动物细胞培养和核移植技术新医学PPT.ppt

动物细胞融合,单克隆抗体技术,动物细胞核移植,（基础）,在治疗烧伤病人时，通常采用的方法是取烧伤病人健康皮肤进行自体移植。但对于一个大面积烧伤的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源不足，而且会产生免疫排斥反应。,动物细胞培养技术,那么，怎么才能获得大量的自体健康皮肤呢？,1、概念：,就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,2、原理：细胞增殖,（有丝分裂）,概念：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。,胰蛋白酶/胶原蛋白酶处理,取出组织块,胚胎或幼龄动物器官组织,剪碎,单个细胞,细胞悬液,原代培养,细胞悬液,CO2培养箱,增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养,3.过程,加培养液,特点：细胞贴壁生长，长成单层细胞；有接触抑制现象；,转入培养瓶内进行原代培养,贴壁过程,细胞贴壁：,培养瓶或培养皿壁要求：,内表面光滑、无毒、无菌、易于贴附,在培养瓶悬液中分散培养的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。,原代培养特点,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,细胞的接触抑制,原代培养特点,接触抑制：,传代培养（扩大培养）,CO2培养箱,当原代培养的细胞处于接触抑制后,用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）,分瓶扩大培养：以1:2或l:3以上的比率进行分装,1050代细胞,无限传代,分瓶,胰蛋白酶,原代培养接触抑制,110代细胞,传代培养,单层细胞,细胞核型保持正常,多层细胞,细胞突变核型改变,第一次危机,第二次危机,部分细胞核型可能改变,癌细胞（不死性，无限增殖，失去接触抑制，易转移）,传代培养特点,单层细胞,每分瓶扩大培养一次为一次传代；传代代数就是分瓶次数；每一代的细胞培养，从细胞贴壁到贴满瓶壁过程中，细胞分裂了很多次；,思考题,传代培养中,传代代/次数与细胞增殖/分裂次数是否相同？,1.为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？,成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖，也不利于细胞营养物质的吸收和代谢废物的排出。,思考题,2.胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？,胰蛋白酶水解蛋白质,细胞间的成分是蛋白质,不能，因为两者的最适pH不同,胰蛋白酶长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，因此必须控制好胰蛋白酶的处理时间。,4.传代培养的细胞能一直传代下去吗？,5.有些为何能一直传下去？,不都能。传代培养到50代左右的时候，大部分的细胞都停止分裂，最终衰老死亡；但有少数细胞能够继续传代。,这些发生突变，获得不死性，朝着癌细胞方向发展（成为了癌变细胞）,3.如果培养的细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？,用胰蛋白酶处理将贴满瓶壁的细胞分离下来，然后分瓶后继续培养（传代培养）,8.动物细胞培养能否像植物组织培养那样最终培养出新个体？,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能形成新的动物个体,7.动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？,可以得到细胞，也可以得到细胞产物,6.人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？,保存10代以内的细胞，可以保持细胞正常的二倍体核型；而10代以后的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展,4.动物细胞培养条件,1.无菌、无毒的环境,对培养液和培养用具进行无菌处理；在培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液；,2.营养,葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等,+动物血清或血浆,3.温度和pH,温度36.50.5度，pH7.27.4,4.气体环境,95%空气和5%CO2（CO2培养箱提供）,合成培养基,不能用胃蛋白酶代替胰蛋白酶,O2是细胞代谢所必需的；,CO2维持培养液的pH,获得细胞,细胞的全能性,细胞或细胞产品,新的个体或细胞产品,培养结果,或细胞产物,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物组织培养和动物细胞培养的比较,葡萄糖等、,动物血清,5.动物细胞培养技术的应用:,1.生产生物制品如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.应用于基因工程主要用于作为受体细胞3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性4.细胞的生理、药理、病理研究如用于筛选抗癌药物,1.用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）A.容易产生各种变异B.具有更强的全能性C.取材十分方便D.分裂增殖的能力强,【随堂练习】,D,2.动物细胞培养的特点（）细胞贴壁有丝分裂细胞分化接触抑制减数分裂原代培养一般传代110代A、B、C、D、,A,3.下列属于动物细胞培养与植物组织培养主要区别的是（）A.培养基成分不同B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株,A,C项：愈伤组织条件适宜可以传代培养不分化（扩大培养）D项：正因为C项，因此植物细胞也可以培养成大量细胞,4.回答下列有关动物细胞培养的问题：（1）在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的。此时，瓶壁上形成的细胞层数是。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的是。（2）随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现的现象；但极少数细胞可以连续增殖，这些细胞因遗传物质发生改变而变成细胞，该种细胞的黏着性，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量。,相互接触,接触抑制,单层,胰蛋白酶,衰老或死亡,不死性/癌,降低,减少,（3）检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到期的细胞用显微镜进行观察。（4）给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作进行攻击。,中,抗原,植物组织培养中，外植体在适当的培养条件诱导下，可形成完整的植株。,想一想,那么，离体的动物组织细胞也能够通过一定的诱导，发育成一个完整的动物体吗？,分化潜能变弱：其全能性随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变弱。（这是对整体细胞而言）,细胞核仍具有全能性：细胞核，含有保持物种遗传性所需的全套基因，而且并没有因细胞分化而丢失基因，因此高度分化细胞的细胞核仍具有全能性。,对于动物细胞来说：,根据动物细胞核仍具有全能性的特点，怎样将动物细胞的全能性表现出来?,克隆动物的获得，实际上利用核移植技术来实现的,想一想,二.动物细胞核移植技术和克隆动物,将动物细胞(供体)的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞(受体)中，使其重组(重组细胞)并发育成为一个新的胚胎(重组胚胎)，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）。,1.动物细胞核移植概念：,(难度高；成功率低),P51核移植技术,采集卵母细胞,供体奶牛,2.体细胞核移植的过程：,供体细胞（供核）,细胞培养,体细胞,卵巢卵母细胞（M中期：供质）,去核,无核卵母细胞,注入,细胞融合,重组细胞,构建重组胚胎,胚胎移植,代孕母体,生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛,2.共分成两大阶段：核移植和胚胎移植,2.体细胞核移植的过程：,动物细胞培养、核移植、胚胎移植,1.整个过程用了哪些技术？,1.原理？,2.体细胞核移植的过程：,动物细胞核的全能性,2.繁殖方式？,无性繁殖（克隆）,3.有人说它上述的克隆牛有三个母亲，对吗？,4.新生牛的性别、基因？,性别与供体相同、基因与供体的基本相同,5.体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,不是。克隆动物的性状与核供体生物的性状基本相同，而不是完全形同。因为克隆动物的细胞质遗传物质来自于受体卵母细胞。此外，生物的性状还受环境的影响。,供体亲本：优质高产奶牛（供核）,受体亲本：普通奶牛（提供去核卵母细胞）,代孕亲本：优质高产奶牛,7.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植动物的核遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。,6.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？,10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变。,8.为什么受体细胞选取减数第二次分裂中期（M期）的卵母细胞？,它是最大的细胞，细胞核的位置靠近第一极体，用微吸管可以将其细胞核和第一极体吸去，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件（它发育可直接表达性状）。,物理方法：电脉冲等化学方法：钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等,电刺激,11.激活重组细胞的方法：,9.促进供体细胞和受体细胞细胞融合的方法：,10.对重组细胞进行激活的目的：,激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育过程,（三）体细胞核移植技术的应用前景,1、畜牧业方面：,2、医药卫生方面：,可以加速家畜遗传改良的进程，促进优良畜群繁育,保护濒危物种，增加其存活数量,转基因的克隆动物：生产医用蛋白质；用作器官移植的供体；,3、其他领域,了解胚胎发育及衰老过程,用克隆动物作为疾病模型，更好追踪研究疾病的发展过程、治疗疾病,1)成功率很低代孕母体产下的活的克隆动物占移植克隆胚胎的比率平均不到10%。2)克隆动物存在健康问题许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷、免疫缺陷等。3)克隆技术的各个环节有待进一步改进4)对克隆动物产品的安全性存在争议,4、体细胞核移植存在的问题,1.下列关于体细胞克隆的叙述，错误的是（）A供体为体细胞的细胞核B受体为去核卵母细胞的细胞质C细胞核移植是体细胞克隆的关键步骤D克隆出的后代与供体的遗传物质和表现型完全一致,D,随堂练习,2.动物细胞体外培养时，通常要在培养基中补充一定浓度的某些物质。下图是血清对正常细胞和癌细胞培养影响的实验结果。从该图提供的信息可以获得的结论，错误是（）,A正常细胞与癌细胞的增殖速率相同B有无血清对正常细胞培养的影响不同C培养基中补充血清有助于正常细胞的培养