动物实验的设计和实施.ppt

动物实验的设计和实施,动物实验设计概论,Forscientific,ethicalandeconomicreasons,itisimportanttodesignanimalexperimentswell,toanalyzethedatacorrectly,andtousetheminimumnumberofanimalsnecessarytoachievethescientificobjectives,动物实验设计概论,一般来说，动物实验的研究工作应该明确描述：研究的目的和/或者需要验证的假说。选择特定动物模型的原因。动物种、品系、来源和类型。每个独立实验步骤的详细描述，包括研究设计和使用动物数量。数据分析所用的统计学方法。,动物实验设计的意义一、正确的动物实验设计对提高科学研究质量、发表高水平的学术论文非常重要二、目前许多动物实验质量不高1、动物质量不高,低级别动物给实验结果的科学性带来影响。2、实验设计和统计学分析能力有限三、一个好的实验设计，对统计学分析来说帮助很大，可以使问题变得更加容易解决四、一个不正确的实验设计，导致结果信息无用。,动物实验设计概论,动物实验设计概论,动物实验的分类1、确证性的实验：用一种最大可能,正确解答问题的系统方法，收集有关处理实施后动物反应的科学数据。2、探索性的实验：为产生新的假说提供素材。这两类实验都涉及在实验人员的控制下，对动物施加一定的处理或操作，来发现是否处理在实验对象上引起一定的反应，或者对这种反应进行定量。3、检验性实验：是观察性的实验，用于发现科研人员不能控制的变量之间的联系。这种联系可能是暂时的也可能是长期的。,实验设计的主要目的一是保证所测变量的任何差异是由处理造成的，而不是其他非对照变量引起；另一个目的是通过控制确定的变量在尽可能小的范围内，减少所测反应的变异性，这样对处理效应的评介更准确。,动物模型应用的重要步骤一、动物实验通常是研究某种类、品系或性别动物的生物学特性，并间接推断人或其他研究对象的相关方面。二、3个重要方面1、基于对研究对象和模型（候选）动物中疾病发展方面掌握的已有知识2、进行一个或多个实验，观察模型对所实施的处理如何反应3、考察模型实验的结果与研究对象物种的相关性,动物实验设计概论,3R原则一、减少NO.1Reduction二、替代NO.2Replacement三、优化NO.3Refinement,动物实验设计概论,差异的控制,进行动物试验设计时，需要考虑的一个重要控制因素就是实验中的非研究目的差异。1、遗传引起表型差异(遗传学质量控制）2、其他原因，例如：分组因素、饲养条件微小变化3、在实验中引入了太多的背景噪音,差异的控制,一、概述有机体的形态行为特征要适应环境，正是这种适应的不同导致有机体产生个体之间的差异，因而，动物的适应性的倾向对一个精确的实验设计来说是不可回避的挑战。生物学的观察是在一个可变背景上进行的1、生命形成的化学过程复杂2、生命适应环境不停的变化，稳定性差（差异大，所用数量多）差异的来源1、实验者2、动物固有3、动物所处环境相互作用产生的差异,差异的控制,二、实验者带来的差异1、实验过程的实施实验操作的一致性、准确性、完整性：A:每只动物更换注射器B:注射器容量，精确C:根据称重给药（吸入药品后注射器重量-空注射器重量=剂量）D:良好的操作技术（避免给药时，药物溢漏）实验操作的小心，减少动物紧张情绪：A:代谢B:血流（影响血流速度，从而影响药物的吸收率）,差异的控制,二、实验者带来的差异2、不准确的测量A：尽管现在的测量手段越来越先进，但是有些方法本身就存在缺陷。例如：凝胶电泳（点和带的迁移率、密度、大小受很多微妙因素影响）；光密度扫描（色彩的饱和度可以使结果呈现非线性）B:观察动物自然行为的测量，控制更困难。例如：采用多个不同观察人员，数据交换分析数据。一个连续的时间点，重复观测。,差异的控制,二、实验者带来的差异2、不准确的测量C:动机状态观察专业观察人员，采用同一标准。行为类型被分解成更加数量化的组分。动物不同行为分解为元素，采用同一打分系统。D:整体动物进行实验时，行为学和生态学观测的差异是可以控制的GLP(goodlaboratorypractice)，最根本的基础是实验中得到的数据和信息的可信性是通过人员的工作质量来保证和实现的。实验观察的每一个步骤，必须按照SOP（standardoperatingprocedure)的文本执行。,差异的控制,三、固有动物之间的差异动物之间除了遗传组成的差异外，许多其他方面的影响也能增加动物间的差异，是我们进行试验设计时需要加以重视和考虑的差异来源。1、动物来源不同2、动物饲养管理的差别3、动物生活环境的不同：4、动物健康状况温度：排气口的温度高34度湿度：排气口湿度高5%10%光线：不同层面，感受光线不同声音：2040HZ,交配推迟，产仔低垫料：松木和桉木可以引起大动物肝脏酶活性和细胞毒效应的物质。,差异的控制,四、动物与环境之间相互作用引起的差异1、动物对环境应激或应激的生理反应、行为反应和生化反应使用环境丰富物，增加生存环境的复杂性，减少应激。2、群居群居体重差异小，等级明显，丰富物（改善还是恶化）,差异的控制,四、动物与环境之间相互作用引起的差异3、动物与实验操作过程之间相互作用诱发产生的差异是存在的动物对不同饲养者表现不同，人员保持一致实验时间和饲养程序的之间的关系：更换笼盒前后给药不同效果，给药顺序不同，同样引起差异动物发出信号控制这类差异最有效的方法：A:确保操作人员的熟练程度B:开始实验前动物适应过程C:给动物奖励,动物实验设计的内容和步骤,一、实验设计的最初步骤1、查阅文献A:明确研究焦点B：明确方法C：明确模型D：评估实验,2、科研方法A：观察和描述科研中的现象B：系统的陈述问题和解释问题的假说C：利用假说预测新的观察结果D：验证假说,动物实验设计的内容和步骤,一、实验设计的最初步骤3、问题的陈述、研究的目标和提出假说问题提出：实验将说明的问题是什么，意义研究目标：总目标，特殊问题假说：对每一个至少给出两个预计结果,动物实验设计的内容和步骤,一、实验设计的最初步骤、动物模型的确定使用系统发育水平最低的动物，符合原则使用的动物具有研究要求种属或品系专一特点，特定研究目的必须特点实验期间动物模型维持条件动物模型来源渠道最终确定动物模型前征询实验动物兽医意见,动物实验设计的内容和步骤,一、实验设计的最初步骤、实验合作者的确定在研究的过程中，明确应用的试验技术操作，并确认具有相应操作专长的人员来完成。让合作者了解实验：设计、计算、样品收集实验动物中心可以提供动物实验有关技术操作培训及昂贵设备服务,动物实验设计的内容和步骤,二、动物实验设计、研究方案根据问题、目标、假说，提出实验操作安排的计划并文字化考虑的方面：A：动物模型持续时间B:模型中预期疾病的进程（决定测定的最适时间点）：人员参加的时间，实验花费：给药方法：风险评估：统计学方法选定,动物实验设计的内容和步骤,二、动物实验设计、实验单元可以是一个动物，也可以是一组动物群体、因子；实验组别的动物只数将适当数量的动物分配到每一个实验组别每一个实验组别动物数量是通过预期各组接过差异的可能程度和采用统计学的方法计算出来的一个标准笼盒能够容纳动物的数量,动物实验设计的内容和步骤,二、动物实验设计、对照过多的变量（如遗传、环境、感染因子）对动物试验的结果产生影响，因此为消除这些外来变量或可能存在的未知变量的影响而设置对照动物。对照种类：阳性对照阴性对照空白对照媒介物对照比拟物对照,动物实验设计的内容和步骤,二、动物实验设计阳性对照：一般在阳性对照组希望有变化作用：作为一个标准，测量各实验组间差异的程度。例如：毒物试验，动物给予毒物作为对照，结果是产生损伤或变化阴性对照：期望有正常状态不产生变化作用：保证未知变量对实验组动物引起相反的效应不存在，即排出假阳性,二、动物实验设计空白对照模拟处理组的过程而实际上没有给予动物以受试物或处理。移植或损伤媒介物对照在测试化合物溶于一种媒介时，这种媒介需要对照作用：观察溶剂是否引起反应比拟物对照与阳性对照性质一样，使用一个已知的处理来对比待测的处理例如：药物治疗，使用一种已知临床药物，对比实验药物。,动物实验设计的内容和步骤,二、动物实验设计、动物分组的随机化动物实验时必须把动物随机分配到实验各组，以确保研究的变量在每一组中不会导致偏差数据。必须在选择的时候选定同源的动物群体，生物学特性一致的动物方法:A：每一只动物一个编号，1第一组，2第二组暗箱抽取B:动物多可以利用数字随机或计算机程序随机,动物实验设计的内容和步骤,三、实验设计的最后考虑实验设计完成后要进行进一步的确认和审查，并在正式实验前进行小规模的预实验，初步检验设计的合理性，并为进一步的完善提供依据。1、实验步骤地确定实验开始前必须通过IACUC和实验动物伦理委员会的确认。包括动物饲养管理和使用的具体操作方法按照相关法律提供申请书时，需要相关证明实验涉及到危险品，还需要其他委员会的批准,动物实验设计的内容和步骤,三、实验设计的最后考虑2、人员必须有相关培训人员才能承担实验我国由省级科技主管部门进行培训,动物实验设计的内容和步骤,三、实验设计的最后考虑3、小规模的预实验小规模的预实验是使用少量的动物得到预示性的数据或通过预实将操作和技术固定并完善，以便于进行大规模的正式实验通过预实验确定实验动物用量证明实验合理性预实验同样需要经过IACUC同意,动物实验设计的内容和步骤,三、实验设计的最后考虑4、数据的输入和分析实验设计时应该规定在数据分析前，制定保证数据质量的措施和程序，确保实验后数据收集或输入发生的错误能被及时辨别出来。5、讨论实验设计完成后广泛征求意见,动物实验设计的内容和步骤,样本大小的确定,在实验设计中确定样本大小十分重要A：满足科学研究需求B：符合实验动物法律法规C：符合3R原则由于科研目的的不一样，采用的实验动物种类也不一样，计算实验样本大小的方法也就不一样。,样本大小的确定,一、小规模预实验原因：实验前缺乏资料信息或实验成功是否能够把握有些实验无法计算样本大小（转基因动物实验）一般实验，复杂的统计学设计都可以简化成一个重要事件的比较样本量足够大可发现统计学的结果检查所要进行实验的必备条件,样本大小的确定,二、基于目标成功或失败的实验由于实验中成功的机会相当不稳定，因此这类实验所用的动物数量很难确定例如：转基因动物DNA整合率移植后受精卵的着床率整合位置和表达效果假定每个步骤地效率5%根据公式这需要50只动物，如果1%则需要300只动物。,样本大小的确定,三、验证假说的正式实验大多数实验属于检验一个假说的正式实验，一般使实验都可以得到一些有用的信息，可以用来计算实验所需要的动物数量。在这类实验中，一般科研人员可以测定三种类型的变量：二分变量：表现为是否的结果百分率，比如死亡率。：连续变量：某一物质在体液中浓度或生理功能（如血流速或尿量）：一个事件的发生时刻：疾病或死亡出现的时间。,样本大小的确定,、确定检验的假说假说可以简单的归结成一个或几个问题，两组或几组数据的比较组间差异越小或群体变异越大，观察到显著性差异的样本量肯定越大,样本大小的确定,、效应大小、标准误差、力度和显著性水平计算样本大小需要个已知因素：效应大小：一般为两组之间的差别：对连续性变量而言的群体标准误差（）：测定假定效应的期望力度：显著水平,样本大小的确定,为避免偏差假定动物被随机分配到不同的测试组，饲养在相同的环境中，这时实验的力度是指实验效应被测出的概率，一般为或，即科研人员在假定效应存在的情况下，有或机会发现统计学意义上的结果。减去力度（）得到的是假阳性结果的概率，即不能拒绝否定一个不真实无效假说或不能测得某特定处理效应的概率。阳性结果的规定概率即显著性水平（），一般为或。换句话说，科研工作者错误表明差别“差别”的机会不大于或一旦力度值和显著性水平选定，统计学模型选定，然后根据研究者期望效应和群体因子，就可以计算出实验所用样本的大小。,样本大小的确定,、二分变量数据的样本大小计算比较两组某特定变量的百分率，只要给出力度值、显著性水平和想测出的差别。Pc:对照组中某事件发生的百分率Pe:实验组中某事件发生的百分率qc=1-Pcqe=1-Ped=PcPe之间的差别C：一个常数，根据而定，查表可得,0.050.010.87.8511.680.910.5114.88.,例：某一品系大鼠老年时肿瘤发生率20%。实验时经某种化学物质处理后了老年时肿瘤发生率增加到50%。探测到这种增加的概率为80%，测试是在P=0.05的显著水平进行（即力度为0.8,a=0.05),查得常数等于C=7.85Pc=0.2Pe=0.5qc=1-0.2qe=1-0.5d=0.3C=7.85,样本大小的确定,4、连续变量数据的样本大小计算有很多实验是需要测量连续变量，可以通过比较变量平均值的差别达到比较组间差别的目的。这种情况下给定：力度，显著性水平，平均值差别的大小，群体变异性或群体平均值的标准误差，就可以计算出样本大小。S:变量群体的标准误差值d：研究者的期望得到的效应水平（期望得差别）：常数,例：大鼠在某一年龄的平均体重400g，SD=23g，某一减少食欲的化学物质试验后大鼠体重减少20g，并且有90%具有此现象，显著水平为5%，查得常数为10.51。,样本大小的确定,如果实验是在同一只动物身上处理前后和处理后的值，可用以下公式计算,样本大小的确定,、单组实验样本大小计算如果实验是确定一个事件是否已经发生，比如：一个病原体在动物群体中是否存在：选择的力度（通常为和）：是非感染动物的百分率,样本大小的确定,例如：如果动物被感染，并且研究者希望有的把握检测出感染，那么所需要的动物样本量是：即总共需要只动物做实验，就有的把握在一个动物感染的群体中检测出感染。如果感染流行低，如果只有，那么根据公式大约需要只动物。,样本大小的确定,、给某一事件定时的样本大小计算两种方法：利用在两组某固定时刻事件发生的百分率来估算样本大小，然后将时间对应事件转换成二分量：将事件对应发生的事件作为连续变量处理,样本大小的确定,、关于样本大小计算中的注意事项网站：,、关于样本大小计算中的注意事项网站：,动物实验设计、分析和解释中辅助变量的应用,在动物实验过程中除了实验者特定研究的主要反应变量外，也常常记录许多其他变量。如年龄、几个时间段的体重、食物和水消耗、血液学特征及临床生化特征等。这些附加的变量在动物实验的设计和解释中具有特殊和重要的作用，在设计和分析中可以增加实验的精确度和力度。,动物实验设计、分析和解释中辅助变量的应用,这里的辅助变量与统计学中的辅助变量不一样，一般是指除实验中限定或目标反应变量外，可以收集的其他变量的总称。,动物实验设计、分析和解释中辅助变量的应用,一、实验设计中辅助变量的应用动物实验中所用动物都是相似的，那么动物数量从1到最大随机分配处理就可以达到实验设计的主要目的（保证所测变量的任何差异是由处理造成而不是其他非对照变量引起）但是实验动物已知或从外观特征（如年龄、体重、性别等）知道有明显区别，那么如果不将这些特征引入到设计当中就会增加反应的变异性，其后果是无法区分处理的效