复件微生物检测-第五章.ppt

第三节金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)检查法,是最常见的化脓性球菌，需氧或兼性厌氧食物中毒:火腿加工肉制品冰淇淋沙拉等化脓性感染:规定外用药及一般滴眼剂不得检出本菌。,一、生物学性状,金黄色葡萄球菌能产生多种毒素及酶，这些毒性物质是它致病力强的物质基础，能引起局部及全身化脓性炎症，严重时可发展成为败血症及脓毒血症，是人类化脓性感染中最重要的病原菌。,球形，大小不一，直径为0.4-1.2m，平均为0.8m。无鞭毛，无芽孢。不形成荚膜。在固体基质上，常堆聚成葡萄串状。在液体培养基中，呈双、呈链状排列。革兰染色阳性；当衰老、死亡或被中性粒细胞吞噬后常转为阴性。,（一）形态与染色,（二）培养特征,菌落0.8-1.5mm，圆形不透明、边缘整齐、光滑最适温度37，最适pH7.4。需氧或兼性厌氧，在20%-30%CO2环境中有利毒素产生。耐盐，在10%-15%的氯化钠培养基中能生长。在营养琼脂平板上产生金黄色脂溶性色素。在血琼脂平板上，菌落较大，且产生全透明溶血环。在卵黄高盐琼脂平板上分解卵磷脂在菌落周围形成白色乳浊圈。,（三）生化反应,糖发酵产酸不产气甲基红阳性，v-P阳性，吲哚阴性尿素酶阳性，还原硝酸盐，液化明胶产血浆凝固酶，耐热DNA酶和精氨酸双解酶，有时产生磷酸酶和触酶,（四）抗原构造,1.蛋白质抗原（staphylococcalproteinA，SPA）：有种属特异性，存在于细胞表面，是细胞壁的主要成分，能和人和动物血清中的IgG结合，具有抗吞噬作用，能促使细胞分裂。90%以上菌株具有此抗原。2.多糖抗原：是半抗原，具有型特异性。分为：（1）甲型多糖抗原：从S.aureus中提出，磷壁酸中的N-乙酰葡萄糖胺核酸醇残基（2）乙型多糖抗原：非致病葡萄球菌中提出，磷壁酸中的N-乙酰葡萄糖胺甘油残基（3）丙型多糖抗原：由多型葡萄球菌中提出,（五）抵抗力,抗干燥在60-701h才能被杀死，8030min能存活在5%苯酚或0.1%升汞溶液10-15min才杀死耐高盐对红霉素、链霉素、庆大霉素、先锋霉素敏感90%以上菌株对青霉素有耐药性,（六）致病性,侵袭力invasiveness：溶血毒素（hemolysin,staphylolysin）:是一种外毒素，不耐热。有四种。溶血毒素：对人类有致病作用的是溶血毒素，对红细胞有溶血作用，能损伤血小板和血管平滑肌。溶血毒素：在培养基上产生，具溶血活性。、溶血毒素：抗原性有差异,溶血毒素,杀白细胞素（leucocidin）：能杀死动物白细胞，具有抗原性。肠毒素（enterotoxin）：引起急性胃肠炎，对热稳定，有A、B、C、D、E五型。A型引起的食物中毒最多。剥脱性毒素（exfoliativetoxin）：可引起人和鼠表皮剥脱性病变。,凝固酶（coagulase）：一般致病性葡萄球菌产生此凝固酶，可分为两种：结合凝固酶（boundcoagulase）：直接作用于血浆中纤维蛋白原，使之变成纤维蛋白，凝集成块。游离型凝固酶（freecoagulase）：不直接作用于血浆中纤维蛋白原，而是和一种凝固酶反应因子结合，形成一种稳定复合物，作用于纤维蛋白原，使血浆凝固。,其他物质：产透明质酸酶，皮肤坏死毒素、耐热DNA酶和精氨酸双解酶，有时产生磷酸酶和触酶、红疮毒素、溶纤维蛋白酶等。,二、常规检查法,增菌培养：取1：10的检样稀释液，放至营养肉汤中培养18-24h。分离培养：将增菌液用接种环沾取1-2环，划线接种于卵黄高盐琼脂平板或甘露醇高盐平板、血琼脂平板上。36培养24-72h。,卵黄高盐琼脂：金黄色，菌落1-2mm，圆形凸起、边缘整齐、光滑湿润、外周有乳浊圈。甘露醇高盐平板：金黄色，菌落0.7-1mm，圆形凸起、边缘整齐、光滑湿润、外周有黄色环。血琼脂平板上：金黄色，菌落2-4mm，圆形凸起、边缘整齐、光滑湿润、外周有透明溶血环。,菌落圆形,表面光滑、凸起、湿润,直径23mm。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。,Baird-Parker琼脂平板,在传统的BairdParker基础中加入(兔血浆+纤维蛋白原试验)。培养后，在菌落周围出现大而清晰的“光晕“即可证实该葡萄球凝固酶为阳性。在24小时的培养过程中，同时进行了选择性的分离培养和凝固酶试验。与传统的“BairdParker琼脂+蛋黄”观察脂酶活性相比，凝固酶的产生是一个更加特异的鉴定葡萄球菌的试验。,纯培养：挑取上述菌落2-3个，接种于营养肉汤琼脂斜面上，36培养18-24h，取培养物进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。革兰氏染色镜检：革兰染色阳性球菌。无芽孢、无荚膜、排列呈不规则的葡萄状，单个、成双或成链状排列。,血浆凝固酶试验：血浆制备：以无菌手续自家兔心脏采血9mL，迅速加至装有5%柠檬酸钠溶液1mL的灭菌离心管内，充分混合数分钟后，1500r/min离心15min，吸取血浆备用。,玻片法测结合凝固酶,取载玻片一张，在玻片两端分别滴上灭菌生理盐水和未经稀释的血浆各一滴。取待检菌18-24h肉汤液或琼脂培养物一接种环，加至生理盐水中，制成浓菌悬液，取一环，与血浆混合均匀，观察结果。在5min内混菌的血浆出现团块或颗粒状凝块，而在盐水中呈均匀混浊时，即为阳性反应。同时做阳性对照和阴性对照。,载玻片,生理盐水,血浆,待检培养物,试管法测游离凝固酶,取灭菌小试管3支，各加血浆0.5mL；一支加入待检菌生理盐水悬液或营养肉汤液0.5mL，为试验管另一支加阳性对照菌生理盐水悬液或营养肉汤液0.5mL，做阳性对照管；再一支加生理盐水悬液或营养肉汤液0.5mL，做阴性对照管。三管同时放37水浴中4h每隔1h观察一次结果，不要振动或摇动试管，轻轻倾斜至横放，检查各管是否凝固或有凝块。若无凝固或凝块现象，则育孵24h，再检查。,注意事项,试管法和玻片法结果可能不一致，玻片法的阴性和可疑结果用试管法确定。玻片法的待检菌悬液应较浓，避免假阴性纤维蛋白溶酶的产生，每小时观察新鲜培养物，否则凝固酶活性低，不易检出,结果判定,革兰氏染色镜检阳性球菌，血浆凝固酶阳性，判为检出金黄色葡萄球菌革兰氏染色镜检不是阳性球菌，或血浆凝固酶阴性，判为未检出金黄色葡萄球菌阴性对照有菌生长或阳性对照呈阴性结果时，重新检查,三、其他鉴别试验,溶血试验法：取5mL无菌的脱纤维血，加在100mL溶化并冷却至50的营养琼脂里，混匀后倾注平板。烘干冷凝水，备用。用接种环取微同待测菌，划线于平板上，3718-24h观察溶血环。,肠毒素测定,动物实验法ELISA法反向乳胶凝集法,磷酸酶试验,原理：致病型葡萄球菌可产生磷酸酶，使单磷酸水解，如以磷酸酚酞为基质，则水解后可释放出酚酞，在碱性环境中呈红色。方法：在1000mL营养琼脂内加入1%的磷酸酚酞溶液1mL，倾注平板，接种待检菌，3518-24h，在平板上滴加浓氨水，菌落变为红色，则为阳性。,耐热DNA酶试验：,原理：金黄色葡萄球菌所产生的DNA酶加热煮沸后仍具有酶活性。可水解长链DNA成寡聚核苷酸，后者遇甲苯胺蓝后变成粉红色。,（1）玻片法：将溶化好的TrisDNA琼脂3mL铺于灭菌的载物玻片上，放在水平台上待琼脂凝固，用直径3mm打孔器打孔3-4个。将待检菌肉汤培养物10020min处理后冷却，于每孔中加入1小滴363h后观察。出现大于5mm粉红色圈者为阳性。,（2）平板法：在分离金黄色葡萄球菌的琼脂平板上挑选并标记所需要测试的菌落，之后在60干燥箱内放2h，取出后在平板上倾注