本科毕业论文-细胞—遗传学基础实验技能训练.doc

细胞遗传学基础实验 技能训练学 院 生命科学与生物制药学院专 业 生物科学 年 级 2012 学生姓名 刘燕桢 学 号 1209503109 指导教师 陈珺 2014年 6 月 5 日目 录摘要1前言11.土人参原生质体的制备、培养及植株再生 21.1土人参细胞悬浮培养体系的建立 21.2土人参原生质体的制备、培养及植株再生 32.土人参愈伤组织的紫外线诱变及植株再生 43.秋水仙素诱发土人参多倍体及植株再生 44.非洲紫罗兰花药培养及植株再生 55.土人参再生植株的遗传分析 55.1土人参再生植株的染色体检测55.1.1染色体标本的制备和观察 65.1.2染色体核型分析 76.实验结果与分析76.1. 土人参细胞悬浮培养系的建立 76.2.土人参原生质体原生质体在等渗和低渗环境中的观察 76.3.土人参愈伤组织的紫外线诱变 96.4经秋水仙素诱发土人参多倍体96.5非洲紫罗兰花药培养后得到的观察 106.6对土人参再生植株进行核型的分析 10结束语 11参考文献12摘 要本实验通过细胞学与遗传学的合并实验来提高学生的实验基础技能，培养把各科知识系统地结合起来，运用到实际操作中。其方法是建立土人参悬浮细胞体系，制备培养土人参原生质体，用秋水仙素诱发土人参多倍体及植株再生和对紫罗兰进行花药培养及植株再生；结果得到了经过秋水仙素诱导的多倍体土人参和由花药培养得到的单倍体紫罗兰。通过该实验，掌握了在细胞水平上进行遗传改造的方法与技巧，也深刻体会到遗传改造的意义所在，得出可在细胞基础上进行遗传改造的方式去探索出生物遗传和变异规律的结论。关键词：土人参；多倍体；紫罗兰；花药培养前言本次实验以遗传学和细胞生物学两门学科的部门部分知识交叉点为理论基础，以土人参与紫罗兰为基本材料，运用细胞培养技术和植物体的理化诱变方法在无菌条件下对其进行遗传改造。以细胞作为生命活动的基本单位为出发点，探索生物遗传与变异的规律。不仅验证了两门学科中的理论知识，学习到相关的实验技术，而且也加强了对学生综合能力的和科学思维的培养，达到学科之间交叉学习，加深认识的作用。1. 非洲紫罗兰花药培养及植株再生1） 实验材料非紫罗兰未开放的花蕾2） 实验器材与试剂A.实验器材超净台、眼科镊2把、9cm培养皿、枪状镊、载玻片、盖玻片、酒精灯、显微镜等。B.试剂a)培养基 MS培养基（见专题2-1）分化培养基 MS + 1mg/L 6BA+ 0.1mg/L NAA）生根培养基 1 /2MS + 0.2mg/l BAb)乙醇：95%、85%、75%、70%c)0.1%升汞溶液（或10%的次氯酸钠溶液）d)卡诺氏固定液e)1mol/LHCLf)改良苯酚品红染色液4）实验步骤A.选材未开放的紫罗兰花蕾。B.材料消毒剪下未开放的紫罗兰花蕾，置75%酒精中浸泡1min，取出后在无菌条件下除去花萼和花瓣并取出花药，用75%酒精浸泡花药10秒，无菌水清洗3次后， 再用0.1%的升汞溶液浸泡8min，然后用无菌水冲洗78次，去除残留升汞。C.花药接种和培养将消毒过的花药植于固体培养基上，置25、暗培养20d左右，花药膨大并长出愈伤组织，观察记录其形态特征。 D.继代培养将愈伤组织转移至光照培养，光强度为2000lux、12h/d，1520d。E.植株再生将愈伤组织转接到分化培养基继续继代培养, 20d左右长出芽，再转接到生根培养基上继续培养。2. 秋水仙素诱发土人参多倍体及植株再生1） 实验材料土人参愈伤组织2） 实验器材、试剂A.器材分析天平；普通显微镜；培养瓶，镊子，解剖刀，烧杯，广口瓶，电磁炉，高压锅等B.试剂a)MS培养基 b)秋水仙素固体培养基 MS培养基 + NAA 0.01% + 6-BA 0.1%，混匀后，调pH至5.86.0，加热至见气泡冒出，迅速将秋水仙素、蔗糖3%和琼脂0.5%倒进培养基中，快速搅拌至培养基澄清，迅速分装至培养瓶中，25ml/瓶，冷却凝固后，高压灭菌。c)生根固体培养基 1/2MS + 2mg/L NAA，混匀后，调pH至5.86.0，加热至见气泡冒出，迅速将活性炭0.1、蔗糖3%和琼脂0.5%倒进培养基中，快速搅拌至培养基澄清，迅速分装至培养瓶中，25ml/瓶，冷却凝固后，高压灭菌。d)其它无水乙醇，冰乙酸，改良苯酚品红染色液3)实验步骤a)取材 用枪状镊夹取同一团愈伤组织上浅黄或浅绿色半透明状、结构疏松且表面有多量绿色细小芽点的愈伤组织块，大小约1cm3，置于9cm培养皿上。b)接种及诱变 用两把眼科镊子将愈伤组织轻轻掰开成3mm3颗粒状，平分2份，一份设为对照组，接种至愈伤组织诱导培养基中；另一份设为实验组，接种至含秋水仙素30mg/L的固体诱导培养基中，进行秋水仙素诱变，两组均置于25，暗培养15d。c)植株再生 分别将对照组和实验组余下1/2量的无菌苗转至接到不含秋水仙素的同一瓶愈伤组织分化培养基（注意做好标记），转至光照培养，25，光强度2000lux、12h/d，约15d长出须根。3. 土人参原生质体的制备、培养及植株再生3.1土人参细胞悬浮培养体系的建立1) 实验材料用土人参嫩叶叶片作为外植体诱导愈伤组织；用疏松愈伤组织进行细胞悬浮培养。2) 实验器材与试剂A. 实验器材超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、胶头吸管、接种盘、手术刀等。B. 试剂a) 固体诱导培养基 MS培养基 + NAA 0.5 mg /L + 6-BA 2 mg/L，混匀后，pH将至5.86.0，加热至见气泡冒出，迅速将蔗糖3%和琼脂粉0.65%倒进培养基中，并搅拌至培养基澄清，迅速分装至培养瓶中，25ml/瓶，冷却凝固后，高压灭菌。b) 悬浮细胞培养基 改良的MS (即大量元素中NH4+减半，Ca+加倍 ，其余不变） + 2mg/L 2,4-D + 0.5mg/L KT + 2mg/L NAA + 3蔗糖3) 操作步骤细胞的悬浮培养及继代培养取材 在超净工作台上，用15cm枪状镊子夹取同一块愈伤组织上浅黄或浅绿色半透明状、结构疏松且表面有多量绿色小芽点的愈伤组织块约1cm3，置于9cm培养皿上，再用两把眼科镊子将其轻轻掰成约3mm3的颗粒状。洗涤 将小颗粒状愈伤组织夹入预装有愈伤组织悬浮细胞培养基20ml的100ml锥形瓶中，用硅胶塞封口，置恒温摇床，25、60-80r/min，黑暗下震摇1小时后取出，静置，让颗粒团块自然下沉，用吸管吸干液体，目的是清除愈伤组织中残留的杂质。 悬浮培养 往洗涤后的愈伤组织中加入20ml悬浮细胞培养基，置恒温摇床，25、60-80r/min、黑暗下培养至第15d.继代培养 取出锥形瓶静置一会儿，让颗粒团块自然下沉，用滴管把细胞悬浮液加到已经高压好的100ml锥形瓶中，再添加等量的液体培养基（约15ml），置恒温摇床,25，60-80 r/min，进行继代培养15d。3.2土人参原生质体的制备1） 实验材料在实验3.1中得到的土人参细胞悬浮液2） 实验器材与试剂A.仪器胶头吸管、100ml锥形瓶、纱布、15ml和50ml离心管、接种镊子、试管架、9cm培养皿、恒温摇床B.试剂a)0.1%升汞 称取0.5g氯化汞，加500ml单蒸水。b)酶液酶解缓冲液 CaCl22H2O 1320mg/l, KH2PO4H2O 100mg/l , MES 0.1 , Mannitol （甘露醇） 0.25mol/L混合酶液 纤维素酶（celluase onozuka R-10）4和果胶酶Y23（Pectolyse Y23）0.5溶于酶解缓冲液中，不断搅拌至完全溶解后，离心4000rpm/min，5 min，吸取上清液， 0.25或0.4m滤器中过滤除菌，得到纤维素酶：果胶酶= 4:1混合酶液。c)原生质体培养液 改良的MS (即大量元素中NH4+减半，Ca+加倍 ，其余不变） + 2mg/L 2,4-D + 0.5mg/L KT + 2mg/L NAA + 4甘露醇d)固体诱导培养基 MS培养基 + NAA 0.5 mg /L + 6-BA 2 mg/L，混匀后，调pH至5.86.0，加热至见气泡冒出，迅速将蔗糖3%和琼脂粉0.65%倒进培养基中，并搅拌至培养基澄清，迅速分装至培养瓶中，25ml/瓶，冷却凝固后，高压灭菌。4)实验步骤A.取材 取“专题2-1土人参细胞悬浮培养体系”实验中继代培养15d后的培养液5-10ml，置15ml离心管中，离心500r/min，3min，缓慢倾去上清液后，离心收获细胞。B.酶解用移液枪缓慢加入5ml混合酶液悬浮细胞，并缓慢吹打均匀细胞，用封口膜封口，用锡箔纸包裹，置恒温摇床，25，4060r/min，轻摇酶解2h。C.洗涤将细胞酶解液以500r/min，3min离心后，去上清，沿管壁缓慢加入原生质体培养液5ml，用手指轻弹，500r/min，3min离心，倾去上清液，用原生质体培养液2ml重悬洗涤后的细胞。取500L至1.5ml离心管中，进行以下的细胞计数、原生质体观察及得率计算及原生质体活力测定。D.细胞计数取10L至细胞计数板进行细胞计数。用原生质体培养液将细胞浓度调整至5104个/ml，用于原生质体培养。4.土人参再生植株的染色体检测4.1 愈伤组织染色体标本的制备和观察 1）实验材料 土人参疏松愈伤组织 2）实验器材与试剂 A.器材 培养箱、显微镜、剪刀、镊子、刀片、培养皿、滤纸、吸水纸、青霉素瓶、染色缸、载玻片、盖玻片、玻璃板、酒精灯。 B.试剂1.0.1%秋水仙素液 秋水仙素粉0.01g溶于单蒸水10ml。2.卡诺氏液 3. 6mol/L盐酸4.甲醇 5.冰乙酸6.醋酸-洋红染液 取45毫升冰醋酸，加蒸馏水55毫升，煮沸后徐徐加入洋红1克，搅拌均匀后加入1颗铁锈钉，煮沸10分钟，冷却后过滤，贮存在棕色瓶内。 3) 操作方法（压片法）从再生植株根尖切取根尖分生区，或者从培养愈伤组织中夹取绿豆大小的翠绿色愈伤组织，如下操作：1.预处理 把根尖或愈伤组织放进15ml离心管中，再往离心管中加入5ml 0.1%秋水仙素液，盖上盖子，暗处理22小时。2.固定 取出根尖或愈伤组织，用蒸馏水洗4次，经卡诺氏固定液固定30min。3.解离 取出根尖或愈伤组织，用蒸馏水洗4次，往离心管中加入1mol/L HCL，在60水浴解离8min。4.染色 取出根尖或愈伤组织，用蒸馏水洗4次，用醋酸洋红染色液染色30min。5.压片 把根尖或愈伤组织置于载玻片上，加一滴染液，用镊子捣碎，盖上盖玻片后放上一滤纸，用铅笔上的橡皮头轻轻敲打盖片，使细胞和染色体分散。6.镜检 显微镜下观察染色体的形态和数目。4.2染色体核型分析 1)实验材料马齿苋科 PORTULACACEAE土人参属 Talinum Adans.土人参 Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn. 2)实验器材与试剂剪刀、镊子、刻度尺、胶水等3)操作方法A.染色体制片后，显微照相，再放大（将上图放大，见附录2）。B.测量：染色体长度。 C.计算：相对长度、臂比（率）、着丝粒指数。D.配对：根据形态特征E.排列：a.长度：从大到小；b.臂比：从大到小；c.特殊的染色体最后。F.剪贴：细剪，按顺序从大到小，短臂在上，着丝粒于同一水平线，贴图。5.实验结果与分析5.1 非洲紫罗兰花药培养及植株再生 图1. 3月26日花药培养情况 图2. 4月2号花药培养情况 图3. 4月10号花药培养情况 图4. 4月23号花药培养情况 图5. 4月30号花药培养情况 图6. 5月7号花药培养情况 图7. 5月14号花药培养情况结果与分析：从图1、2、3可知，花药在开始的一个月内几乎没有什么变化，发育较缓慢，可能与品种或花药的数量有关，生长力顽强的植株发育得快，花药数目多的植株生长发育的概率高。从图4,4月23号起，生长速率加快，可以看到有绿色小颗粒状的愈伤组织生成，然后到图5、6的大颗的愈伤组织，最后可以收获图7中的有点开始分化的愈伤组织，再培养下去有可能的得到一棵完整的非洲紫罗兰。图中的两颗花药的生长情况有所不同，左边的愈伤组织呈黄绿色，发育不太好，右边的愈伤组织为翠绿色，发育良好，造成这种差异的原因可能是每颗花药生长所需要的环境有所不同，可能这个环境更适合右边的愈伤组织生长。5.2秋水仙素诱发土人参多倍体及植株再生 图1. 3月26号愈伤组织培养情况 图2. 3月26号愈伤组织培养情况 （培养基未加有秋水仙素） （培养基加有秋水仙素） 图3. 4月2号愈伤组织培养情况 图4. 4月2号愈伤组织培养情况 (培养基未加有秋水仙素） (培养基加有秋水仙素） 图5. 4月10号愈伤组织培养情况 图6. 4月16号愈伤组织培养情况结果与分析：在发育初期，两种培养方式的生长情况差不多，经过一段时间后，对比图4、5可以看出，未加入秋水仙素的培养基里的愈伤组织生长地比加了秋水仙素的要快，体积要大，再经过两周，实验组变得比对照组大，但质量较差，而对照组发育良好。可能是因为秋水仙素放得太多，毒性较强，抑制了愈伤组织的生长，也可能是两个培养基的环境存在差异。5.3土人参细胞悬浮培养的观察 图1. 4月23号土人参悬浮细胞原代 图2. 5月7号土人参悬浮细胞继代 培养情况 培养情况 图3. 5月14号土人参悬浮细胞继代培养情况结果与分析：从图1可以看出，经过14d的黑暗摇晃培养，由原先接种的约为绿豆大小的愈伤组织团块培养成为分散性好，颜色呈浅黄，形成的细胞团大小相近，细胞较大的细胞悬浮体系。培养基比原先的培养基要显得浑浊，这是因为培养后的培养基中存在大量细胞。从图2和图3可以看出，经过一周后的继代培养，培养基表面比之前颜色较深，可能是出现了大量细胞团。5.4土人参细胞原生质体形态观察 图1. 酶解前的土人参细胞 图2. 酶解后的土人参细胞 图3. 经过台酚蓝颜色