《遗传毒性试验》PPT课件.ppt

遗传毒性试验,主要内容,1.遗传毒性试验,GBT16886.1-2001持久表面粘膜接触类持久损伤表面接触类持久血路接触类长期组织/骨/牙接触长期循环血液接触长期植入类医疗器械,2.遗传毒性试验涉及的医疗器械类样品,人工食道、接触眼镜、宫内节育器创伤、愈合和保护用敷料（烫伤用敷料、硅橡胶纱布）,3.遗传毒性试验内容,遗传毒性-食品检测,Ames试验,Ames试验原理,.,.,.,鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型（his）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成微菌落。,受诱变剂作用后，大量细菌发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成2倍以上阴性对照的菌落数。,Ames试验流程,溶液和琼脂的配置,0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液顶层琼脂培养基磷酸盐缓冲液20%葡萄糖溶液底层培养基营养肉汤培养基S9混合物阳性物：敌克松（TA97、TA98和TA102），1.0mg/ml，用DMSO配制；叠氮钠（TA100）,1.0mg/ml。活化组用2-蒽基芴（TA97,TA98,TA100），0.1mg/ml;1,8-二羟基蒽醌（TA102）0.6mg/ml.,菌株鉴定,鉴定内容,组氨酸缺陷性鉴定,TA97TA98TA100TA102,TA97TA98TA100TA102,无组氨酸,有组氨酸,脂多糖屏障缺陷鉴定,TA97TA98TA100TA102,结晶紫染色,沾有结晶紫的滤纸片,R因子鉴定,TA97TA98TA100TA102,青霉素,沾有青霉素滤纸片,四环素鉴定,TA98TA102,四环素,沾有四环素滤纸片,uvrB突变鉴定,TA97TA98TA100TA102,紫外线照射8s,33cm,自发回复突变鉴定,底层培养基,顶层培养基+菌液,每个菌株做两个平行皿,平板渗入试验,试验前准备,样品剂量设定,平板分组,阴性,阴性,阴性,阴性,阳性,阳性,阳性,阳性,样品,样品,样品,样品,TA97,TA98,TA100,TA102,平板分组,阴性,阳性,样品,TA97,试验,底层培养基,每支试管,结论判断,倒置培养48h后，计算每皿菌落数。阴性对照组回变菌落数应在预期范围内，阳性对照组回变菌落数应至少为预期范围的3倍。否则对不在范围内的菌株应重新试验。试验样品组变异频率比阴性对照至少增加两倍（即回变菌落数2阴性对照数）即为阳性反应。只要有一个试验菌株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性,体外哺乳动物细胞染色体畸变试验,试验原理,在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。,试验流程,染毒,样品设计三个剂量，0.2g/ml0.1g/ml0.05g/ml染毒过程分加S9混合物和不加S9混合物,阴性,S1,阴性,S1,S2,S2,S3,S3,阳性,阳性,-S9&+S9,-S9阳性对照为甲磺酸甲酯+S9阳性对照为环磷酰胺,秋水仙素处理，收细胞，制片,消化细胞后加含血清培养液，以1200r/min离心7min，弃上清。加入0.075mol/L氯化钾溶液7ml，于37水浴低渗处理7min，加入2ml固定液，以1500r/min离心5min7min，弃去上清液。再加入7ml固定液，固定7min，以1500r/min离心7min，弃上清。同法再固定12次，弃上清，加入数滴新鲜固定液自然干燥，用姬姆萨染液染色。,制片,结论判断,在光学显微镜下每一试验组选择100个分散良好的中期分裂相进行染色体畸变分析染色体结构异常包括：裂隙、断裂、微小体，单体互换等用2检验或其他适当的显著性检验方法，对所得试验数据进行统计学处理。当各剂量组与阴性(溶剂)对照组相比，畸变细胞率的增加有显著性意义，并有剂量-反应关系时；或仅一个剂量组有显著性意义的增加，并经重复试验证实时，可判为该受试物在本试验中具有致突变性。,当畸变率4.9%为阴性，5.0%9.9%为可疑阳性，10%19.9%为+，20%49.9%为+，50%为+,注意事项,1.剧毒物质：敌克松、叠氮钠、2-蒽基芴、1,8-二羟基蒽醌、多氯联苯、甲磺酸甲酯2.操作中，避免菌株的交叉污染3.废弃菌液煮沸10min处理4.低渗时间的把握5.染色体结构异常的判断,扩项的实验设备和试剂,Ames实验培养箱、水浴摇床、水浴箱、灭菌器、烘箱、普通冰箱、液氮灌、电子天平等组氨酸、生物素、琼脂粉、氯化钠、柠檬酸、磷酸氢二钾、磷酸氢氨钠、硫酸镁、葡萄糖、牛肉膏、胰胨、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠