流式细胞仪数据分析.doc

。工作条件：1.1电源要求:220V (10%)、50HZ（10%）1.2环境温度:5-351.3在相应湿度10-80%的环镜下工作2. 设备用途：细胞分析和分选功能2.1分析功能：2.1.1细胞周期测定，DNA含量分析，RNA测量与分析2.1.2细胞凋亡检测，2.1.3蛋白质总量测定，2.1.4生物活性的测定，2.1.5细胞內钙离子流动试验，Ca2+浓度测定，细胞内pH值测量，2.1.6细胞內Oxidative Burst代谢产物，细胞表面电荷检测。2.1.7抗原特异性免疫细胞的检测、分选和细胞治疗技术2.1.8检测细胞因子，可溶性荧光蛋白等*2.2细胞分选流式一体化分选功能，采用捕获管技术，分选速度300个细胞/秒，分选纯度98%3. 技术规格：3.1主机系统*3.1.1流式细胞仪主机系统：含15mw 488nm氩离子蓝色激光器，635nm红色激光器，4个荧光探测器和2个散射光探测器*3.1.2光路: 双激光立体空间激发方式实现四色荧光分析：488nm激光器激发的三色荧光,635nm激光器激发第四色荧光.采用测向光路设计*3.1.3滤光片：488nm激光的荧光通道包括530/30nm、585/42nm、670nm LP；635nm激光的荧光通道：661nmLP*3.1.4可选用荧光： FITC, PE, PerCP,PI, PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, PE-Cy，APC, Rhodamine, Cyanine等*3.1.5必须配流式一体化分选系统3.1.6光电倍增管:光谱检测范围300nm-1100nm 电压150V-990V3.1.7荧光检测灵敏度:100MESF3.1.8全峰宽变异系数:CV2%3.1.9样本获取速度:10，000个细胞/秒3.1.10检测颗粒大小: 0.1um(min)-50um（max）3.1.11最少样本体积：100l3.1.12流动室孔径：430um X 180um3.1.13自动抽吸系统: 换样时自动吸去管道内剩余样本，避免样本之间的相互干扰*3.1.14脉冲处理系统:能同时分析脉冲信号峰值、脉冲积分（面积）及脉冲宽度,用脉冲宽度和面积区分双连体细胞（如假四倍体细胞）3.2 数据处理系统苹果MAC Pro 工作站3.2.1 CPU: 双核，主频 2.8G3.2.2 内存：2G3.2.3 硬盘：容量 300G3.2.4 独立显卡3.2.5 光驱：DVD-ROM, CD-RW3.2.6 显示器：19英寸液晶显示器3.3 应用软件3.3.1全自动仪器校正软件3.3.2多功能流式应用软件3.3.3 DNA分析软件 4资料4.1有仪器全套电路图及中文操作手册4.2有中华人民共和国医疗器械注册证工作条件：1.1电源要求:220V (10%)、50HZ（10%）1.2环境温度:5-351.3在相应湿度10-80%的环镜下工作2. 设备用途：细胞分析和分选功能2.1分析功能：2.1.1细胞周期测定，DNA含量分析，RNA测量与分析2.1.2细胞凋亡检测，2.1.3蛋白质总量测定，2.1.4生物活性的测定，2.1.5细胞內钙离子流动试验，Ca2+浓度测定，细胞内pH值测量，2.1.6细胞內Oxidative Burst代谢产物，细胞表面电荷检测。2.1.7抗原特异性免疫细胞的检测、分选和细胞治疗技术2.1.8检测细胞因子，可溶性荧光蛋白等*2.2细胞分选流式一体化分选功能，采用捕获管技术，分选速度300个细胞/秒，分选纯度98%3. 技术规格：3.1主机系统*3.1.1流式细胞仪主机系统：含15mw 488nm氩离子蓝色激光器，635nm红色激光器，4个荧光探测器和2个散射光探测器*3.1.2光路: 双激光立体空间激发方式实现四色荧光分析：488nm激光器激发的三色荧光,635nm激光器激发第四色荧光.采用测向光路设计*3.1.3滤光片：488nm激光的荧光通道包括530/30nm、585/42nm、670nm LP；635nm激光的荧光通道：661nmLP*3.1.4可选用荧光： FITC, PE, PerCP,PI, PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, PE-Cy，APC, Rhodamine, Cyanine等*3.1.5必须配流式一体化分选系统3.1.6光电倍增管:光谱检测范围300nm-1100nm 电压150V-990V3.1.7荧光检测灵敏度:100MESF3.1.8全峰宽变异系数:CV2%3.1.9样本获取速度:10，000个细胞/秒3.1.10检测颗粒大小: 0.1um(min)-50um（max）3.1.11最少样本体积：100l3.1.12流动室孔径：430um X 180um3.1.13自动抽吸系统: 换样时自动吸去管道内剩余样本，避免样本之间的相互干扰*3.1.14脉冲处理系统:能同时分析脉冲信号峰值、脉冲积分（面积）及脉冲宽度,用脉冲宽度和面积区分双连体细胞（如假四倍体细胞）3.2 数据处理系统苹果MAC Pro 工作站3.2.1 CPU: 双核，主频 2.8G3.2.2 内存：2G3.2.3 硬盘：容量 300G3.2.4 独立显卡3.2.5 光驱：DVD-ROM, CD-RW3.2.6 显示器：19英寸液晶显示器3.3 应用软件3.3.1全自动仪器校正软件3.3.2多功能流式应用软件3.3.3 DNA分析软件 4资料4.1有仪器全套电路图及中文操作手册4.2有中华人民共和国医疗器械注册证流式细胞仪数据分析5.1 数据采集及显示 光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。 流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。 4参数（FSC，SSC，FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。 数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。 图5-1 流式数据分析图双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。 习题：数据采集及显示 1 在直方图中横轴和纵轴分别表示 。 2 二维点图用于显示 参数。 3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表 。5.2 设门 通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。 图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图 习题：设门 1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。（对 错）5.3 细胞亚群的数据分析 数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。 如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。 图5-3 选定淋巴细胞亚群设门 门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。 我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。 直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（见图5-4）。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3 FITC阳性峰。图5-4 阴性对照峰M1（NORM001）和CD3 FITC阳性峰M2（NORM002） 图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。其中M1（阴性）细胞619个，M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%。 图5-5 直方图统计结果 二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图5-6为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE），左下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3 FITC），右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。 图5-6 阴性对照组(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE双染样本(NORM002) 如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839=10.43%。 图5-7 散点图统计结果 另一个分析方法是划定区域，也就是设门。我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图5-8所示）；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%。图5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图 图5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果 这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。 为避免这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析（cluster analysis）的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（见图5-10）。 图5-10 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比 5.4 流式细胞仪的其它应用以及数据分析 这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。 如图5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。每个峰的几何均值分别为2，5和20（从左至右）。图5-11 单细胞株分析图 除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子（接合子）定量分析。QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。如图5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。 图5-12 使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数 我们使用ModFit LTTM软件进行DNA定量分析。因为DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是离散的，所以我们对曲线以下的面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。 图5-13 细胞周期的DNA直方图 习题：数据分析 1二维点图和一维直方图的作用分别是什么？ 2 见图5-4和图5-5，CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少。 3 LL象限代表双阳性细胞亚群。（对 错） 4 见图5-6和图5-7，淋巴细胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。 5 只能使用矩形设定细胞区域范围。（对 错） 6 使用区域设定法分析样本有哪些不足。 7 避免细胞亚群移动的分析方法是什么。 8 在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率。5.5 CellQuest和CellQuest Pro软件使用 CellQuest和CellQuest Pro软件是目前运用最为广泛的流式细胞仪采集及分析软件。它运行于苹果电脑上，优质的矢量图显示使得操作界面特别优美。现最新的微软公司的Vista软件也是仿苹果操作系统界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro时的强大功能及视觉质感。CellQuest和CellQuest Pro软件主安装在BD FACSCalibur型流式细胞仪上。1软件数据流程 在CellQuest和CellQuest Pro软件的数据流分为二个部分：方案和数据包。方案是指用户可以建立采集或分析所需的直方图或散点图、设门并定义门与门、门与图之间的逻辑关系。可以使用方案进行数据采集或分析以往已有的数据。每个采集方案分析样本后会生成数据包，该数据包中包括了样本中每个颗粒在各个检测参数上的数值，格式为FCS2.0或FCS3.0。CellQuest和CellQuest Pro方案文件的图标CellQuest和CellQuest Pro数据文件的图标CellQuest和CellQuest Pro软件中还会有关于仪器设置的文件，保存所有的实验条件。它只能由CellQuest和CellQuest Pro软件打开。数据包必须由方案文件打开，无法单独显示，或者可由第三方软件进行分析，如WinMDI。2.软件与仪器的连接 流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。1、 先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。2、 在苹果菜单下点击CellQuest和CellQuest Pro软件。3、 从Aquire菜单下选择connet to cytometer。3方案与数据之间的关系CellQuest和CellQuest Pro软件的方案与数据相互独立保存，数据包可以由任一方案文件进行分析，分析后不改变数据包中的任何数据。CellQuest和CellQuest Pro软件中方案内的直方图或散点图有三种状态：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。当图的属性为Acquire时，此图只限于采集下用，即只当进行检测时它才能显示颗粒；当图的属性为Analysis时，此图只限于分析已保存的数据包，它不能用于采集数据。当图的属性为Acquire-Analysis时，此图即可用于采集数据也可用于分析已有数据。所以方便起见，我们一般将方案中的直方图或散点图全部设为Acquire-Analysis属性。CellQuest Pro CellQuest4方案的建立A选择实验参数默认情况下，FACSCalibur流式细胞仪开机后只打开一根激光器，及五个参数供选择使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3。当我们要使用第二根激光器及FL4通道时需要勾选FL4的选项，仪器自动打开633nm激光器。选择Four Color后，仪器自动打开第二根激光器，且此时FL4可用。B,建立散点图或直方图，命名坐标CellQuest Pro软件主要工作界面，软件类似于Office word的工作面，可在A4大小的页面上进行编辑建立各种直方图或散点图。使用工具条可以建立散点图、直方图并在图上设立各种门。在CellQuest Pro软件中，如果Inspector窗口开着的话，选中任意直方图或散点图就会出现该图的属性，其中包括有X、Y轴的参数、是否多色显示、图的分析或采集属性等等。 在CellQuest软件下，需在选择Plot菜单，选择Format来打开图的属性对话框，其中包括了关于该图所有选项。建立好直方图或散点图后，我们需要对所选的参数进行命名，如不修改软件自动命名为FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。在菜单上选择Acquire栏目，选择Parameter Description，可出现关于文件存储和参数命名的对话框。在这个对话框中用P字母来代表每个参数，并在此对每个采集参数进行命名，FL1为CD3FITC，FL2为CD4PE。C,设门并建立门与图之间的关系在工具栏上有左侧几个按钮可分别矩形门、自由门、线性门、圆形门和自动门。本处重点介绍Snap-To门，它可根据细胞群体的分布自动调整门的形状适应细胞群体。R与G的关系R是Region的首个字母，Region一般是指一个闭合形的区域，如矩形区、自由区和圆形区。区域与区域之间可以进行逻辑运算，如AND、OR、NOT等关系。当区域进行运算时软件引进了算术公式的管理概念：Gate实际了个