2018届高考生物一轮复习考点加强课6限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定.pptx

纵观近年高考，选修3基因工程几乎是必考内容，是高频考点，考查内容包括基因工程的原理、基因工程的工具、基因工程的基本步骤及基因工程的应用等，然而，相关内容考查时常常涉及限制酶的选择及目的基因的检测与鉴定等，针对选择何种限制酶的问题，应为难点，区分度高，失分严重，为此，为总结规律，归纳方法，特设置本课。,【例证】（2016全国卷，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的）。,根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（1）经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接，理由是_。（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图（c）所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有，不能表达的原因是_。,图（c）,（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。慧眼识图获取信息（1）三种限制酶切割结果分析,（2）表达载体与重组DNA分子分析,答案（1）Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2）甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录（3）EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶,1.限制酶的选择原则,（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不致于完全破坏“标记基因”。,（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类,所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst因其会破坏标记基因而不宜选择。所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中Hind会破坏启动子，EcoR会破坏终止子，而Nde、Xba及BamH切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。,（3）参加Ti质粒的TDNA片段选择限制酶若质粒上标出TDNA片段，则所选限制酶切点应位于TDNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到TDNA片段上因为Ti质粒的TDNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba和Sac（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。（分析如下）,2.目的基因的检测与鉴定,（1）界定“标记基因”与“DNA分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示：,“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转入？经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。（2）使用“目的基因”作探针，运用“分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定mRNA。（3）采用“抗原抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质（作抗原）与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。（4）采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。,1.（2017北京卷，5）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。,下列操作与实验目的不符的是（）A.用限制性核酸内切酶EcoRI和连接酶构建重组质粒B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞C.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上解析图2中质粒中的抗性基因为潮霉素抗性基因，应该在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的菊花细胞，C错误。答案C,2.（2017广东省惠州市模拟）长期以来香蕉生产遭受病害的严重威胁，制约了其发展。目前，随着转基因抗病香蕉基因工程技术的日趋成熟，为培育抗病香蕉品种开辟了新途径。转基因抗病香蕉的培育过程如图所示，质粒上有Pst、Sma、EcoR、Apa等四种限制酶切割位点。请回答：,（1）构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶，对进行切割。（2）培养基中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有，作为标记基因。（3）能使抗病基因在香蕉细胞中特异性表达的调控序列是（填字母序号）。A.启动子B.终止子C.复制原点D.标记基因,（4）将目的基因导入植物细胞常用方法有多种，图中所示方法为。（5）欲检测目的基因是否表达成功，可采用的技术是。（6）利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成转基因植株，香蕉组织培养的培养基中除了含有一定的营养物质外还必须含有等植物激素，它们会在（填图中标号）阶段发挥作用，同时（填图中标号）阶段还需要给予一定光照。,解析（1）从图中可看出，只有Pst、EcoR两种酶能保持抗病基因结构的完整性，所以构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶Pst、EcoR两种酶，对含抗病基因的DNA和质粒进行切割。（2）卡那霉素能抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有卡那霉素抗性基因，以此作为标记基因。（3）启动子和终止子能启动目的基因的转录与终止，是使抗病基因在香蕉细胞中特异性表达的调控序列。（4）将目的基因导入植物细胞的方法有：农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。图中采用的是最常用的农杆菌转化法。（5）检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，采用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mRNA，采用分子杂交技术；检测目的基因是否表达成功产生相应的蛋白质，采用抗