫升溶菌酶的缓冲液中裂解，在冰里温育30分钟。再将细胞每隔1分钟超声30秒4次。超声处理的细胞，在4下10,000转离心20分钟并收集上清液，相等数目的细胞在5000转4下15分钟离心收集上清液为周质和培养准备。上清液组分经0.2微米过滤，然后用密理博的离心超滤管浓缩。将细胞沉淀洗涤，然后细胞内周质和细胞质分馏到其他组分，用冰维持渗透压在其他地方描述（13，31）。外膜囊泡（OMVS）中分离出不含细胞的上清液如前所述（58）。简单地说，在5000转15分钟4离心后，无细胞的上清液用0.2微米的真空过滤器过滤，并用28Ti转子（贝克曼仪器公司）141000转2小时4下超速离心，将包含OMVS的颗粒收集在磷酸盐缓冲液中盐溶液中（PBS，pH 7.0）。OMV接种在LB培养基中并灭菌。在自然条件下根据说明书用NTA（Qiagen）将6号标记蛋白进行纯化。Fc结构域根据说明书（赛默飞世尔科技公司）使用Nab蛋白A / G的离心柱进行纯化。蛋白质分析。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质（BioRad公司），并如前所述（13）用Western印迹法进行。简单地说，蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，并把膜进行以下操作：抗-MBP抗体与芳香胺过氧化物酶（HRP）（New England Biolabs公司）共轭，抗-6-His抗体和HRP共轭，多克隆抗体针对OmpX（14）（由让 - 玛丽佩奇提供），由空肠弯曲菌的七庚糖生成hR6P抗血清（提供由Markus AEBI），抗人的IgG-HRP（Promega公司）和SBA-HRP（Sigma公司）共轭。试验中OmpX和HR6抗血清，抗兔IgG-HRP（Promega公司）作为二次抗体使用。进行酶联免疫吸附试验（ELISA），使用印涂覆有4微克/毫升牛血清白蛋白（BSA）的地高辛（Sigma公司）或Fc结构域NAB蛋白将A / G柱纯化。BSA的地高辛-或Fc涂层plateswere用稀释的IgG 26.10的镍NTAspin柱（Qiagen）或Fc RI（CD64; RD系统）孵育并分别纯化样品。基板西格玛快速检测邻苯二胺盐酸盐（OPD; Sigma公司），反应进行20至30分钟，在490 nm的酶标仪190测含量（Molecular Devices公司）。对于IgG的ELISA试剂盒，该信号，所确定的印迹成像反应26.10 IgG抗体的总量。用于测量的绿色荧光蛋白（GFP）荧光活性，使用荧光酶标仪（分子移动设备）进行荧光测量。荧光标记的细菌流式细胞仪和荧光显微镜如前所述分析测量（32）。简单地说，诱导蛋白表达后，100微升的细胞用PBS洗涤，并用20微克/毫升的SBA-的Alexa Fluor488（Invitrogen公司）中PBS中孵育45分钟在黑暗中。，一个额外的PBS洗涤后，流式细胞仪数据收集在FACSCalibur系统（Becton Dickinson公司）。平均荧光确定从直方图50,000个事件收集的细胞发出的荧光，在扫描模式下使用FACSCalibur流式细胞仪。对于显微镜，15微升细胞培养用Alexa Fluor488标记的SBA被放置到一个的显微镜载玻片与盖玻片。上执行的Zeiss Axioskop显微镜40显微镜配备了蔡司100/1.30NEOFLUAR的镜头，X-引用光源（EXFO，密西沙加，安大略省），和Semrock（罗切斯特，NY）中华前景GFP排放的过滤器多维数据集。数字图像现货Flex的数字相机（诊断仪器公司），和控制现货成像软件。明视场照明下拍摄的所有图像在紫外光照射下用于测量的绿色荧光蛋白（GFP）荧光活性，使用荧光酶标仪（分子移动设备）进行荧光测量。荧光标记的细菌用流式细胞仪和荧光显微镜如前所述分析测量（32）。简单地说，诱导蛋白表达后，100微升的细胞用PBS洗涤，并用20微克/毫升的SBA-的Alexa Fluor488（Invitrogen公司）中PBS在黑暗中孵育45分钟。，多次PBS洗涤后， 在FACSCalibur系统（Becton Dickinson公司）收集流式细胞仪数据。从直方图50,000个事件收集的细胞发出的荧光中确定平均荧光，在扫描模式下使用FACSCalibur流式细胞仪。对于显微镜，15微升细胞培养用Alexa Fluor488标记的SBA被放置到显微镜载玻片与盖玻片。Zeiss Axioskop显微镜40显微镜配备了蔡司100/1.30NEOFLUAR的镜头，X-引用光源（EXFO，密西沙加，安大略省），和Semrock（罗切斯特，NY）中华前景GFP排放的过滤器多维数据集。数字图像使用Flex的数字相机（诊断仪器公司），和控制成像软件。在紫外光照射下拍摄的所有图像。图1重组糖蛋白的糖基化标签大肠杆菌。 （一）GT是由连续四个D-X1-N-X 2-Tsequons被有效地在细菌中的糖基化的。 （二）免疫印迹分析（从左至右）与C-末端GT的MBP（MBP-GT），成熟的的MBP缺乏本地信号肽与C-端GT（spMBP-GT），空肠弯曲杆菌和本机糖蛋白ACRA工程有两个额外的糖链受体位点（ACRA-4）。蛋白质是携带pACYCpgl（+）或pACYCpglmut（-）的细胞中表达。 （三）Western blot分析（从左至右）MBP-GT，其原生信号肽序列替换为DsbA蛋白的信号肽或TORA，MBP的窝藏后，原始信号序列的N-端GT（spMBP-GT-MBP）和MBP携带N-和C-末端GT序列（spMBP-GT-MBP-GT）。每个人都表达的细胞进行pACYCpgl。从细胞裂解液中蛋白进行纯化，经Ni-NTA亲和层析法。每个车道装入相同量的蛋白质。印迹用抗-His（顶部）或hR6P（底部）抗体。结果一种通用受体序列作为N-糖基化的重组蛋白。我们的总体目标是系统地评价大肠杆菌N-连接的糖蛋白分泌到周质和其他胞质外的糖基化位置。为了实现这个目标，我们首先试图建立一个肽标签，可在重组基因编码的感兴趣的蛋白质，从而使这些蛋白质在大肠杆菌中普遍的糖基化。陈和他的同事最近的研究表明序列DQNAT是一个在体外糖基化最佳的受体者PglB（7）。在此基础上因此，我们的理由是，遗传修饰的靶蛋白与含有一个或多个N-或C-末端肽DQNAT可能就足够了携带PGL基因的大肠杆菌的N-糖基化。为了测试这个概念，我们设计了一个由四个连续的甘氨酸残基（图1a）的C-末端GTDQNAT彼此分离。为了测试该标签的可靠性，我们克隆的大肠杆菌“基因，在质粒pTrc99A的与C-末端GT编码麦芽糖结合蛋白（MBP），然后由一个六组氨酸（6-His）的标记，以方便纯化。将所得的质粒用于转化同时携带质粒pACYCpgl或质粒pACYCpglmut的大肠杆菌菌株BL21（DE3），这分别为（PGL）或突变的C.的（pglmut）的空肠弯曲菌的糖基化基因（57）。重组蛋白细胞提取物经Ni-NTA亲和层析纯化并通过SDS-PAGE及随后的免疫印迹分析。Ni-NTA亲和纯化的馏分细胞MBP-GT表达的主要是野生型PGL基因下的一个蛋白质量为45的kDa和3个分子质量高的蛋白条带，但不是pglmut（图1b）。当MBP-GT没有其在细胞质中表达时三高分子质量的条带消失。因此，我们推测，这些较高的分子质量条带以糖基化形式MBP-GT大量复制。为了证实这一点我们测试hR6P与纯化的抗血清蛋白质的反应性。这种血清抗空肠弯曲菌全细胞提取并已被证明优先检测空肠弯曲杆菌N-糖蛋白（马库斯AEBI，个人通信）。只有携带PGL基因细胞才会MBP-GT，免疫反应产生hR6P抗血清（图1b，底部面板）。无论是MBP-GT表达的糖基化缺陷细胞及细胞质表达MBP-GT检测抗血清hR6P（图1b，底部面板）。为比较，我们设计C.空肠弯曲菌糖蛋白ACRA，其中包含4个可能的糖基化位点在N117 N123 N147 N273（ACRA-4）和一个PELB导出信号，通过段通路（34）定位到周质。表达ACRA-4x主管大肠杆菌细胞的糖基化，生产的多个高分子质量的蛋白质，使用hR6P抗血清进行检测（图1b），说明存在多个空肠弯曲杆菌的N-聚糖。这些聚糖，未发现ACRA-4x是糖基化缺陷表达的细胞。分析来自由nanoLC-MS/MS证实的特性的身份C.heptasaccharide GlcGalNAc5Bac菌（参照图中的S1补充材料）的纯化MBP-GT蛋白质的糖基化受体细胞碎裂的胰蛋白酶肽。提取的色谱峰值分析显示，被发现的异构体大致在的比例64，34和2的1，2，和3-聚糖亚型（数据未示出），假设所有聚糖异构体具有相同的离子化效率。应该分析指出的是未检测到一个四-聚糖亚型（数据未示出）与三个观察一致不同条带Western blot（图1b和c）。通过SRP和Tat途径定位蛋白到周质上。上述结果表明MBP的糖基化，通过Sec（37）途径定位到周质。接下来，我们MBP-GT在空肠弯曲菌糖链是否有特定附着位点，同样可以通过不同的蛋白质导出方法，即SRP或Tat途径。值得一提的这两种出口途径形成鲜明对比的传输机制。SRP途径翻译导出的折叠的蛋白质（25，48），而众所周知Tat的途径能够翻译折叠后的蛋白（13，45）。要针对MBP-GT的SRP和Tat的途径，SRP-相关信号由原生二硫化物变为信号肽与异构酶I（spDsbA）的（48）和Tat相关信号变为三甲胺N-氧化物还原酶（spTorA）的（47），spDsbA-MBP-GT或spTorA_MBP-GT_的细胞表达由抗-His抗体（图1c）PGL基因位点引发的强烈的信号。在spDsbA-MBP-GT情况下的目标是SRP途径，细胞产生三种蛋白质，分别为mono-, di-, andtrigly cosy lated，就像hR6P的抗血清的MBP-GT反应，如图（图1c）。上述情况这让人想起了针对Sec途径的MBP-GT信号肽。有趣的是，细胞spTorA-MBP-GT产生了一个主要的蛋白质频带对应的diglycosylated形式和两大部分较暗的频段对应的单 - 和triglycosylated形式（图1c）。因此，细菌N-连接糖基化的效率出现是不同的蛋白质是因为Sec/SRP途径，因为这些导出方式不同（即，折叠与展开基板）。值得注意的是，可以观察到糖的差异性当GT序列从MBP的C末端移动到N末端时，在天然信号肽（分别比较MBP-GT-GT和spMBP_MBP图1b和c线路）的后面。大肠杆菌细胞内spMBP-GT-MBP的糖基化表达导致四个hR6P抗血清蛋白质的产生，然而只观察到三个MBP-GT蛋白质与此血清反应（图1c）。这表明，最多四个空肠弯曲菌N-聚糖共价连接到spMBP-GT-MBP。当GT同时在MBP的N末端和C末端，7个蛋白hR6P抗血清进行反应性检测（图1b和c），从而产生迄今在细菌中最广泛的糖基化蛋白质表达。观察MBP经过SRP和Tat途径 N-连接糖基化水平存在差异，接下来我们解决这是否是GT受体肽或者其他糖蛋白在大肠杆菌中表达的一个较普遍的现象。为了测试这一点，如上所述我们修改了ACRA-4-构造，信号肽在Tat（spTorA），Sec（spMBP），SRP（spDsbA）的途径，并确定了每一个通过SDS-PAGE和免疫印迹的抗-His或hR6P抗血清的糖基化状态。不同于MBP-GT，受体都聚集在蛋白质的C末端， ACRA-4_糖基化位点分布在整个蛋白质。糖基化受体细胞中的周质提取物包含抗His-蛋白（图2a）。然而，只有spMBP-ACRA-4引起更高分子量的抗-His抗体。与此相反，spTorAACRA-4-和spDsbA ACRA-4-构成各产生了只有一个在37 kDa的带。spTorA ACRA-4x和spDsbA ACRA-4x更高分子量的缺乏的比例表明，相对于spMBP-AcrAVOL ，aglycosylated的ACRA糖基化是相当低的的图2 糖蛋白的内膜易位。ACRA-4的Western blot分析，有针对性地表达（spTorA），SRP（spDsbA），Sec（spMBP）蛋白出口途径。用Ni-NTA亲和层析法从细胞周质馏分纯化蛋白质。尽管如此，出口经由每个这些途径引起糖化ACRA，确认通过Western印迹与hR6P抗体（图2b）。二段和SRP途径触发四种蛋白质的检测，表示的混合物，单 - ，二 - ，的三和tetraglycosylated形式ACRA-4事实上，nanoLC-MS/MS分析证实了N-连接糖基化在所有四个地点（显示为spMBP ACRA-4 图S2的补充材料）。一个稍微不同的结果时，得到ACRA-4有针对性地Tat的途径。 spTorA ACRA-4的表达和功能pgllocus产生一个单一的较慢的迁移，与hR6P（图2b）的抗血清有交叉反应的蛋白质。该频带的分子质量只是在50 kDa的，这可能对应tetraglycosylated ACRA-4（44.2 kDa的），保留了其N-末端，spTorA信号肽（4.2 kDa的）。事实上，已经观察到，过度底物和细胞应激去除信号肽在大肠杆菌中的表达（19，54）的效率产生不利影响。基于缓慢由nanoLC-MS/MS在所有四个站点（数据未示出），它揭示的N-连接的糖基化，这种蛋白质和其分析的电泳迁移率，我们得出这样的结论：tetraglycosylated ACRA-4是由达途径的主要糖化种类。拍摄到gether，蛋白质定位到达，秒，和SRP通路所有成为N糖基化的，Tat比秒/ SRP基板中的糖基化模式的变化，可能反映了不同的底物的构象（折叠与展开），被提交至OST。N-连接的糖基化在周质中的非细菌性蛋白质。接下来，我们确定是否GT序列可能允许非细菌性底物的N-糖基化大肠杆菌本地化的蛋白质周质中的携带的PGL基因簇。作为第一目标，我们选择了的TOP7蛋白质，ADE从头设计/？蛋白折叠成的结构性质（36）中没有观察到。我们修改TOP7与N-末端DsbA的出口信号和C-末端GT。在糖基化能力的细胞中的表达，spDsbA-TOP7-GT与抗-His抗体反应，显然是糖基化的基础上其朝hR6P（图3a）的反应活性。接下来，我们检查独立非执行董事GFPmut2，折叠，荧光激活细胞排序的（FACS）优化变异的GFP（11）。GFP的荧光，是只有当它被允许在细胞质中的革兰氏阴性菌（15）折叠。由于这一特殊的属性，导出达的途径是通过只有这样，才能定位到周质的荧光绿色荧光蛋白（18，46，55）。因此，一个spTorA-GFP-GT创建和嵌合体中存在的官能PGL轨迹表示。提取菌株含有这种结构引起了强烈的信号，与hR6P抗血清（图3a）。最后，我们研究一个完整长度的哺乳动物来源的抗体，26-10的鼠抗地高辛抗体（IgG抗体26.10）（41）。Simmons和他的同事们表明先前aglycosylated的的IgG的表达是可能的在大肠杆菌中通过单独的表达和IgG重链和轻链的周质（50）的定位。以类似的方式，我们针对DsbA蛋白和一个的PELB导出信号（41），分别通过一个到周质的轻和重链的IgG26.10。此外，我们修订了重链通过C-末端GT受体序列的糖基化。IgG表达和纯化之后，蛋白质反应性朝向hR6P仅在检测到功能PGL轨迹（图3a）的存在下，表明细菌聚糖的共价附着。要确定是否糖基化影响这些重组糖蛋白功能，我们研究了我们设计的绿色荧光蛋白和IgG26.10结构后表达的糖基化能力的细胞。在情况下spTorA-GFP-GT，GFP的荧光活性不受影响由除空肠弯曲杆菌的N-聚糖，虽然另外的GT序列确实引起了近30减少在spTorA-GFP的荧光相对未经GT（图3b）表示的版本。因此，我们得出结论，绿色荧光蛋白标签本身的的荧光适度下降，这是独立的糖基化过程。我们还研究了结合活性的大肠杆菌表达对同源抗原地高辛抗体26.10。IgG的26.10产生的蛋白质在细胞活跃或不活跃的PGL基因簇的活动实际上是相同的，作为衡量ELISA（图3c），它是类似的GFP的情况下，表示的糖基化的过程没有影响的抗原结合活性的IgG26.10。26.10与IgG的结果的鼓舞，接下来我们决定是否在N297中的IgG1的Fc受体域保守的受体位点被糖基化在细菌系统。为了解决这个问题，我们克隆IgG1的Fc结构域与三重突变（Q295D Y296Q S298A）编码的的首选DQNAT sequon的N297为PglB介导的糖基化（的Fc DQNAT突变）的突变体。携带的PGL的基因在大肠杆菌细胞的表达，的Fc的DQNAT的突变体，但不是野生型FC有效地糖基化（图3a）。值得注意的是，尽管有这种糖基化作用在N297，细菌糖基化的Fc DQNAT没有观察到结合的Fc RI受体，通过ELISA测定，而一个aglycosylated的Fc的变种（Fc的E382V M428I）被设计，以结合的Fc RI（28）给了强烈的的ELISA信号（参见图S3中的补充材料）。这表明，细菌的N-聚糖是不足以用于创建向“开”构象所需的Fc受体结合（35），或氨基酸周围Asn297（即，Q295，Y296和S298）需要与N一起糖基化结合的Fc RI恢复。图3 不同的糖基化的重组蛋白糖基化大肠杆菌。（一）Western印迹分析（从左至右）MBP-GT带或不带其天然信号肽，TOP7-GT与DsbA的信号肽，GFP-GT与TORA信号肽，和鼠抗地高辛抗体26.10与pelB信号肽上的轻链上的，也被附加与重链GT和DsbA蛋白信号肽。携带pACYCpgl（？）或pACYCpglmut（？）细胞中的蛋白表达。印迹与抗-His（左）或hR6P（右）抗体探测。与抗人抗体（顶部）和SBA（底部）进行Western印迹分析的野生型的Fc（重量的Fc）和Fc DQNAT。 （二）荧光表达spTorA-GFP或spTorA的GFP-GT PGL PGL物细胞中的细胞。数据是三次重复的平均值结果实验，及标准误差是小于5。 （三）ELISA信号板涂有共轭BSA异羟基毛地黄毒苷（DIG）和26.10 PGL PGL MUT细胞IgG的纯化用。 BSA异羟基毛地黄毒苷（DIG）控制的井，从PGL细胞的培养与26.10 IgG的纯化。本土化的外膜糖蛋白的N-联。迄今为止，只有可溶性周质蛋白被糖基化的在大肠杆菌细胞携带thepgllocus。因此，我们进一步探讨是否外膜蛋白可能是N糖基化。以类似的方式MBP的上述策略，我们设计的GT受体序列到的外膜蛋白OmpX外第二环（44）从大肠杆菌中。细胞表达OmpX-GT中的存在下产生的糖基化的OmpX pgllocus，而OmpX-GT表示在PGL物轨迹细胞携带表明没有检测到的糖基化（图4a）。要确认的糖化OmpX-GT定位于外膜，我们试图完整的大肠杆菌细胞标记，荧光标记的版本SBA（SBA的Alexa Fluor488）。由于外源凝集素SBA终端半乳糖胺残留量的C.菌heptasaccharide的如选择性地结合，我们推测，如果OmpX-GT定位于外膜，N-GLY-罐外循环2将访问SBA绑定ING。另外，由于SBA是120000达四聚体，它交叉外膜太大，从而被限制的结合只有那些在细胞表面上所显示的N-聚糖。出乎我们的意料，大肠杆菌细胞的PGL位点的受体蛋白的情况下给予了强烈的荧光信号SBA的Alexa Fluor488标记，而质粒的细胞无荧光（见图S4a和b中的补充材料）。该信号是不依赖于PglB，作为标识PGLMUT细胞中，同样高的细胞荧光（S4C补充材料）。我们怀疑，这种荧光是由于空肠弯曲菌N-糖基转移到脂质A和随后的本土化的这糖脂共轭的外膜。我们的假设的基础是观察undecaprenyl焦磷酸-磷酸盐-连接的寡糖的基板的连接酶，大肠杆菌Waal的转移从的undecaprenol脂质载体的脂质A核心分子（43）的寡糖。为了测试这个概念，我们创建了一个大肠杆菌菌株的基因组副本失活Waal的或waaC的的等位基因更换突变的。O-抗原的连接酶，催化转移的O-抗原的脂多糖（LPS）的核心，在Waal基因的代码，而LPS heptosyl转移的I，它传输的第一庚糖残基上的内部核心的waaC基因的代码LPS（43）。事实上，Waal的和waaC的缺陷的