金刚藤抗炎活性部位群的提取纯化工艺及其质量分析研究

金刚藤抗炎活性部位群的提取纯化工艺及其质量分析研究摘要金刚藤，原植物名为获莫（Smilax china L.），为常用中药，收载于中国药典2005年版一部，具有祛风利湿、解毒散淤等功效，可用于筋骨酸痛、小便淋漓、带下量多、疗疮痈肿。以金刚藤的药用部位为原料药研制的中药制剂主要用于治疗慢性盆腔炎、附件炎，且疗效显著。本论文对金刚藤的抗炎活性部位群进行提取纯化工艺研究，对金刚藤提取物进行了质量标准及指纹图谱研究，为金刚藤制剂的二次开发研究奠定基础。采用乙醇回流提取和D101大孔吸附树脂纯化技术，通过单因素和正交试验相结合的方法，对金刚藤抗炎活性部位群进行了提取和分离纯化工艺研究，获得了可靠的技术参数，进行了中试验证，可过渡到产业化。采用高效毛细管电泳(HPCE)法，对金刚藤提取物进行了指纹图谱的研究，按照国家食品药品监督管理局颁布的中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)，建立了该提取物的指纹图谱，标定了14个共有峰，指认了白慕芦醇、芦丁、山奈素、撇皮素四个指纹峰，方法重现性和稳定性良好，色谱峰分离度好，相似度高，为金刚藤提取物建立与国际接轨的质量评价方法奠定了一定的基础。关键词：金刚藤；提取春花工艺；指纹图谱目录摘要1一、引言3二、金刚藤抗炎活性部位群的提取工艺研究3（一）仪器与试药3（二）正交试验优选醇提工艺4（三）含量测定7（四）讨论11三、金刚藤抗炎活性部位群的纯化工艺研究11（一）仪器与试药11（二）大孔吸附树脂筛选研究11（三）D101大孔吸附树脂纯化工艺研究13（四）讨论21四、金刚藤提取纯化工艺中试放大研究21（一）仪器与试药21（二）方法与结果22（三）讨论24五、金刚藤提取物的HPCE指纹图谱研究25（一）仪器与试药25（二）方法与结果26（三）讨论34六、结论35参考文献36致谢37一、引言金刚藤，又名“菝葜”，为百合科(Liliaceae)植物获莫Smilax china L.的干燥根茎。为较常用中药，具有祛风利湿、解毒散疲的功效，用于筋骨酸痛、小便淋漓、带下量多、疗疮痈肿等症。中医临床用于治疗妇科炎症、消除包块、肿瘤等疾患；现代药理研究表明，金刚藤提取物具有明显抗炎和抑菌作用。慢性盆腔炎、附件炎、附件炎性包块等妇科炎症是妇科常见病，多发病。这类疾患不仅严重影响女性身心健康，而且造成家庭和社会负担。传统的治疗方法多采用抗生素，长期使用可使患者产生耐药且易造成双重感染。传统中医药治疗慢性盆腔炎、附件炎、附件炎性包块有着悠久历史和丰富经验。中医理论认为，月经不调、下腹痛、带下和疲痕等症状是由于下焦湿热疲积或创伤疲滞、脉络受阻、气血不畅而致。临床用药以清热解毒、活血化疲为治则，远期疗效显著，形成中药治疗的优势。以金刚藤为原料制成的金刚藤胶囊、金刚藤糖浆、金刚藤片等制剂，用于治疗慢性盆腔炎、附件炎等妇科炎症，疗效肯定，深受广大患者的欢迎，是医务工作者治疗妇科炎症疾患的首选药物。金刚藤胶囊为湖北福人药业有限公司的主导品种，2002年收入国家基本治疗药物目录。但上述金刚藤制剂为传统工艺制备，生产工艺较落后，存在着药效物质基础不明确，质量可控性差，药物稳定性难以控制，科技含量不高，服用剂量大等弊端，不符合现代临床用药的要求。本论文采用大孔吸附树脂纯化等中药现代化共性关键技术，对金刚藤抗炎活性部位进行了提取纯化工艺研究;并建立了金刚藤提取物较为完善的质量标准和指纹图谱，为金刚藤传统制剂的二次开发奠定基础。二、金刚藤抗炎活性部位群的提取工艺研究（一）仪器与试药1、仪器万分之一天平(Metter Toledo A1204 );十万分之一天平(Sartorius BP211d );可见一紫外分光光度计(Shimadzu UV-2401日本岛津)。2、试药金刚藤药材，百合科(Liliaceae)植物菝葜Smilax china L.的干燥根茎，切制成饮片使用。芦丁对照品(批号100080-200707)、薯蓣皂苷对照品(批号111707-200501)、没食子酸对照品(批号110831-200302)均购自中国药品生物制品检定所;水为重蒸水(实验室自制);其他试剂均为分析纯。（二）正交试验优选醇提工艺1、提取工艺条件的选择通常用加热回流法来提取金刚藤有效成分，其提取率较高，目前工业上应用最为常见，因此本研究选用乙醇回流提取法来提取金刚藤有效部位群。2、试验因素与因素水平的确立乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和回流次数为主要影响因素，本实验按如下因素水平进行设计，见表2-1。表2-1金刚藤提取试验因素水平表水平因素A回流次数-回流时间（h）B乙醇浓度（%）C空白D乙醇用量（倍）1250622-260832-2-170103、正交试验与结果称取18份每份为100g的金刚藤饮片，按L9 (34)正交表进行试验(见表2-2 )，提取液回收乙醇，适当浓缩后转移至1000mL容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀，作为金刚藤乙醇提取液(每1mL相当于0. 1 g原药材)。精密吸取金刚藤提取液l0mL，作为供试品溶液，测定其中总皂苷、总黄酮及总软质的含量。另精密吸取25mL金刚藤乙醇提取液，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴将其蒸干，在105温度下干燥3小时，然后放置干燥器内，冷却30分钟后迅速称定重量，计算干膏收率。评价指标为：总黄酮、总皂苷、总软质的含量和干膏得率。通过对以上指标的考察进行提取工艺条件的优选。试验结果及结果分析见表2-2，表2-3、表2-4、表2-5及表2-6。从总黄酮、总皂苷、总软质的含量和干膏得率结果方差分析来看，因素A(回流次数-回流时间)有显著性差异，因素B(乙醇浓度)和D(乙醇用量)无显著性意义，表明因素A对试验结果影响较大。采用权重系数法，对试验结果进行综合评价，结果见表2-7、表2-8。综合评价结果表明，各因素对实验结果影响的大小顺序为ABD，其中因素A(回流次数-回流时间)有显著性差异，因素B(乙醇浓度)和D(乙醇用量)无显著性意义。直观分析给出的最佳工艺为A3B3D2，因此选定最佳工艺条件为:8倍量70%的乙醇回流提取3次，提取时间分别为2小时，2小时，1小时。表2-2金刚藤抗炎活性部位群提取正交试验设计及结果分析表表2-3总黄酮量的方差分析表2-4总皂苷量的方差分析表2-5总鞣质量的方差分析表2-6干膏得率的方差分析表2-7金刚藤抗炎活性部位群提取正交试验综合评分结果分析表表2-8综合评分的方差分析4、验证试验按照正交试验所选择的最优工艺A3B3D2进行3次重复试验，试验结果见表2-9。表2-9金刚藤提取验证实验结果（三）含量测定1、样品中总黄酮的含量测定选择芦丁为指标性成分，测定总黄酮的含量。（1）对照品溶液的制备将芦丁对照品于60减压干燥至恒重，然后取10.07mg，精密称定，用甲醇溶解并定容至50mL，作为对照品溶液(每1mL含0. 2014mg芦丁对照品)。（2）供试品溶液的制备取金刚藤乙醇回流提取液，回收乙醇，用水调整浓度至0.1g生药.mL-1 ,作为供试品溶液。（3）标准曲线的制备精密吸取对照品溶液1mL, 2mL, 3mL, 4mL, 5mL，分别置于25mL量瓶中，加甲醇至6mL，加5%的亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6分钟后加10%的硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟后再加入氢氧化钠试液l0mL，加甲醇至刻度，摇匀。放置30分钟后，随行试剂作空白，于500nm处测定吸收度。以芦丁对照品溶液浓度C ( mgmL-1)为横坐标，吸收度A为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为:A=12.028C-0.0055, r=0.9999, n=5，线性范围为0.00810.0403mgmL-1。结果见图2-l。图2-1总黄酮线性关系图（4）总黄酮的含量测定精密吸取0.1g生药mL-1的供试品溶液2mL甲醇至6mL，按（3）项测定并计算总黄酮的含量。2、样品中总皂苷的含量测定选择薯蓣皂苷为指标性成分，测定总皂普的含量。（1）对照品溶液的制备将薯蓣皂苷对照品于60减压干燥至恒重，取14.25mg，精密称定，用甲醇溶解并定容至50mL，作为对照品溶液(每1mL含0.570mg薯蓣皂苷对照品)。（2）供试品溶液的制备取金刚藤乙醇回流提取液，回收乙醇，用水调整浓度至0.1g生药mL-1,作为供试品溶液。（3）标准曲线的制备精密吸取对照品溶液0.05mL, 0.1mL, 0.15mL, 0.2mL, 0.25mL，置于具塞试管中，水浴将其溶剂挥干，然后精密加入5mL高氯酸，摇匀，在60水浴中加热15分钟后取出，立即置冰水浴中冷却23分钟，取出，摇匀，随行试剂作空白，于407nm处测定吸收度。以薯蓣皂苷对照品溶液浓度C ( mgmL1)为横坐标，吸收度A为纵坐标，绘制标准曲线，经计算得线性回归方程为，A=20.386C-0.0072,r=0.9999,n=5。薯蓣皂苷在0.00570.0342 mgmL-1范围内具有良好的线性关系。结果见图2-2。图2-2总皂苷线性关系图（4）总皂苷含量测定精密吸取l0mL浓度为0.1 g生药mL-1的供试品溶液，每次用l0mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，将乙酸乙酯层弃去。水液每次用10mL水饱和的正丁醇萃取，共萃取5次，合并正丁醇液。然后正丁醇液每次用l0mL的氨试液萃取，共萃取2次。分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至l0mL，作为供试品溶液。按（3）项测定。3、样品中总鞣质的含量测定选择没食子酸为指标性成分，测定总软质的含量。（1）对照品溶液的制备取没食子酸对照品50.37mg，精密称定，置100mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5mL，置50mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1mL中含没食子酸50. 37g)。（2）供试品溶液的制备取金刚藤乙醇回流提取液，回收乙醇，用水调整浓度至0.1g生药mL-1作为供试品溶液。（3）标准曲线的制备精密吸取对照品溶液1.0mL, 2.0mL, 3.0mL, 4.0mL, 5.0mL，分别置于25mL棕色量瓶中，各加入磷铂钨酸试液1mL，再分别加水4mL, 3mL, 2mL,1mL, 0mL，用12. 2 %碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀。以相应的试剂为空白对照，放置30分钟后，在760nm波长处测定吸收度。以没食子酸对照品浓度C ( mgmL-1)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，经计算得线性回归方程为:A=104.43C+0.0638, r-0. 9996,n=5。没食子酸在0.002010.01 mgmL-1范围内具有良好的线性关系。结果图2-3。图2-3总鞣质线性关系图（4）总鞣质的含量测定精密吸取0.1 g生药mL-1供试品溶液l0mL，至25mL棕色量瓶中，加入磷铂钨酸试液1mL，再加水3mL，按（3）项测定并计算总鞍质的含量。（四）讨论1、正交实验优选的乙醇提取浓度为70%，因为该浓度是正交试验乙醇浓度三个水平的上限，所以在优选出的最佳醇用量和提取时间次数的基础上，采用80%乙醇提取，结果表明，总黄酮、总皂普和总软质的含量和干膏得率略高于最优工艺条件，但无显著性差异。考虑到实际生产成本等因素，故仍选用70%乙醇作为提取溶剂。2、正交结果分析中，权重系数分配为:总黄酮和总皂苷各占30%，总鞣质和干膏率各占20%，主要是考虑总黄酮和总皂苷为金刚藤抗炎的主要有效成分，因此分配的权重系数略高。3、本试验以总黄酮、总皂苷、总鞣质及干膏率为指标进行了乙醇提取正交试验，并进行了验证试验，所确定的工艺参数稳定，试验优选的最佳提取工艺为:8倍量70%的乙醇提取3次，提取时间分别为2小时，2小时，1小时。三、金刚藤抗炎活性部位群的纯化工艺研究本章节采用大孔树脂对金刚藤有效部位群即总黄酮、总皂普及总揉质成分的吸附量、解吸附率及影响因素进行了较系统的研究，为工业化生产提供了稳定可行的工艺参数。（一）仪器与试药1、仪器万分之一天平(Metter Toledo A1204 );十万分之一天平(Sartorius BP211d );可见-紫外分光光度计(Shimadzu UV-2401日本岛津)。2、试药金刚藤药材，百合科(Liliaceae)植物菝葜Smilax china L.的干燥根茎，切制成饮片使用。芦丁对照品(批号100080-200707)、薯蓣皂苷对照品(批号111707-200501)、没食子酸对照品(批号110831-200302);AB-8, HPD100大孔树脂;D101型大孔树脂;所用试剂均为分析纯。（二）大孔吸附树脂筛选研究1、不同大孔吸附树脂对样品溶液中总黄酮、总皂苷和总鞣质的静态饱和吸附和解吸附洗脱试验将三种大孔吸附树脂按上述方法处理(抽滤至不滴水为止)，精密称取1g，置100mL磨口三角瓶中，精密加入供试品药液50mL，置振荡器上持续振摇24h，使其充分吸附后，取上层液分别测定总黄酮总皂苷和总鞣质的浓度。树脂饱和吸附量计算公式：饱和吸附量=(初始浓度-吸附后浓度)*吸附液体积/树脂量。将饱和吸附的树脂取出，置100mL磨口三角瓶中，加入一定体积70%乙醇，置振荡器上持续振摇12h，使其解吸附，取上层液分别测定总黄酮、总皂苷和总鞣质的浓度。并按下式计算洗脱率：洗脱率-(洗脱液浓度*洗脱液体积)/饱和吸附量*100%，结果见表3-1。表3-1三种大孔吸附树脂对总黄酮、总皂苷和总鞣质的静态筛选结果结果表明，D101, AB-8, HPD100型大孔吸附树脂在静态筛选试验中对样品中总黄酮、总皂普和总软质的饱和吸附量和洗脱率比较接近，因此对这三种树脂进行进一步的动态吸附和解吸附性能的考察。2、三种大孔吸附树脂对样品溶液中总黄酮、总皂苷和总鞣质的动态饱和吸附及解吸附性能试验取已处理好的上述三种大孔吸附树脂各2g，精密称定，上柱备用，分别以1mLmin-1将100mL供试品药液通过树脂柱，并将过柱液重复吸附一次，再以一定体积的水洗脱，检测流出液中总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量，比吸附量计算公式:比吸附量=(上柱液中物质的量-下柱液中物质的量-水洗脱液中物质的量)/树脂量。再用一定体积的70%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，分别测定洗脱液中总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量，并按下式计算树脂比洗脱量:比洗脱量=洗脱液浓度*洗脱液体积/树脂量。实验结果见表3-2表3-2三种大孔吸附树脂对总黄酮、总皂苷和总鞣质的动态筛选结果结果表明，D101, AB-8, HPD100三种大孔吸附树脂对金刚藤总黄酮、总皂苷和总鞣质的吸附量和解析率均较好。在目前国内药品生产行业中，D101型大孔树脂应用最为广泛，价格较低，具有较高的安全性。因此，在金刚藤有效部位群的纯化工艺中，选择D101型大孔树脂较为合理。（三）D101大孔吸附树脂纯化工艺研究1、方法与结果（1）供试品药液的制备取1.5kg金刚藤饮片，加8倍量70%乙醇加热回流，共提取3次，第一、二次各2h，第三次1h,滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩，过滤滤液用水定容至15L(每1mL相当于原生药0.1 g )，备用。（2）总黄酮、总皂苷、总鞣质的含量测定分别精密吸取金刚藤提取液和经过树脂处理后的溶液。照第二章节“（一）”、“（二）”和“（三）”项下方法测定总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量。（3）大孔吸附树脂纯化金刚藤提取物的工艺优选研究吸附正交试验采用正交试验方法，以上样流速、药液的浓度(以样品中所含有的原药材量计)及径高比作为考察因素(见表3-3)。取相当于原生药0.1 gmL-1的供试品药液810mL，共18份，其中6份浓缩到405mL，即浓度为相当于原生药0.2 gmL-1，6份浓缩到270mL,即相当于原生药0.3gmL-1，按正交表L9 (34)进行试验(见表3-4)。将已处理好的2.0g D101树脂装入不同径高比的玻璃柱中，以不同的流速进行吸附，用定量的水洗脱，收集下柱液和水洗脱液，测定总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量，计算比吸附量。选择总黄酮、总皂苷和总鞣质的比吸附量为评价指标，进行吸附条件优选。结果见表3-4、表3-5、表3-6及表3-7。比吸附量=(金刚藤提取液中物质的含量-水洗脱液中物质的含量-下柱液物质的含量)/树脂量表3-3大孔树脂吸附因素水平表表3-4金刚藤抗炎活性部位群吸附正交试验设计及结果分析表表3-5总黄酮比吸附量测定结果的方差分析表3-6总皂苷比吸附量测定结果的方差分析表3-7总鞣质比吸附量测定结果的方差分析从总黄酮、总皂苷、总鞣质比吸附量测定结果方差分析来看，因素A(上样浓度)和B(吸附流速)有显著性差异，因素D(径高比)无显著性意义，表明因素A和B对试验结果影响较大。采用权重系数法，对试验结果进行综合评分方差分析，结果见表3-8、表3-9。表3-8金刚藤杭炎活性部位群吸附正交试验综合评分结果分析表计算公式：综合评分=（总黄酮测得量/总黄酮测定最大值）*35+（总皂苷测得量/总皂苷测定最大值）*35+（总鞣质测得量/总鞣质测定最大值）*30。表3-9综合评分方差分析上样量的确定取供试品药液(浓度为0. 2 gmL-1)，加入20g已处理好的D101树脂柱上端，按上述最佳吸附条件进行吸附，每l0mL为1流份接取流出液，测定总黄酮的含量。以流出液体积为横坐标，总黄酮的吸光度为纵坐标，绘制泄漏曲线。见图3-1。图3-1泄漏曲线从图中可知，当上样量为60mL(即12g生药量)时，总黄酮在第6号开始泄露，因此确定上样量为树脂量:药材量=1:0.6。水洗量的考察取60mL浓度为0.2gmL-1的供试品药液，装入20g已处理好的D101树脂柱中，以2Bvh-1的吸附速率进行吸附，然后用水洗，以每10mL为1份接取水洗流出液，用Molish反应检测，指示洗脱终点，并称量水洗液中干膏重量。结果见表3-10。表3-10水洗量考察结果结果表明，当用水量为60mL时，水溶性杂质基本洗脱完全。故确定水洗脱终点为60mL即2Bv。乙醇洗脱浓度的考察取60mL浓度为0.2g/mL的供试品药液，共5份，分别装入20g已处理好的D101树脂柱中，吸附流速为2Bvh-1，再以2Bv的水洗脱后，弃去水洗液，再分别用10%, 30%, 50%, 70%, 90%乙醇洗脱，收集90mL乙醇流出液，测定，计算总黄酮、总皂苷、总鞣质的量、解吸率、干膏重以及纯度。结果见表3-11、表3-12、表3-13。表3-11金刚藤总黄酮乙醇洗脱浓度考察结果表3-12金刚藤总皂苷乙醇洗脱浓度考察结果表3-13金刚藤总鞣质乙醇洗脱浓度考察结果结果表明:总皂苷在90%乙醇中解吸率最高，而总黄酮和总鞣质则在70%乙醇中含量最高。70%与90%乙醇洗脱效果相差不明显，从生产过程中安全因素以及成本等综合考虑，选用70%乙醇为洗脱溶剂。洗脱流速的确定按上述条件进行动态吸附，选择70%乙醇为洗脱剂，然后分别以1Bvh-1, 2Bvh-1和4Bvh-1的速度进行洗脱，测定。计算总黄酮、总皂苷、总鞣质的量、解吸率和纯度。结果见由表3-14、表3-15、表3-16。表3-14金刚藤总黄酮乙醇洗脱流速考察结果表3-15金刚藤总皂苷乙醇洗脱流速考察结果表3-16金刚藤总鞣质乙醇洗脱流速考察结果结果表明，洗脱流速为1Bvh-1和2Bvh-1效果相当，考虑生产效率，选用2Bvh-1洗脱流速较为合理。洗脱剂用量的考察按上述条件进行动态吸附，选择70%乙醇为洗脱剂，流速为2Bvh-1进行洗脱，定量收集流出液并测定其中总黄酮、总皂苷和总鞣质的量，分别以洗脱剂用量为横坐标，总黄酮、总皂苷和总鞣质的吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。结果见图3-2、图3-3、图3-4。图3-2金刚藤总黄酮洗脱曲线图3-3金刚藤总皂苷洗脱曲线图3-4金刚藤总鞣质洗脱曲线结果表明，当用90mL即3Bv的70%乙醇洗脱时，总黄酮、总皂苷和总鞣质基本洗脱完全，故确定最佳洗脱体积为90mL ( 3Bv) 7 0%乙醇。综上所述，金刚藤提物中总黄酮、总皂苷、总鞣质的D101大孔吸附树脂纯化条件如下:吸附条件为:药液浓度0.2gmL-1，吸附速度2BVh-1，径高比1:8，上样量60mL，即树脂量:药材量为1: 0.6;洗脱条件为:水洗60mL ( 2Bv ),70%乙醇洗脱，流速2Bvh-1，乙醇用量90mL ( 3Bv )。验证实验按上述得出的最佳纯化工艺进行3次验证实验，结果表明优选的纯化工艺稳定可行。结果见表3-17。表3-17金刚藤最佳纯化工艺验证实验结果（四）讨论1、在前期的预实验中，金刚藤提取液中黄酮饱和量和泄露点均较皂苷、鞣质靠前，因此，本实验通过黄酮类成分的泄露曲线确定上样量。2、本试验对金刚藤有效部位群的大孔树脂纯化工艺进行了较全面的研究，取得了可行的纯化工艺技术参数，即:树脂型号为天津欧瑞生物科技有限公司的D101型大孔树脂，药液浓度为0.2 gmL-1(相当于原生药)，上柱量为药材量:树脂量=0.6:1，以吸附速率为2Bvh-1吸附，然后依次用2Bv水和3Bv 70%乙醇以2BVh-1的速率洗脱。经以上纯化工艺所得到金刚藤有效部位群总黄酮、总皂苷和总鞣质含量之和可达65%以上。并对该工艺进行了三次验证试验，结果显示，该工艺稳定可行。四、金刚藤提取纯化工艺中试放大研究（一）仪器与试药1、仪器万分之一天平(Metter Toledo A1204 );十万分之一天平(Sartorius BP211d);可见一紫外分光光度计(Shimadzu UV-2401日本岛津)。2、试药金刚藤药材，百合科(Liliaceae)植物菝葜Smilax china L.的干燥根茎，切制成饮片使用。芦丁对照品(批号100080-200707)、薯蓣皂苷对照品(批号111707-200501)、没食子酸对照品(批号110831- 200302);D101型大孔树脂;所用试剂均为分析纯。（二）方法与结果1、中试（一）取72kg金刚藤饮片，加8倍量70%乙醇加热回流，共提取三次，第一、二次各2h，第三次1h，合并滤液，减压回收乙醇至一定体积，抽滤得0.2gmL-1(相当于原生药)上样药液。取D101型大孔树脂(药用级)20kg，用适量乙醇浸泡，湿法装柱，并用大量乙醇冲洗，不时检测流出液，至与水混合不呈白色浑浊为止(取5mL乙醇加5mL水)。然后用大量的蒸馏水洗去乙醇，备用。在吸附流速为2Bvh-1，树脂床径高比为1:8的条件下进行吸附，然后再用2Bv的蒸馏水，以2Bvh-1的流速洗脱至MoLish反应为阴性，继续用3Bv的70%乙醇，以2Bvh-1 (1Lmin-1)的流速进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.03，喷雾干燥(进风口温度为170，出风口温度为80，雾化盘转速为20000转/分钟)。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置阴凉干燥处保存。工艺流程图见图4-1。工艺过程流程图如下:图4-1中试工艺流程图采用紫外分光光度法测量提取物中总黄酮、总皂苷、总鞣质的含量，并计算转移率(转移率=提取物中有效成分的含量/提取液中有效成分的含量*100%)和收膏率(收膏率=提取物总重量/原药材总重量*100 % )。结果见表4-1。表4-1中试（一）验证实验结果由于中试(一)采用小试优选的参数，以2Bvh-1的流速进行洗脱，可能过渡到中试时，流速过快，洗脱不完全，使总黄酮、总皂苷和总鞣质的纯度偏低。所以对中试(一)的参数进行适当的调整，将洗脱流速调整为1Bvh-1，进行第二次中试。2、中试（二）取金刚藤饮片48kg，平均分为4批，每批分别加8倍量70%乙醇加热回流提取3三次，第一、二次各2h，第三次1h，合并滤液，减压回收乙醇至一定体积，抽滤得上样药液。取D101型大孔树脂(药用级)20kg，用适量乙醇浸泡，湿法装柱，并用大量乙醇冲洗，不时检测流出液，至与水混合不呈白色浑浊为止(取5mL乙醇加5mL水)。然后用大量的蒸馏水洗去乙醇，备用。在吸附流速为2Bvh-1，树脂床径高比为1:8的条件下进行吸附，然后再用2Bv的蒸馏水，以2Bvh-1的流速洗脱至MoLish反应为阴性，继续用3Bv的70%乙醇，以1Bvh-1 (0.5Lmin-1)的流速进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.03,喷雾干燥(进风口温度为170，出风口温度为80，雾化盘转速为20000转/分钟)。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置阴凉干燥处保存。分别测定提取物中总黄酮、总皂苷、总鞣质的含量，并计算转移率和收膏率。结果见表4-2。4-2中试（二）验证实验结果（三）讨论1、第一次中试采用小试优选的工艺参数，醇洗脱采用2 Bvh-1的流速进行洗脱，结果总黄酮、总皂苷、总鞣质纯度及转移率与小试比较均偏低，其原因可能与中试时流速较大有关，因此，第二次四批中试对洗脱流速进行调整，调整为以1Bvh-1的流速洗脱，结果表明:洗脱流速分别为1Bvh-1与2 Bvh-1时，总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量纯度变化不大(结果见表4-2)。为节约生产时间和生产成本，仍采用洗脱流速为2Bvh-1。2、在进行水洗脱和醇洗脱过程中，有必要在每个柱体积取样检测，检测泄漏提前，或者洗脱完全，对中试参数及时进行有效的调整。3、经过中试放大试验，对提取纯化部分参数进行了调整，最后确定金刚藤提取纯化中试参数为:加入8倍量70%的乙醇提取3次，提取时间分别为2小时，2小时，1小时;采用树脂型号为D101型大孔树脂进行纯化，上样药液浓度为0.2 gmL-1(相当于原生药)，上柱量为药材量:树脂量=0.6: 1，以吸附速率为2Bvh-1吸附，然后依次用2Bv水和3Bv 70%乙醇以2Bvh-1的速率洗脱。4、此工艺进行的五批中试验证试验，提取物中总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量之和均达到65%以上。表明本工艺中试技术参数可行，可望过渡到产业化生产。5、树脂解吸附完毕后，先用适量高浓度的乙醇冲洗，再用蒸馏水冲洗到无醇味，备用。多次使用后，防止树脂被堵塞或死吸附，需要对树脂进行再生处理。先用4%的盐酸溶液浸泡24小时，继用相同的浓度的盐酸溶液通柱冲洗约5Bv，然后用蒸馏水冲洗至中性;再用4%氢氧化钠溶液冲洗树脂约6-7Bv，最后用蒸馏水冲洗至中性，备用。五、金刚藤提取物的HPCE指纹图谱研究毛细管电泳(Capillary eletrophoresis，CE)是近年来发展最快的分析方法之一。高效毛细管电泳技术具有分离效率高、分析速度快、实验成本低、消耗少、仪器结构简单、操作模式多等特点，越来越广泛地应用于中药有效成分分析、指纹图谱研究。为了提供金刚藤提取物的有效质量评价方法，本文以黄酮为主要分析对象，采用HPCE色谱法对金刚藤提取物进行了指纹图谱研究。（一）仪器与试药1、仪器毛细管电泳仪(Beckman P/A system5000);融熔石英毛细管柱(75um*57cm);万分之一天平(Metter Toledo A1204);十万分之一天平(Sartorius BP211d)。2、试药金刚藤提取物(批号20090320, 20090522, 20090525, 20090529,20090602, 20090603, 20090605, 20090608, 20090609, 20090612)。芦丁对照品(批号100080-200707) ;槲皮素对照品(批号10081-2004061);山奈素对照品(批号111637一200502);白藜芦醇对照品(批号110752 - 200209);硼砂、乙腈为分析纯;水为双蒸水。（二）方法与结果1、运行缓冲液:30mmol/L硼砂-15%乙腈，pH: 9.45;操作电压为10KV;紫外检测波长为330nm;柱温25;采用压力进样，进样时间8s。毛细管冲洗方法:开机后用0.lmo1 /L氢氧化钠溶液冲洗2min，水冲洗2min，再用运行缓冲液3min，每两次进样测定之间运行缓冲液冲洗2min。2、对照品溶液的制备精密称定白藜芦醇、芦丁、槲皮素、山奈素对照品适量，分别用55%的乙醇溶液制成每1mL含50g的对照品溶液。3、供试品溶液的制备取金刚藤提取物125mg，精密称定，加入55%乙醇溶液20mL，超声使溶解，再加入4%明胶溶液2mL，边加边搅拌，静置过夜，抽滤，取滤液用55%乙醇溶液定容至25mL，摇匀，即得。4、方法学考察（1）精密度与稳定性试验取金刚藤提取物(批号20090320)，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件测定，分别于0h, 3h, 6h, 9h, 12 h测定5次，记录其HPCE图谱。以8号峰为参照峰(S)，计算各峰的相对保留时间和相对峰面积，结果符合指纹图谱的技术要求，其共有峰的峰面积比值的RSD均小于5%，共有峰相对保留时间的RSD均小于2%。结果见表5-1、5-2。（2）重复性试验取金刚藤提取物(批号20090320)共5份，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，进样测定，记录HPCE图谱，并计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果其共有峰相对保留时间的RSD小于3%,峰面积占总峰面积比超过10%以上的共有峰相对峰面积RSD不超过5%,表明该方法重现性良好。结果见表5-3、5-4。表5-1精密度与稳定性试验结果（相对保留时间）表5-2精密度与稳定性试验结果（相对峰面积）表5-3重复性试验结果（相对保留时间）表5-4重复性试验结果（相对峰面积）5、指纹图谱技术参数（1）指纹图谱的建立取10批金刚藤提取物，按上述供试品制备方法制备供试品溶液，进样分析，并记录各HPCE图谱。结果见图5-1, 5-2。图5-1金刚藤提取物HPCE色谱图5-2 10个不同批次金刚藤提取物指纹图谱叠加图（2）共有峰的标定根据10批金刚藤提取物HPCE的分析结果，比较其HPCE图谱。结果表明，在35min已记录完色谱峰，且峰分离度良好;以相对保留时间标定了14个共有峰，并将8号峰作为参照峰S，计算其它各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果其共有峰的峰面积比值的RSD均小于5%,共有峰相对保留时间的RSD均小于3%。结果见表5-5、5-6。（3）共有色谱峰的占总峰面积的比值计算各批次样品中共有色谱峰占总峰面积的比值，结果表明，共有峰面积占总峰面积的平均百分比均大于90%，符合指纹图谱的技术要求。结果见表5-7。表5-5 10批样品的共有峰相对保留时间表5-6 10批样品共有峰相对峰面积值表5-7共有峰峰面积的比值6、共有峰的归属取金刚藤提取物供试品溶液，加入一定量白藜芦醇、芦丁、山奈素、槲皮素对照品，进样测定，记录其HPCE图谱。将上述HPCE图谱分别与供试品、白藜芦醇、芦丁、山奈素、槲皮素对照品图谱进行比较，标定1号峰为白藜芦醇，4号峰为芦丁，10号峰为山奈素，13号峰为槲皮素。见图5-3、5-4、5-5、5-6、5-7。图5-3共有峰的归属1、加入对照品（白藜芦醇、芦丁、山奈素、槲皮素）的供试品 2、供试品（20090525） 3、白藜芦醇对照品 4、芦丁对照品 5、槲皮素对照品 6、山奈素对照品图5-4白藜芦醇的标定a 供试品 b白藜芦醇对照品图5-5芦丁的标定a 供试品 b芦丁对照品图5-6山奈素的标定a 供试品 b山奈素对照品图5-7槲皮素的标定a 供试品 b槲皮素对照品7、相似度评价采用两种方法来进行评价:一种是相关系数法，另一种是向量夹角余弦法。分别以峰面积为指标，选择上述10批供试品指纹图谱峰面积的平均矢量，作为对照指纹图谱的峰面积，按照下列两个公式计算10批金刚藤提取物的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度。结果见表5-8。公式中Xi为某个样品对应保留时间下的峰面积；Yi为n批样品（n10）对应保留时间下的平均峰面积。表5-8金刚藤提取物HPCE指纹图谱相似度结果表明：各批次金刚藤提取物HPCE指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均达到0. 999以上，说明该工艺稳定，生产的10批金刚藤提取物的质量稳定。（三）讨论1、采用高效毛细管电泳法制定金刚藤提取物的指纹图谱，对其影响因素分别进行了考察。分别考察了三种缓冲溶液:20mmoL的磷酸氢二钠+20mmoL的磷酸二氢钠、30mmoL硼砂缓冲液、30mmoL硼砂+l0mmoL磷酸二氢钠。结果表明硼砂缓冲液基线较稳，出峰较多，故选用硼砂作为缓冲液。再分别对硼砂缓冲液的pH值、浓度、有机添加剂、检测波长及分离电压进行了考察，最终选择的色谱条件为检测波长:330nm;压力进样:5kPa, 8s; 分离电压:l0Kv;柱温:25;运行缓冲液:30mmoL硼砂-15%乙腈(pH=9.45)。2、对供试品的制备曾采用55%乙醇和55%甲醇直接溶解后过滤进样，发现较多杂质干扰，部分色谱峰未得到分离。故考虑用明胶沉淀法除去鞣质类成分的干扰。结果发现，经过明胶沉淀后，图谱的基线稳定，出峰较多，且分离度较好。3、本文研究了采用高效毛细管电泳法(HPCE)分析10批金刚藤提取物，建立了金刚藤提取物的指纹图谱，其精密度、稳定性和重现性良好，共标定了14个共有峰，指认了白藜