SDS-PAGE.doc

不连续SDS。NGE垂直电泳及考马斯亮蓝染色法实验目的 1掌提SDSPAGE的基本原理。 2掌握垂直扳状凝胶电泳槽的使用和凝胶配制方法。 3掌握考马斯克蓝法对SDS聚丙烯配胺凝胶染色的方法。 4了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用范围。实验原理 带电颗粒在电场的作用下，向与其电荷相反的电极方向移动的现象称为电泳(elecbphoKsis)。电泳的速度与带电颗粒的电荷强弱、分离介质的阻力、电解液的教度和电场强度等因素相关。生物大分子电泳的速度除上述因素之外，还与分子形状、相对分子质量大小、分子的带电性质和数目等因索有关。基于各种带电粒子在电场中迁移速度的不同，可将蛋白质、核酸等物质进行分离，此实验技术称为电泳技术。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酞胺单体和少量交联剂N，N甲叉双丙烯酰胺，在催化剂(化学聚合剂过硫酸铵或光聚合剂核黄素)和加速剂(N，N，N，N，四甲基乙二胺)的作用下聚合含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交联起来而形成三维网状结构的凝胶。改变单体Acr浓度或单体与交联剂的比例，就可以得到不同孔径的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳，可用来分离核酸(1mm，由于染色、脱色和保存过程中，凝胶的膨胀或收缩将影响迁移率的变化，因此必须测量固定前和脱色后的凝胶的长度并按下式换算，以消除误差。据此，可以将一系列已知Mr的标准蛋白质进行SDSPAGE电泳分离，然后以每个已知Mr的标准蛋白质的电泳相对迁移率为横坐标，以Mr的对数为纵坐标作图得出蛋白质Mr的标准曲线。同时将未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据电泳迁移率的测量计算结果，在标准曲线上求得相对分子量o SDSPAGE的优点：简便、快速、重复性好；样品用量少，可同时测定多种样品的分子量；分辨率高：蛋白质分离范围为10000-200000kU，可通过调节凝胶浓度来使蛋白质分离达到最佳效果。 几乎所有的蛋白质分析电泳都采用PAGE电泳。SDS能确保蛋白质解离成单个多肽亚基，并尽可能减少亚基之间的相互聚集因此如果蛋白质是由多亚基组成时，则SDS电泳所测得的蛋白质相对分子量为亚基的分子量而不是天然蛋白质的分子量。蛋白质对考马斯亮蓝的吸附与蛋白质的量大致成正比，因此可以用考马斯亮蓝染料对电泳后的蛋白质条带进行染色。 蛋白质样品制备应注意保持低温以避免蛋白质降解或修饰，在合适的盐离子浓度条件下保持蛋白质的最大溶解度和可重复性。实验器材 电泳仪、垂直板电泳槽、微量加样器、50 ml烧杯两个、移液枪等。药品试剂 15电泳缓冲液储存液(PH 83)：取Tris 75g，甘氨酸36g，SDS 25g，加水溶解后定容为500ml。使用前稀释5倍。 2TEMED(四甲基乙二胺)。 330丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液：称取292g丙烯酰胺和o8g甲叉双丙烯配胺，加水溶解后定容至100ml，过滤备用，4储存。 4分离胶Tris缓冲液(pH 88)：15mol/L TrisHCl，调整PH值为88。 5浓缩胶Tria缓冲液(pH 68)：1 mol/L TrisHCl，调整pH值为68。 610过硫酸铵溶液(新鲜配制)，配置后的10%溶液可以在4储存一周。 710SDS。 82x上样缓冲液：将2 m1 05Mol/L TrisHCl(PH 68)、2ml甘油、2ml 20 SDS，05ml 01溴酚蓝、1 ml巯基乙醇和双蒸水25ml混合后，20储存。 9染色液；0.2g考马斯亮蓝R250充分溶解在84m1 95乙醇和20ML冰醋酸中，定容至200ML，过滤备用，室温保存。 1001SDS。 11蛋白分子量标准液(商品化)：根据需要选择合适的蛋白质分子量标推溶液。在蛋白质分子量标准溶液中混合已知分子量的多种蛋白质成分。12 待测混合蛋白质实验方法 1SDS-PAGE凝胶的制备： (1)安装玻璃板：将玻璃扳清洗干净，吹风机吹干或竖直自然晾干。将长玻璃板平放于桌面上，带玻璃侧条面向上。把橡皮胶条沿玻璃板侧缘和下缘放置好，然后将带凹槽的短玻璃扳放置其上。将安好的长短玻璃板配套镶嵌入配胶架上，凹槽玻璃板朝外，夹人斜楔扳固定。在长短玻璃板之间加入少量水，看是否有漏液情况。如漏液，需重新安装玻璃板。如不漏液，则可将水倒空。在玻璃板之间插入梳子，在梳子下0.51cm处画线做标记。再取出梳子，继续下述步骤。 (2)配制分离胶：按表3-8所示依次在烧杯中加入水、30丙烯酰胺溶液、PH 8.8的1.5Mol/L Tris-HCl缓冲液、10SDS、10过硫酸铵，依次混匀后加入加速剂TEMED，迅速混匀并灌入两玻璃扳间，直至标记处。随后在凝胶液上加2ml 0.1SDS溶液覆盖以避免凝胶干燥。常温聚合1小时左右。室温低于20时，可将凝胶放人37烘箱以加速聚合。(3)配制浓缩放：待分离胶凝固之后，可见胶面与表层溶液有清晰分界面。倾去表层的溶液用滤纸吸干残余溶液，注意勿接触胶面。按表3-9所示依次在烧杯中加人水、30丙烯酰胺溶液、pH 68的1mol/L Tris-HCl缓冲液、10SDS、10过硫酸铵，依次混匀后加入加速剂TEMED，迅速混匀并灌人两玻璃板间。随后立刻在凝胶液上插人梳子，梳子平的一侧面对长玻璃扳，注意避免插入气泡。常温聚合30分钟左右。室温低于20时，可将凝胶放入37烘箱以加速聚合。 (4)将凝固好的玻璃板从配胶架上取下来，轻轻取出梳子和橡皮胶条，然后把带胶的玻璃板凹槽短玻璃板向内插入电泳槽架上，固定。并在玻璃板之间形成的内槽和外槽中加入电泳缓冲液，内槽液面需淹没过玻璃板上缘，外槽液面需掩没过玻璃板下缘数厘米。 2蛋白样品的处理：取待测样品20l，加入等量2上样缓冲液，95加热5分钟，取出冷却至室温。 3上样：用微量加祥器吸取蛋白分子量标准液和待测样品20l，分别加人梳孔中。 4电泳：加样完毕后，上槽接负极，下槽接正极，打开电泳仪，调整电压至75v，恒压电泳15-20分钟直至样品中溴酚蓝带形成一条直线，并且处于浓缩放和分离胶的分界线处。调整电压至130 v，恒压电泳，直至溴酚蓝条带跑到距离凝胶底部约0.5cm处停止电泳。 5染色：取出玻璃板，用拨胶板小心。撬开短玻璃板，并将浓缩胶去掉，将分离胶部分置于平皿中，用直尺测量凝胶长度和溴酚蓝的迁移距离并记录，然后加入适量考马斯亮蓝染色液淹没过胶面，置于摇床上常温染色5小时以上。 6脱色：染色完毕后，倒出染色液，倒人脱色液常温脱色36小时，其间更换脱色掖34次直至凝胶的蓝色背景褪去，蛋白质区带清晰为止。用直尺测量凝胶脱色后的长度以及各蛋白样品带的迁移距离。 7蛋白相对分子量的计算：首先计算各蛋白质的相对迁移率，然后以各标液蛋白质样品的相对迁移率为横坐标，其相对分子质量的对数为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，绘制出一条标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率的数值，可以直接从标推曲线上查得蛋自质的Mr。 8蛋白质浓度的估算：将脱色后的凝胶进行照相或扫描。用Ph