棉花分子图谱构建、偏分离位点的比较作图和棉花品种遗传多样性分析-硕士论文

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i n e 四甲基乙二胺 r e c o m b i n a n ti n b r e dI i n e s重组自交系 目录 摘要1 A b s t r a c t 3 1 弓I 。言5 1 1 植物遗传图谱构建研究5 1 1 1 遗传图谱的D N A 分子标记技术5 1 1 2 遗传连锁图谱的作图群体1 0 1 1 3 遗传连锁群的构建1 3 1 2 棉花分子遗传图谱研究进展1 5 1 2 1 棉属的分类及进化1 6 1 2 2 棉花的经典遗传图谱1 8 1 2 3 棉花的分子遗传图谱1 9 1 3 偏分离的研究进展2 7 1 3 1 动物的遗传偏分离2 7 1 3 2 植物的偏分离2 8 1 3 3 棉花的偏分离3 0 1 4 棉花种质资源概述及遗传多样性研究3 1 1 4 1 遗传多样性的研究方法与途径3 2 1 4 2 遗传多样性的研究方法3 4 1 4 3 遗传多样性研究途径3 6 1 4 4 我国陆地棉品种的引种及遗传变异3 9 1 5 本研究的目的与意义4 2 2 材料与方法4 3 2 1F 2 群体分子图谱构建及位点的比较作图4 3 2 1 1 供试材料4 3 2 1 2 群体构建4 4 2 1 3 实验方法4 4 2 1 4 分子遗传连锁图谱构建4 9 2 2 国内外5 7 份棉花品种遗传多样性研究4 9 2 2 1 供试材料4 9 2 2 2 材料种植5 1 2 2 3 性状调查5 1 2 2 4D N A 提取和S S R 分析5 1 2 2 5 数据处理与聚类分析5 1 3 结果与分析5 2 3 1F 2 群体分子标记连锁图谱的构建5 2 3 1 1 多态性引物筛选与群体标记基因型分析5 2 3 1 2 海陆F 2 遗传图谱的构建5 4 3 1 3 所构F 2 遗传图谱总信息一6 2 3 2 偏分离位点分析6 3 3 2 1 偏分离标记的分布6 3 3 2 2 与不同作图群体的图谱比较6 5 3 3 花粉育性的Q T L 的定位与分析一7 3 3 4 国内外棉花品种多样性分析7 4 3 4 1 参试品种的性状表现7 4 3 4 2 基于产量性状的聚类分析7 5 3 4 3 基于纤维品质性状的聚类分析7 6 3 4 4 棉花遗传多样性的S S R 聚类分析7 7 4 讨论8 0 4 1 作图亲本与群体的选择8 0 4 2 遗传连锁图谱8 0 4 3 偏分离的群体比较分析8 l 4 4 国内外棉花品种的遗传多样性分析8 2 结 论8 4 参考文献8 6 攻读硕士学位期I 训发表的论文9 9 至i i 勇 1 0 0 ，不仅是世界上纺织工业 中重要的天然纤维来源，而且也是重要的食用油来源。遗传基础狭窄已经 成为目自订限制陆地棉遗传改良的主要因素。分子遗传图谱无论在基因定位 和辅助选择以及重要基因的图位克隆方面，还是在研究棉花的基因组组织 结构和起源进化方面都具有重要的理论和应用价值。本研究利用海陆种间 杂交组合“T M 1 海7 1 2 4 ”的F 2 为作图群体，用同一材料组配了其他的4 个B C l 群体和1 个F 2 群体进行了群体比较作图，同时对5 7 份棉花品种从 表型和基因型进行了聚类分析。研究的主要结果如下： 1 利用4 5 6 对在双亲间有多态的S S R 引物，共获得6 7 7 个标记位点， 其中显性标记1 7 0 个；最后有4 8 4 个标记( 7 1 ) 标记定位在图谱上，该 图谱共有5 5 个连锁群，分布于全部2 6 条染色体上，图谱长度2 7 9 9 5 7 c M ， 标记间的平均遗传距离为5 7 8 c M 。其中A t 亚组有2 2 4 个位点，覆盖了 1 7 4 6 4 5 3c M ，标记间平均距离为7 8 3 c M ；D t 亚组有2 6 0 个位点，覆盖了 1 3 2 3 11 7 c M ，标记间平均距离5 0 5 c M 。此连锁图中，C h r 1 6 ( D 7 ) 上标记最 多( 8 2 个) ，C h r 1 4 ( D 2 ) 上标记最少( 4 个) ，C h r 1 9 的图谱最长( 2 1 5 8 7 6 c M ) ，C h r 1 4 的图谱最短( 2 6 11 3c M ) ，不同染色体上的标记平均间距 在2 1 7c M ( C h r 7 ) 1 5 7 3c M ( C h r 1 0 ) 之间。该F 2 图谱的构建为下一步 对原B C 。图谱的整合，构建一个高密度海陆遗传图谱奠定了基础。 2 。偏分离是指观察到的基因型比例偏离预期的孟德尔频率的分离方 式，它是在许多遗传作图研究发现的普遍现象。在原B C t 遗传图中A 7 、 D 7 上发现大量偏分离位点和聚集区，通过不同群体间比较作图结果表明， 在所构建的F 2 图谱中，对A 7 D 7 上的偏分离聚集区的标记与原B C I 图谱 进行了比较，在F 2 图谱上，A 7 D 7 聚集区上的偏分离位点有4 2 个，而在原 B C 。中有5 2 个偏分离位点，且F 2 中有1 5 个与原B C l 上的位点一一对应， 偏离方向一致，说明A 7 、D 7 上的偏分离区段符合S D R 的特征，并且在 不同群体间稳定检测到；在其他三个回交群体中有4 9 个标记偏分离但偏 分离情况有所不同，通过在A 7 D 7 上的聚集区中的偏分标记在不同群体 问的比较分析得出，偏分离与雄配子的选择以及细胞质效应有关。同时利 棉花分了幽讲构建、偏分离位点的比较作图和棉花品种遗传多样性 用复合区间作图在D 7 上找到一个与花粉育性相关的Q T L ，进一步说明偏 分离与雄配子选择有关。对于棉花A 7 D 7 上偏分离位点的遗传效应分析 和比较作图在国内外尚属首次。 3 在对国内外5 7 份材料的聚类分析，结果表明：品种间遗传相似系 数在O 4 5 5 5 6 之l 日J ，说明供试种质具有较大的遗传变异。根据U P G M A 法 构建聚类树状图，基于产量性状的聚类，在平均遗传距离水平上，可将 5 7 份材料分为3 类，第一类衣分最高，平均值达3 8 2 2 ，单株皮棉产量 也达到最高，平均值为2 9 3 5 9 ；第二类的籽指和单株籽棉产量最高，其平 均值达1 2 0 5 9 和7 6 7 3 9 ；第三类铃重最大为5 5 4 9 。基于纤维品质性状的 聚类，第一类整齐度和马克隆值最高，平均值分别为4 8 0 4 和4 3 6 ；第 二类的纤维长度及伸长率最大，平均值分别为3 1 5 7 m m ，7 1 1 ，第三类 的比强度最大，为3 6 1 8c N t e x 。基于S S R 分子标记的聚类5 7 份材料可 聚为三大类。不同聚类方法的结果间存在一定差异，可能与不同方法反映 的多态性水平不同。各种聚类结果都表明同一国家的品种遗传差异较小， 国家间品种存在较大差异，但也存在明显的相互渗透，多数品种没有表现 出明显的地域差异。本研究为今后这些国外材料得到更好的利用提供了依 据。 关键词：棉花；遗传图谱；连锁群；偏分离；聚类分析；S S R 2 论文 C o t t o n ( G o s s y p i u ms p p ) i sa ni m p o r t a n tc a s hc r o p I ti sn o to n l yt h e i m p o r t a n ts o u r c eo fn a t u r a lf i b e rf o rt h ew o r l d St e x t i l ei n d u s t r y , b u ta l s oa n i m p o r t a n ts o u r c e o fe d i b l eo i l N a r r o wg e n e t i cb a s eh a sb e c o m eam a i n p r o b l e mf o rg e n e t i ci m p r o v e m e n to fG o s s y p i u mh i r s u t u mL M o l e c u l a rg e n e t i c m a pp r o v i d e sa f i r mf r a m e w o r kn o to n l yf o rg e n el o c it a g g i n g ，m a r k e r - a s s i s t e d s e l e c t i o nt or e d u c el i n k a g ed r a ga n dm a p b a s e dc l o n i n go fi m p o r t a n tg e n e s ， b u ta l s of o ri n v e s t i g a t i o no fg e n o m i cs t r u c t u r ea n de v o l u t i o no fc o t t o n I nt h i s s t u d y , u t i l i z i n gi n t e r s p e c i f i cc r o s s e s ”T M 一1 XH a i 7 12 4 ”e o n s c r u c t i o nF 2 p o p u l a t i o nf o rt h em a p p i n g u s i n gt h es a m em a t e r i a l sw i t ht h eo t h e rf o u rB CI a n do n eF 2g r o u p sa n dc o m p a r a t i v em a p p i n go fp o p u l a t i o ng r o u p s ，w h i l eo f t h e5 7c o t t o nv a r i e t i e sf r o mt h ep h e n o t y p ea n dg e n o t y p ec l u s t e r T h em a i n r e s u l e sa r ea sf o l l o w s ： 1 U s i n g6 7 7m a r k e rl o c i si n c l u d i n g17 0T M ld o m i n a n tm a r k e rl o c i f r o m4 5 6p o l y m o r p h i s m i cS S Rp r i m e r s w e r em a p p e d n ep r e s e n tm a ph a d 5 5l i n k a g eg r o u p sd i s t r i b u t i n go na l l2 6c h r o m o s o m e s ，c o v e r i n g2 7 9 9 5 7 c M ， w i t ht h ea v e r a g eg e n e t i cd i s t a n c eo f5 7 8 c Mb e t w e e nt w oa d j a c e n tm a r k e r s A t s u b g e n o m el e v e l ，2 2 4a n d2 6 0m a r k e rl o c id i s t r i b u t e do nt h eA ta n dD t s u b - g e n o m ea n dc o v e r i n g17 4 6 4 5 3c Ma n d13 2 3 1 17 c M r e s p e c t i v e l y O na s i n g l ec h r o m o s o m el e v e l ，t h em a r k e rn u m b e rw a sf r o m4 ( C h r 14 ) t o8 2 ( C h r 1 6 ) ，t h em a pd i s t a n c eW a sf r o m2 6 1 1 3c M ( C h r 1 4 ) t o2 1 5 8 7 6c M ( C h r 1 9 ) 2 S e g r e g a t i o nd i s t o r t i o n ( S D ) i st h ed e v i a t i o no fg e n e t i cs e g r e g a t i o n r a t i o sf r o mt h e i re x p e c t e dM e n d e l i a nf a s h i o na n di sac o m m o np h e n o m e n o n f o u n di nm o s tg e n e t i cm a p p i n gs t u d i e s I np r e v i o u s l yB C fg e n e t i cm a p ，m o r e d i s t o r e dm a r k e r sa n ds e g r e g a t i o nd i s t o r t i o nr e g i o ni nA 7a n dD 7b ef o u n d T h r o u g hc o m p a r a t i v em a p p i n gb e t w e e nd i f f e r e n tg r o u p st h er e s u l t st h a ti nt h e m a po fF 2 t h em a r k e r so nS D Ro fA 7 一D 7w e r ec o m p a r e dw i t ht h eo r i g i n a l B CI ，i nt h eF 2m a p ，t h es e g r e g a t i o nd i s t o r t i o nl o c i so nA 7 - D 7g a t h e r i n ga r e a a r e4 2 ，a n di nt h eo r i g i n a lB C I t h e r ei s5 2s i t e s ，a n dt h e r ei s15s i t e sa r e c o r r e s p o n d e n c eb e t w e e nF 2a n dB C ! ，d e v i a t i o nf r o mt h es a m ed i r e c t i o n ， i n d i c a t i n gA 7 ，D 7s e c t i o nl i n eo nt h es e g r e g a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fS D R ，a n d d i f f e r e n tg r o u p sd e t e c t e ds t a b i l i t y ；i nt h eo t h e r t h r e eg r o u p s ，4 9m a r k e r s e g r e g a t i o n ，b u ts e g r e g a t i o ni sd i f f e r e n t ，b yt h em a r k e r so fS Do nS D Ro f 棉化分了图带构建、偏分离位点的比较作图和棉花品种遗传多样性 A 7 - D 7i nt h ec o m p a r a t i v ea n a l y s i sb e t w e e nd i f f e r e n t g r o u p st h a t ，t h e s e p a r a t i o nh a sr e l a t i o nw i t ht h ec h o i c eo fm a l eg a m e t e sa n dt h ee f f e c to ft h e c y t o p l a s m A tt h es a m et i m e ，u s i n gc o m p o s i t ei n t e r v a lm a p p i n g ，ap o l l e n f e r t i l i t yQ T Lw a sm a p p e di nt h es e g r e g a t i o nd i s t o r t i o nr e g i o no nD 7 ，w h i c h f u r t h e r p r o v et h es e g r e g a t i o n d i s t o r t i o nl o c ia n d e x p l a i n t h e p o s s i b l e m e c h a n i s mo fd i s t i o t i o nb ym a l eg a m e t es e l e c t i o n F o rc o t t o nA 7 - D 7o nt h e s e g r e g a t i o no ft h eg e n e t i ce f f e c t so fl o c ia n a l y s i sa n dc o m p a r a t i v em a p p i n gi s t h ef i r s tt i m ea th o m ea n da b r o a d 3 B a s e do np h e n o t y p t i ca n dS S Rd a t a ，g e n e t i cd i v e r s i t ya n dc a t e g o r y a n a l y s e sw e r ep e r f o r m e df o r5 7c o t t o nv a r i e t i e s l i n e sf r o mC h i n a ，U S Aa n d A u s t r a l i a R e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eg e n e t i cs i m i l a r i t yc o e f f i c i e n ta m o n g v a r i e t i e sr a n g e df r o m0 4 5t O 5 5 6 i n d i c a t i n g ar e l a t i v e l y l a r g eg e n e t i c v a r i a t i o n T h et r e ed i a g r a mo fU P G M A c l u s t e r i n g o ny i e l dt r a i t s ，a tt h e a v e r a g eg e n e t i cd i s t a n c el e v e l ，i n d i c a t e dt h a t5 7v a r i e t i e sw e r ed i v i d e di n t o t h r e ec a t e g o r i e s ，o fw h i c ht h ef i r s tc a t e g o r yh a dt h eh i g h e s tl i n tp e r c e n t a g ea n d l i n ty i e l dp e rp l a n t ，w i t ha na v e r a g eo f3 8 2 2 a n d2 9 3 5 9r e s p e c t i v e l y T h e s e c o n dc a t e g o r yp o s s e s s e dt h eh i g h e s ts e e di n d e xa n ds e e dc o t t o np e rp l a n t ( u p t o12 0 5 9a n d7 6 7 3 9r e s p e c t i v e l y ) ，a n dt h et h i r dc a t e g o r yh a dh i g hb o l ls i z e u pt o5 5 4 9 T h er e s u l to fc l u s t e r i n gb a s e do nf i b e rq u a l i t yt r a i t sa l s oh a dt h r e e c a t e g o r i e s ，a n dt h ef i r s tc a t e g o r yh a dh i g h e rf i b e ru n i f o r m i t yr a t i oa n df i b e r m i c r o n a i r er e a d i n g ，w i t ha na v e r a g eo f4 8 0 4 a n d4 3 6 ，r e s p e c t i v e l y ；t h e s e c o n dc a t e g o r yp o s s e s s e dh i g h e rf i b e rs p a nl e n g t ha n df i b e re l o n g a t i o nw i t h a na v e r a g eo f31 5 7m ma n d7 1l r e s p e c t i v e l y T h et h i r dc a t e g o r yh a dh i g h e r a v e r a g ef i b e rs t r e n g t ho f3 6 18c N t e x C l u s t e r i n gb a s e do nS S Rm a r k e r s ，5 7 g e r m p l a s m sc o u l db ec l u s t e r e di n t ot h r e ec a t e g o r i e s S o m ed i f f e r e n c e sw e r e f o u n da m o n gr e s u l t so fd i f f e r e n tc l u s t e r i n gm e t h o d s ，w h i c hm a yb er e l a t e dt o t h ed i f f e r e n t g e n e t i cd i v e r s i t y l e v e l so fd i f f e r e n t p h e n o t y p i ct r a i t s a n d m o l e c u l a rg e n o t y p e su s e di n t h i ss t u d y A l lc l u s t e r i n gr e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h e r ew e r er e l a t i v e l yl a r g e ra n ds m a l l e rg e n e t i cd i v e r s i t ya m o n gv a r i e t i e sf r o m o n ec o u n t r ya n df r o md i f f e r e n tc o u n t r i e s ，r e s p e c t i v e l y , w i t ho b v i o u sm u t u a l p e n e t r a t i o n b e t w e e nc o u n t r i e s O n l yaf e wv a r i e t i e ss h o w e ds i g n i f i c a n t g e o g r a p h i c a ld i f f e r e n c e s K e y w o r d ：c o t t o n ；l i n kg r o u p ；s e g r e g a t i o nd i s t o r t i o n ；S S R ；c l a s t e ra n a l y s i s ； g e n e t i cm a p p i n g ； 4 学硕士学位论义 1 1 植物遗传图谱构建研究 1 1 1 遗传图谱的D N A 分子标记技术 遗传标记( G e n e t i cm a r k e r ) 是指与目标性状紧密连锁、共同分离且易于 识别的可遗传的等位基因变异，是研究生物遗传变异规律及其物质基础的 重要手段，长期以来遗传育种学家通过各种宏观或微观的遗传标记来研究 生物的遗传变异现象，揭示其内在规律，并以此来指导和辅助育种工作。 在遗传学研究中遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图、基 因转移及追踪选择等。 遗传标记可分为形态标记、细胞学标记、生化标记及D N A 分子标记 四种类型。由于前三遗传种标记具有数量少、多态性低、对环境敏感等缺 点，从而限制了其在遗传研究中的应用。理想的遗传标记应具备多态性高、 遗传稳定、遗传行为简单、能检测整个基因组、不受外界环境影响、操作 经济简单等基本特征。D N A 标记是D N A 水平上遗传变异的直接反映，最 能稳定遗传且信息量大，许多多态标记在非编码区表现选择“中性”，不 受内、外环境影响，与基因是否表达无关，检测迅速，操作也方便。由此 可见，D N A 分子标记是目前最理想的遗传标记。 分子标记( M o l e c u l a rm a r k e r ) 广义是指可遗传并可检测的D N A 序列或 蛋白质，也就是说包括D N A 水平和蛋白质水平的标记，其中蛋白质标记 又包括种子储藏蛋白、同工酶( 指由一个以上基因位点编码的酶的不同分 子形式) 及等位酶( 指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分 子形式) 。狭义的分子标记是指D N A 标记。 从1 9 8 0 年R F L P 概念的首次提出( B o t s t e i ne ta 1 ，1 9 8 0 ) 及1 9 8 5 年P C R 技术的诞生至今分子标记经历了三代，可分为四类： 第一代是基于分子杂交技术的分子标记，代表性技术为限制性片段长 度多态。 生( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，R F L P ) ( G r o d i z i c k e r e ta 1 ， 1 9 7 4 ) 。 第二代是基于P C R 技术的分子标记，可分为两类： 棉化分了图带构建、偏分离位点的比较作图和棉花品种遗传多样性 一为基于P C R 的D N A 分子标记，包括随机引物及特意引物，随机引 物主要有随机扩增多态性( R a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i c D N A ，R A P D ) ( W i l l i a m se ta 1 ，19 9 0 ) 及简单序列重复区间( I n t e rs i m p l e s e q u e n c er e p e a t ，I S S R ) ( Z i e t k i e w i c ze ta 1 ，1 9 9 4 ) ；特意引物主要有简单序列 重复( S i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，S S R ) ( L i t ta n dL u t y , l9 8 9 ) 及序列标签位点 ( S e q u e n c et a g g e ds i t e ，S T S ) ( F r e g e a ue ta 1 ，19 9 3 ) 。序列特异性扩增区 ( S e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n s ，S C A R ) ( G u p t ae ta 1 ，19 9 4 ) 是由 R A P D 标记转化来的。 二为基于P C R 与限制性酶切技术结合的D N A 标记，包括限制性酶 切片段的选择性扩增，即扩增片段长度多态性( A m p l i f i c a t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，A F L P ) ( Z a b e a ua n dV o s ，1 9 9 3 ) ；P C R 扩展片段的限制 性酶切，即放大剪切序列多态性( C l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i c s e q u e n c e ，C A P s ) ( A k o p y a n z ，19 9 2 ) 。 第三代是基于单个核苷酸多态性的D N A 标记，即单核苷酸多态性 ( S i n g l en u c l e t i d ep o l y m o r p h i s m s ，S N P s ) ( L a n d e r , 19 9 6 ) 。 近年来，发展了一些新型的分子标记技术。包括：序列相关扩增多态 性( S e q u e n c e s r e l a t e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ，S R A P ) ( L ia n dQ u i r o s ，2 0 01 ) 及 由其演变来的靶位区域扩增多态性标记( T a r g e tr e g i o na m p l i f i e d p o l y m o r p h i s m ，T R A P ) ( H u j g ，2 0 0 3 ) ；基于反转座子的标记技术( R T N b a s e d m a r k e rt e c h n o l o g y , R T Nm o l e c u l a rm a r k e r ) 包括，序列特异扩增多态性 ( S e q u e n c e s p e c i f i ca m p l i f i c a t i o np o l y m o r p h i s m ，S S A P ) 及反转录转座子微卫 星扩增多态性( R e t r o t r a n s p o s o n - m i c r o s a t e l l i t ea m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ， R E M A P ) ( K a l e n d a re ta 1 ，19 9 9 ) 等。 这些D N A 分子标记在不同作物中被不同程度的应用于遗传图谱构 建、辅助选择、品种鉴定及遗传资源的研究中。当前，植物遗传作图主要 有以下几类标记： 1 1 1 1R F L P R F L 时旨用D N A 限制性内切酶酶切不同个体基因组后，含同源序列的 酶切片段在长度上的差异( B o s t e i ne ta 1 ，1 9 8 0 ) 。这类酶切片段长度多态性 要利用放射性同位素或荧光素标记的探针依靠分子杂交检测。一般R F L P 山东农业大学硕上学位论文 是由于酶切位点上碱基插入、缺失、倒位、突变等形成的，故R F L P 呈共 显性( c o d o m i n a n t ) 遗传。但研究发现在许多情况下，R F L P 表现零等位现 象，即呈显性( d o m i n a n t ) 遗传。这种情况可以解释为酶切片段上与探针 同源序列的变异。但无论何种情况，R F L P 标记在正常的分离群体中都呈 典型的孟德尔式遗传。R F L P 标记因在大多数情况下表现为共显性遗传， 而且S o u t h e r n 杂交检测稳定可靠，其在植物遗传作 骄I Q T L 定位中具有非 常突出的优势。目前大多数作物的分子连锁图谱是用R F L P 标记构建。 R F L P 标记是棉花上最早使用的分子标记。早在19 8 9 年，W e n d e l 等利 用R F L P 对四倍体棉种和A 、D 染色体组的二倍体棉种的叶绿体D N A ( c p D N A ) 进行研究，其结果表明：四倍体棉种细胞质中的c p D N A 与A 染色体组的二倍体棉种类似，在棉花多倍化的过程中，c p D N A 具有明显的 保守| ! 生( W e n d e le ta 1 ，1 9 8 9 ) 。1 9 9 4 年B r u b a k e r 对栽培陆地棉和海岛棉不同类 型的c p D N A 和核基因组D N A ( g D N A ) 进行了R F L P 分析，他们认为陆海 两个棉种的种质渗透模式不同，陆地棉向海岛棉的种质渗透主要表现在现 代品种上；而海岛棉向陆地棉的基因渗透在现代品种中不多。另外他们认 为在两个棉种的基因渗透中，核基因的渗透量远远超过胞质基因( B r u b a k e r e ta 1 1 9 9 4 ) 。 1 1 1 2R A P D W i l l i a m s 等基于P C R 技术发明了随机扩增多态性D N A ( R A P D ) 分子 标记技术( W i l l i a m s e ta 1 ，1 9 9 0 ) 。同时，另外一个实验室也发明了相同的技 术，称为任意引物P C R ( A r b i t a r yp r i m e rP C R ) 臣 J A P P C R ( W e l s he ta 1 ， 1 9 9 0 ) 。该技术利用9 或1 0 碱基的寡核苷酸随机引物对基因组D N A 进行扩 增，当模板D N A 上存在两个或两个以上与引物同源的位点，那么随机引 物就会在P C R 反应体系中介导D N A 呈几何级数扩增。如果基因组D N A 上 与引物的同源序列产生了变异，使引物的结合位点消失，则扩增不出相应 的D N A 条带，因此，这样的多态性位点呈显性遗传。如果由于引物结合 位点之问的缺失或插入或是在两个适宜位点之间增加了一个位点，则会产 生扩增片段的长度多态性，这样的标记位点则会表现出共显性遗传的特 点。一般的R A P D 都是显性的，但已经发现一些R A P D 标汜位点表现为共 棉化分了图谱构建、偏分离位点的比较作图和棉花品种遗传多样性 显性遗传。 由于R A P D 标记使用随机引物，具有简便快捷、安全和费用较低的优 点，而且不同的物种都可以共用一套引物。一般的实验室可以非常方便地 建立起R A P D 检测的技术体系。因此R A P D 标记己广泛应用于遗传作图。 R A P D 标记已经用于棉花的遗传多样性研究( M u l t a n ie ta 1 ，1 9 9 5 ；T a t i n e n ie t a 1 ，1 9 9 6 ；I q b a le ta 1 ，1 9 9 7 ；王新宇等，1 9 9 7 ；宋立国等，1 9 9 9 ) 、棉花品种 或杂交种纯度的鉴定( 郭旺珍等，1 9 9 6 ；易成新等，1 9 9 9 ；G u oe ta 1 ，1 9 9 8 ) 、 棉花的一些重要农艺性状的标记与定位( 郭旺珍等，1 9 9 7 ；袁有禄等， 2 0 0 1 ) 。 1 1 1 3A F I P A F L P 为扩增限制性片段长度多态性( Z a b e a ue ta 1 ，1 9 9 3 ；V o se ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。与R F L P 一样，A F L P 标记的多态性也是由限制性内切酶酶切基因 组D N A 产生的。不同的是，它利用P C R 技术来检测酶切产生的特异片段。 具体的原理与技术是：使用两种不同的限制性内切酶切割基因组D N A ， 通过将酶切片段两端接上不同的接头( a d a p t e r ) 序列( 己知的寡核苷酸序 列) ，即可作为P C R 反应的模板。P C R 引物由三部分组成，5 端对应于接头 序列，中间对应于酶切位点，3 端为选择性碱基( 1 3 个) ，引物长度一般 为( 1 8 2 0 个碱基) 。通过选用两种限制性内切酶和3 端选择性碱基的组合 选择性地对酶切片段进行扩增。扩增产物利用测序凝胶放射自显影方法检 测多态性。由于A F L P 是限制性内切酶与P C R k 侣结合的一种技术，因此具 有R F L P 技术的可靠性与P C R 技术的高效性。与R F L P 相比，A F L P 不需要 S o u t h e r n 杂交，故只需少量D N A ，实验结果稳定可靠，产生多态性位点多， 可以提供丰富的信息。因此被认为是迄今为止作图效率最高的分子标记。 从理论上讲，不论所研究的基因组有多复杂，用A F L P 均可以检测出任何 D N A 之间的多态性。A F L P 主要的不足之处是，需要放射性同位素或非放 射性的荧光标记或生物素标记引物，相对比较费时费力。但人们已经逐渐 采用标记引物的银染检测方法( B r i a r de ta 1 ，2 0 0 0 ；朱玉国等，2 0 0 1 ) ，使得 A F L P 的造价大大降低，可操作性增强。A F L P 因其检测的多态性非常丰富