Zn超氧化物歧化酶基因（MrSOD1）cDNA的克隆及表达分析

中国荩 学通报 2 0 1 0 ， 2 6 ( 2 2 ) ： 2 7 3 3 Chi ne s e Ag r i c ul t u r a l S c i e nc e Bu l l e t i n 杨梅 C u Z n 超氧化物歧化酶基 因( Mr S OD1 ) e DNA的克隆及表达分析 王 芳， 董 乐， 戴聪杰， 林 娈 ， 林 静 ( 泉州师 范学 院化学与 牛命科学 学院， 泉州 3 6 2 0 0 0 ) 摘 要 ： 以杨梅 叶为材料 ， 利用R T _ P C R技术克隆C u Z n 超氧化物歧化酶基 因， 并利用半定量R T - P C R方法 分析该基 因在不 同组织中的表达。获得 1 个杨梅 c u Z n S O D基 因编码 区全长c DN A序列， 长度为4 6 1 b p ， 编码一个由 1 5 2个氨基酸残基组成的蛋 白质。该蛋 白质具有C u Z n S O D的特征信号序列 ； 序列同源性 分析表 明 ， 其与 Ge n Ba n k中注册 的C u Z n S OD序 列的 同源性均在 7 7 以上 。该基 因命 名为Mr S O D1 ( Ge n B a n k 登 录号： GQ 4 0 4 5 1 0 ) 。半定量R T - P C R分析显示， Mr S O D1 在 4 种组织中表达量为 ： 果 叶 花 枝条。本试验 为进一步研 究Mr S O D1 的时空表达特性、 调控途径及杨梅抗氧化伤害的分子机理奠定基 础 。 关键词 ： 杨梅 ； C u Z n 超氧化物歧化酶 ； 基 因克隆； 组织表达 中图分类号 ： $ 6 6 3 9 ， Q5 2 3 文献标志码 ： A 论文编号： 2 0 1 0 2 8 1 6 Mo l e c u l a r C l o n i n g a n d E x p r e s s i o n An a l y s i s o f Cu Z n S u p e r o x i d e D i s mu t a s e Ge n e ( Mr S O D1 ) c DNA f r o m M yr i c a ru br a Wa n g F a n g ， D o n g L e ， D a i C o n g j i e ， L i n L u a n ， L i n J i n g ( S c h o o Z o fd h e m f s t r ya a dZ 3 a c e , 0 。 。 矗 o A b r ma C o e g e , Q u a n z h o u F u j i a n 3 6 2 0 0 0 ) Ab s t r a c t ：A f u l l - l e n g t h e DNA s e q u e n c e s o f C u Z n - S OD wa s c l o n e d f r o m My r i e a r u b r a l e a v e s b y u s i n g t h e RT - P C R t e c h n o l o g y ，a n d t h e e x p r e s s i o n l e x r e l s o f t h i s g e n e i n d i f f e r e n t t i s s u e s we r e f o u n d t h r o u g h s e mi q u a n t i t a t i v e RT P C R me t h o d T h e f u l l l e n g t h w a s 4 6 1 b p e n c o d i n g a 1 5 2 a mi n o a c i d s C u Z n S OD o r t h o l o g Th e s e q u e n c e s c o n t a i n e d t h e Cu Zn -SOD f a mi l y s i g n a t u r e s e q ue n c e a nd h a d t h e h o mo l o g y mo r e t h a n 77 c o mp a rin g wi t h o t he r Cu Zn S OD f r o m Ge n Ba n k Thi s g e n e wa s n a me d a s Mr SOD1 f Ge nBa n k a c c e s s i o n N o G Q 4 0 4 5 1 0 ) T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f Mr S O D1 i n d i f f e r e n t t i s s u e s w e r e f r u i t l e a f fl o w e r s h o o t T h e s t u d y p r o v i d e d a wa y f o r d e e p r e s e a r c h o n t h e e x p r e s s i o n a n d r e g u l a t i o n o f Mr S O D1 ， a n d t h e mo l e c u l a r me c h a n i s m o f a n t i -o x i d a t i v e e f f e c t i n My r i c ar u b r a Ke y w o r d s ： My r i c a r u b r a ； C u z n s u p e r o x i d e d i s mu t a s e( C u - Z n - S O D ) ； g e n e c l o n i n g ； t i s s u e e x p r e s s i o n 0 引言 超 氧 化物 歧 化酶( s u p e r o x i d e d i s mu t a s e ， E C1 5 1 1 ， S O D) 是一个金属酶家族 ， 且是 唯一能特异 性清除生物体代谢所产生的超氧阴离子 自由基 ， 防止 生物分子氧化 的酶n 。它们广泛存在于动物 、 植物及 微生物中。根据酶活性中心的辅基部位结合的金属离 子 的不 同 ， S O D通 常可 分 为 3种类 型 ： C u Z n S O D、 F e S O D和 Mn S OD t 。高 等植 物 中 以 C u Z n S O D最 为丰富。此外， K i m发现在 S t r e p t o m y e e s s p I MS NU - 1 中 存在 一种 以Ni 作为辅基 的 S OD酶 ， 而 S c o e l i c o t o r 报 基金项 目： 福 建省教育厅科技 计划项 目“ 杨梅超 氧化物歧化酶 基因的分子 克隆及表达分析” ( 2 0 0 9 J A0 9 2 1 2 ) ； 泉州市优秀人才 培养专项经 费资助“ 杨 梅超氧化物歧化 酶基因的分子克 隆及表达分析 ” ( 0 9 A0 7 ) ； 福建省高校 服务海西建 设重 点项 目“ 泉州湾湿 地生态修复和综 合开发的研究” ( A1 0 1 ) ： 福 建省大学生创新性试验计划项 目“ 杨梅超氧化物歧化酶基 因的分子 克隆及表 达分析” ( 2 0 1 0 C XS Y1 6 ) 。 第一作者简介 ： 王芳 ， 女， 1 9 6 9 年 ， 副教授 ， 博 士研究生， 主要从事植物 分 子生物学研 究。通信地址： 3 6 2 0 0福建省泉 州市东海滨城泉州师范学 院化学 与生命科 学学院， T e l ： 0 5 9 5 2 2 9 1 9 5 6 3 ， E ma i l ： d wf 3 2 0 1 6 3 c o r l l 。 通讯作者 ： 董乐， 男， 1 9 6 6 年， 河北丰南人 ， 高级工程帅 ， 硕士研 究生， 土要从事动植物分子生物学研究 。通信地址 ： 3 6 2 0 0福建省泉 H I 市 东海滨城泉州 师 范学 院化学与 生命科 学学 院， T e I ： 0 5 9 5 2 2 9 1 9 5 6 3 ， E ma i l ： d o n g l e 3 2 0 1 6 3 c o m。 收稿 日期 ： 2 0 1 0 0 9 2 8 ， 修回 日期 ： 2 0 1 0 1 0 2 0 。 2 8 中国农 学通报h t t p ： w ww c a s b o r g c n 道存在类似于F e S O D的F e Z n S O D 。 植物 生长随时可能遭受到不 良环境 因子诸如高 温、 低温、 于早、 水涝、 高盐、 强光以及病原菌的影响， 各 种逆境胁迫会引起活性氧代谢平衡穴调 ， 最终导致生 物膜 结构 的破坏 ， 是植物遭受逆境伤害的机理之一。 S OD是植物体 内活性氧清 除系统中第一个发挥作用 的抗氧化酶， 该酶在逆境胁迫下增强表达能够提高植 物清除活性氧的能力， 增加植物 的抗逆性。烟草在光 照条件下C u Z n S O D基 因转录产物增加 ， 无光条件下 转录产物减少 。除草剂、 机械损伤和 乙烯能增加番 茄细 胞质和 叶绿体 C u Z n S O D基 因转 录产 物 的积 累。干旱引起番茄细胞质 C u Z n S OD基 因的转录产 物急剧积累 】 。小麦C u Z n S O D基因的表达受低温的 诱导 。另外， G u p t a t 报道， 豌豆 C u Z n S OD转化烟草 得到 的转基因植株 S OD活性提高了3 倍， 抗坏血酸过 氧化物酶( AP x) 活性同时提高了3 - 4倍， 转基因烟草 在低温和强光下光合作用产物增加 ， 对除草剂引起的 氧胁迫 的耐受性增强。上述结果表明， C u Z n S O D基 因在植物抗逆性中发挥着重要的作用 。 自从第 一个植物 S O D基 因从玉米中克隆以后 ， 植物 D D基因的克隆在 国外进展迅速。科研工作者 主要从一些经济作物 中得到 S O D基 因的c DN A序列 或 表 达 序 列 标 签 ( e x p r e s s e d s e q u e n c e t a g s ， E S T )。 F e S O D 基 因 也 从 水 稻 ( O r y z a s a t i v a L ) 、 拟 南 芥 ( A r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) 、 大豆 ( G l y c i n e ma x ) 、 白花丹 叶 烟草( Ni c o l i a n a p l u mb a g i n i f o l i a ) 和樟树 ( C i n n a mo mu m c a mp h o r a ) 等高等植物中得到克隆。C u Z n S OD有较 多的保守位点。这为同源 P C R克隆策略提供了依据 。 目前对许 多生物 的C u Z n S O D及其基 因进行 了广泛 的研究， 朱虹琳等“ 伽 克隆了莲 C u Z n S O D基因， 黄 明 克隆了甘薯叶片C u Z n S O D基因。 杨梅 ( My r i c a r u b r a ( L o u r ) S i e b a n d Z u c c ) 是双子 叶纲杨梅科( My c i c a c e a e ) 杨梅属( My r i c a L ) 常绿灌木 或小乔木， 是原产于中国的亚热带果树之一 。杨梅喜 温暖湿润气候， 耐阴， 喜排水 良好 的酸性土， 微碱性土 壤也能适应， 深根性， 萌芽力强。以杨梅为研究对象进 行 S O D基因与植物抗逆性关系的研究迄今 尚未见报 道 。本研 究 旨在克 隆杨梅 S O D基 因( 该基 因命名为 Mr S O D1 ) 的 e D N A序 列 ， 为研 究该基 因时空表 达特 性 ， 探索其调控途径及杨梅抗氧化伤害的分子机理奠 定基 础 。 1材料与方法 1 1试 验材料 I 1 1植物材料 供试杨梅为泉州师范学院校园内种植 品种 。 1 1 2载体 p C R ( ) 2 1 V e c t o r 购自I n v it r o g e n 公司。 1 1 3 菌株 大肠杆菌 ( 叵 c o l i ) DH5 a 为东北师 范大学 提供菌种。 1 1 4 试剂 E c o R I 及其 B u ff e r 购 自NE B公司； T 4 D N A 连接酶及连接 B u f f e r 和 T a q D NA聚合酶及 B u ff e r 购 自 I n v i t r o g e n 公司。P C R凝胶 回收试剂盒和质粒精提试 剂 盒 均 购 自 Q I A GE N公 司 ； c D NA合 成 试 剂 盒 和 R T - P C R扩增试剂盒购 自P r o me g a 公司。其他生化和 分子生物学试剂均为国产分析纯。 1 1 5 引物 根 据 G e n Ba n k中登 录 的其 他 植 物 C u Z n S O D基 因同源核苷酸保 守序列设计引物 ， 委托上 海 生工生物工程技术服务有 限公司合成 。简并引物： 5 端引物 P 1 ： 5 - AA T G G T G AA R GC NG T Y GY N GT S C T C 一 3 ； 3 端 弓 J 物 P 2 ： 5 一 C T T A R C C Y T GR A GB C C R A Y R A Y HC 一 3 。特异性引物： 5 端引物P 3 ： 5 一 A T GG T GAA A G C T G T C G T T G 3 ： 3 端引物P 4 ： 5 - T T AAC C T T G AA GT CCAATG一 3 。 1 2 试验 方法 1 2 1总R N A的提取 剪取杨梅树的幼嫩小叶片， 用液 氮 速 冻 后 ， 采 用 改 良的 C T AB L i C I 提 取 总 R N At ， 于 7 0 保存 。 1 2 2 e D NA 第 一 链 的合 成按 照 P r o me g a公 司 的 e D NA合成试剂盒说明书合成。 1 2 - 3 R T - P C R 以合成的c DN A第一链为模板， 在5 0 u L 的 P C R反应 体系 中依 次加 入 5 L 1 0 B u ff e r ， 4 I t L d NTP， 1 5 L 5 0 mM Mg C1 2 ， 1 0 0 p p m P1 和 1 0 0 p p m P 2 各 2 L， 0 5 g L T a q D NA聚合酶 ， 2 L模板 e D NA， 其 余d d H O补齐 。P C R反应条件为： 预变性 9 4 C ， 5 mi n ； 变性9 4 ， 1 mi n ； 退火5 6 o C ， 1 mi n ； 延伸 7 2 c 【 = ， 1 mi n ， 进 行 3 5 个循环； 7 2 延伸 ， 1 0mi n 。 1 2 4 P C R产物 的回收 P C R产物经 1 2 琼脂糖凝胶 电泳检测后， 切下预期大小的 目的条带 。按Q I A GE N 公司的凝胶回收纯化试剂盒说明书回收纯化DN A。 1 2 5 目的片段的克隆和重组质粒的筛选 将预期大小 的P C R产物凝胶回收后连接到p C R 2 1 v e c t o r 中。 把连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 D H5 a ， 菌落在 选择培养基( 含有 Amp 、 I P T G和 X G a D上培养后 ， 进 行蓝 白斑筛选， 挑选白色单克隆菌落培养， 用碱提法提 取质粒 ， 并通过酶切鉴定筛选重组质粒 。 1 2 6序列测定 挑选经酶切鉴定的重组质粒送上海生 工生物工程技术服务有限公司进行基因序列测定。 1 2 7 序 列分 析 用 DN A S t r i d e r 1 2对 基 因 的 c DN A序列 、 开放阅读框 ( OI ) 、 氨基酸编码序列 、 蛋 王 芳等 ： 杨 梅 C u Z n 超氧化 物歧化 酶基 因( Mr S O D1 ) c DNA的克隆及表 达分析 2 9 白质疏水 图进行分析。序列相似性及进化地位分析用 c l u s t a l X 1 8 3 进行 多序列比对 ， 用 ME GA 4 0 建立表示 亲缘关系的系统进化树 。蛋白修饰位点的预测采则用 P r o s i t e 程序。 1 2 8不同组织的表达分析 Mr S O D1 的mR NA在不同 组织部位的表达运用半定量R T - P C R。半定量R T - P C R 以杨梅 看家基 因 Mr Ac t i n l 作为对 照 ， 其上游 引物 为 5 t AG C AG GA AC T C G AG Ac T G 一 3 ，下 游引 物为 5 一 T T A G AA GC A T T T C C T GG T G GC AC 一 3 。 用 Ge n p r o 软件对Mr S O D1 基因在不同组织 中的相对表达量进行 分析 。 2 结 果与分 析 2 1叶 片 总 R NA的提 取 和检 测 采用 C T A B L i C 1 法提取 的杨梅 总R NA， 经 1 琼 脂糖凝胶 电泳检测结果显示： 有 2 8 S R NA和 1 8 S R NA 2 条清晰 R NA泳带 ( 图 1 ) ， 表 明 R NA的完整性较好 。 用紫外分光光度计分别在 2 6 0 n l n和 2 8 0 n lT l 测定其吸 2 8 SRN I 8SRN 泳 道 1 ： 杨 梅 叶 总 R NA 图 1杨梅 叶总RN A电泳 图谱 光度 ， 检 出A ： 0 A 。 。 2 0 ， 说 明R NA的纯度较高， 无蛋 白、 多糖和酚类污染， 可用于逆转录反应。 2 2 0D 1 的 c D NA克 隆 以杨梅叶c D NA为模板进行 R T - P C R， 扩增产物 电 泳检测 ， 在分子量相当于 4 6 0 b p 左右位置存在一清 晰 的泳 带( 图2 A) 。该泳带的大小与 己知植物 S O D的大 小相近， 推断其为杨梅 S O D的序列。P C R产物凝胶 回 50 0b p 25 0b p 收后克隆到p C R ( ) 2 1 载体 中， 质粒经载体上多克隆位 点 E c o R I 单 酶 切 鉴 定 ， 电泳 结 果 显 示 有 3 条 泳 带 ( 图 2 B) ， 分别长 3 9 0 0 b p 、 3 l 0 b p 和 1 5 0 b p左右 ， 3 条带大 小总和与质粒 预期大小接近 ， 预示可能在基因编码区 c DN A中存在E c o R I 酶切位点。 利用 M1 3 F o r w a r d引物和 M1 3 R e v e r s e 引物分别 测序后， 将 2 个 c D NA片段用 V e c t o r NT I S u i t e 6 0 进行 拼接 ， 有一个完整的阅读框 ， 表明得到Mr S O D1 基因的 完整编码区c D NA序列。 根据所拼接序列重新设计特异性引物用以扩增所 克 隆基 因全 长编 码 区 c D NA序 列 。R T - P C R和 质 粒 E c o R I 单酶切鉴定的电泳结果如 图3 。挑选阳性克隆 再次测序的结果表 明， 测得的序列与拼接 的序列一致 ( 图3 A) 。该基 因全 4 6 1 b p ， 包 含 1 b p的 5 非编码 区、 4 5 9 b p的OR F ， 编码一个 由 1 5 2 个氨基酸残基组成 的蛋 白质 ( 图4 ) 。在 5 端 3 2 5 b p 处存在 E c o RI 酶切位 点 。其全长编码区 c DN A序列 已登录 Ge n Ba n k ， 登录 号 为 G Q4 0 4 5 1 0 。 2 3序列的同源性分析 将 推 断 的 Mr S O D1 基 因编 码 的氨 基 酸 序 列 在 G e n B a n k 上进行 Bl a s t 检索后 ， 采用 c l u s t a l X 1 8 3 程序 用 于多序 列的相似性分析 。如图 5 所示 ， Mr S OD1 与 普 通 山毛 榉 ( F a g u s s y l v a t i c a ) 、 欧 洲 山 毛 榉 F a g u s s y l v a t i c a( E u r o p e a n b e e c h ) 、 垂枝 桦 ( Be t u l a p e n d u l a ) 、 西 伯 利 亚 白杨 ( P o p u l u s s u a v e o l e n s )、 喜 玛 萎 陵 菜 ( P o t e n t i l l a a t r o s a n g u i n e a ) 、 番 木 瓜 ( C a r i c a p a p a y a ) 、 亚 洲棉( G o s s y p i u m a r b o r e u m) 、 木薯( Ma n i h o t e s c u l e n t a ) 、 车 前 草 ( P l a n t a g o ma j o r )、拟 南 芥 ( Ar a b i d o p s i s t h a l i a n a )、油 菜 ( B r a s s i c a n a p u s )、莲( Ne l u mb o n u c i f e r a ) 、 鬼箭锦鸡 儿( C a r a g a n a i u b a t a ) 、 豌豆( P i s u m s a t i v u m) 等植 物的 S O D同源 性都在 7 7 以上 。利用 C l u s t a l W 聚类分析后， 采用相邻连接法绘制进化树， 如 A： P C R产物凝 胶 电泳 图谱 ； B： 质粒经 E c o R I 酶切 鉴定凝 胶 电泳 图谱； 1 ： P C R产物 ； 2 ： 质粒 经 E c o RI 酶 切产物 ； M ： DL 2 0 0 0DN A分 子 量标准 ； M ： X - Ha n d I I I + q X1 7 4 一 Ha e I I I D NA分子量标准 图2 Mr S OD1 的 e D NA全长编码区克隆的 电泳 图 A： P C R产物 凝胶 电泳 图谱 ； B： 质粒 经 D RI 酶切 鉴定凝胶 电泳 图谱； 1 ： P C R产物 ； 2 5 质 粒经 Ec o RI 酶切产 物； M ： DL 2 0 0 0DNA分 子量标准 ； M ： - Ha n dI I I + p X1 7 4 一 Ha e I I I D NA分 子量标准 图3 Mr S O DI 基 因e DN A特异性克隆的 电泳图谱 3 0 中回农 学通报h t t p ： ww w c a s b o r g c n 1 2 1 6 2 21 122 41 18 2 61 2 42 81 3O 2 101 3 62 121 M V K A A G TCGTTGT GCTCGGC AGC G TGACTCTGTT AAGG GG ACT AT CTTCTTC V V V L G S S D S V K G T 工 F F GC CCAAGAAAC TG ATGGCCCA CAA C GT AA CTGGAAAT ATT A CTGGCCTT AAGCCTGGT A Q E T D G P T T V T G N 工 T G L K p G ATCCAT GGCTTCCATGTC CATGCACTT GGTGACA CTACTAACGGTTGCATGTCAA CTGA 工 H G F H V H A L G D T T N G C M S T G CCCCA_ TTTCAATCCCGCT P H F N P A G K V H GGTGCTCCT GAGGATGAGATTCGACATGCT G A P E D E 工 R 丑 A GGTGAT T AGGAAATATCACTGTTGGTGATGAT GGCACGGCCAAT TTCACAATAAl TAGAT G D L G N 工 TV G D D G T A N F T工 工 D AAGC AGATCCCAC TCTGTGG ACC GAATTCC ATTATTGGA AGGGCTG TTGTTGT CCATGCA K Q 工 P L C G P N S 工 工 G R A V V H A GATCCA GAT GATCTT GCCGGT D P D D L G K G G H E L s L s T 昼 盟 垒 量 422 GGCCGAGTAGCTTGTGGA觚 CATTGG CTTCAAGGTTAAG 141 璺 基 A 旦 工 工 G L Q G 杨梅Mr S O D 1 c D N A序列的G e n B a n k登录号为： G Q 4 0 4 5 1 0 ； 预测的磷酸化何点用星号表示( S e r l 3 ， T h r 8 7 ， T h r 9 7 ) ； 带下划线表示预测的蛋白的 特征信号序列。 图4 Mr S O D1 基 因全长编 码区c D NA序列和推 断的氨基酸系列 图6 所示， 结果显示， Mr S O D1 与莲的 S O D基因属于同 一 进化分支。 2 4蛋白质的疏水性分析和蛋 白位点分析 通过 D N A S t r i d e r 1 2 软件对Mr S O D1 的氨基酸序 列进行疏水性分析， 如图7 。结果表 明， 其亲水氨基酸 和疏水氨基酸含量相近， 具有2 个明显的跨膜区。 杨梅 普通 山毛榉 欧洲 山毛榉 垂枝桦 MSV PTARGV LRSHR 西伯利 亚白杨 一 喜玛萎 陵菜 番 木瓜 亚洲棉 木薯 车前草 拟南芥 油菜 莲 鬼剑锦鸡儿 豌豆 杨梅 普通 山毛榉 欧洲 山毛榉 垂枝桦 西伯利 亚 白杨 喜玛萎陵菜 番木瓜 亚洲棉 木薯 车前草 拟南 芥 油菜 莲 鬼剑锦鸡 儿 豌豆 6 0 2 0 杨梅Mr S O D1 的4 5 ， 4 7 ， 6 2 ， 1 1 9 位的氨基酸残基为 组氨酸， 在 6 2 ， 7 0 ， 7 9 位 的氨基酸残基为组氨酸， 8 2 位 的氨基酸残基为天冬氨酸。此外， 5 6 位和 1 4 5 位 的氨 基酸残基为半胱氨酸。 P r o s i t e程 序 分 析 显 示 ， Mr S O D1序 列 具 有 C u Z n S O D的特征信号序列 G F HV HA 1 G Dt T ( 4 3 5 3 ) 士 4 0 m k vav6 8 0 gv GT6 F 2e Gp TtV3G 6 GL KPG HG 1 0 0 士 FH6HALgDTTNGC 6STGPHFNP gK HGaPeD RHAGDLGN6 vGdDGt F3 I D ： 1 01 ： 116 ： 1 0 1 ： 9 4 ：101 ：1 01 ：101 ： 101 ： 1 01 ： 1 01 ： 1 01 ：101 ：101 ：1 01 ：1 01 3 8 3 6 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 们 们 们 _ _； -_ -_ ；- ；- _ ；_ _ ； 王 芳等 ： 杨 梅 cu z n 超氧 化物歧 化酶基 因 ( 胁 s D D1 ) c DN A的克 隆及表达 分析 3 1 杨梅 普通 山毛榉 欧洲 山毛榉 垂枝桦 西伯利 亚 白杨 喜玛萎 陵菜 番木 瓜 亚洲棉 木 薯 车前 草 拟南芥 油菜 莲 鬼 剑锦鸡儿 豌豆 12 0 1 4 0 l6 0 ： 152 ： 167 ： 王2 9 ： 11 9 ： 152 ： 152 ： 152 ： 152 ： 152 ： 152 ： 152 ： 152 ： 152 ： 152 ： 152 qI PL Gp SI 6GRAVVVH dpDDLG gghe1S tgnaggr acg 1glqg 比对序 列 为杨 梅 ( My r i c a r u b r a ， 登 录 号 ： GQ 4 O 4 5 1 o ) 、 山毛 榉 ( F a g u s s y l v a t i c a ， 登录 号 ： AJ 5 8 6 5 1 9 ) 、 欧 洲 山毛 榉 ( F a g u s s y l v a ti c a ， 登 录 号 ： ： DQ1 2 4 2 2 7 ) 、 垂 枝 桦 ( Be t u l a p e n d u l a ， 登 录 号 ： AJ 2 7 9 6 9 4 )、 西 伯 利 白 杨 ( P o p u l u s s u a v e o l e n s ， 登 录 号 ： DQ 4 8 1 2 3 1 )、 喜 玛 萎 陵 菜 ( P o t e n ti l l a a t r o s a n g u i n e a ， 登 录 号 ： E U5 3 2 6 1 4 )、 番 木 瓜 ( C a t 4 c a p a p a y a ， 登 录 号 ： Y1 3 6 1 0 ) 、 亚 洲 棉 ( G o s s y p i u m a r b o r e u m， 登 录 号 ： F J 2 2 2 5 5 0 ) 、 木 薯 ( Ma n i h o t e s c u l e n ta ， 登录 号： AF 1 7 0 2 9 7 ) 、 车 前草 ( P l a n t a g o ma j o r , 登录号 ： AJ 8 4 4 0 0 3 ) 、 拟 南芥( Ar a b i d o p s i s t h a l i a n a ， 登录 号： NM1 0 0 7 5 7 ) 、 油菜 ( B r a s s i c an a p u s ， 登录 号 ： A Y 9 7 0 8 2 2 ) 、 莲 ( Ne l u mb on u c i f e r a ， 登 录号 ： A Y8 8 1 1 5 5 ) 、 鬼 箭锦 鸡 儿 ( C a r a g a n a加b a t a ， 登 录号 ： E F 5 3 0 0 4 4 ) 、 豌 豆 ( P i s u m s a t i v u m， 登录 号 ： AB1 8 9 1 6 5 ) 。( 一 ) 表示核苷酸缺失： 黑色区域表示相对保守部分 ， 浅色 区域表示变 异部分( 颜 色越深 表示氨基酸同源性越高) 。 图5 蜓 p 【 序 列同源性比对 I - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - r - - - - - - - - - - - - - _一 O O 2 图 6用 MEG A4 0 软件构建 的Mr S ODI 相邻连接法 ( NJ ) 进化树 和 G NAG g R v AC g i I ( 1 3 7 - 1 4 8 ) ； 同时， 存在 3 个 可能的 磷 酸化位 点： 1 个丝氨酸残基 ( S e r l 3 ) 和 2 个 苏氨 酸残 基 ( m 8 7 ， T l 9 7 ) 。其 中， S e r l 3 残基可 能是蛋 白激酶 C磷酸化位点； T h r 8 7 和 T h r 9 7 残基可 能是酪蛋 白激酶 I I 磷酸化位点； 另外 ， 还有潜在 的 3 个 N端糖基化和 6 个 N端酰基化位点 。这表明 ， Mr S O D1 为 C u Z n S O D， 且在蛋 白水平上可能存在复杂 的修饰和调控作用 。 2 5 Mr S O D1 基 因在杨梅不同组织中的表达 为了研究 Mr S O D1 基因在杨梅不同组织部位 中的 表达特 异性， 以杨梅看家基 因Mr Ac t i n 1 为对照基因， 对 Mr S O D1进 行 半 定 量 R T - P C R分 析 ， 结 果 显 示 Mr S O D1 在杨梅不 同组织部位均 有表达 ， 其中以果实 3 2 中囤农 学通报h t t p ： l l ww w e a s b o r g c n 1 1 0 1 1 O0 I l l 。 r f l l l l I I l l l l ll l I 1 O 0 氨基酸个数 图 7 Mr S O D 1 全长基 因推断的氨基酸序列疏水图 Mr s oD1 Mr Ac t i nl A 2 3 4 2 l 0 1 2 中的表达量最高， 而看家基因Mr Ac t i n l 在杨梅不同组 织部 位其 表达 量 无 明显差 异 ( 起 始 R NA含量 均 为 1 g g ) ( 图8 A) 。利用 Ge n p r o 软件对 Mr S O D1 基因在不 同 组 织 中 的 相 对 表 达 量 进 行 分 析 ( 图 8 B) ， 杨 梅 Mr S O D1 叶、 枝条、 果、 花的相对表达量分别为 1 1 4 8 9 、 0 2 3 7 6 、 2 8 7 1 4和 1 0 3 2 1 ， 即果叶花 枝 条 。表 明 Mr S O D1 基因主要在果实中表达， 其次在 叶和花 中表 达， 在枝条中的表达量最少。 3结论与讨论 目前对许 多生物 的S O D及其基 因进行了广泛 的 茛 一 0 0 _ 。 l 一 2 3 4 杨梅不 同组织部位 1 ： 叶； 2 ： 枝条 ； 3 ： 果； 4 ： 花 图 8 Mr S O D I 基 因在杨梅不 同组织部位的半定量 RT P CR分析 研究 ， 如朱虹琳等 川 克 隆了莲 C u Z n 超氧化物歧化酶 c DN A的基因， 黄 明 ” 克隆了甘薯叶片超氧化物歧化 酶基 因。本试验根据植物C u Z n S O D的5 和3 末端设 计简并引物， 首次成功地克 隆了杨梅 中的 S O D基 因 ( 1 ) ， 编码 区全长 e DN A序列 ， 其核苷酸长度 为 4 6 1 b p ， 包 括起 始 密码 子和 终止 密码 子 ， 是 完整 的 c DN A序列， 其中编码区段为4 5 9 b p ， 其开放 阅读框编 码 1 5 2 个氨基酸。运用 B l a s t 软件将该基 因编码的氨 基酸与Ge n B a n k 中注册的S OD进行 同源性 比较， 结果 表 明： Mr S O D1 与 G e n B a n k中注册 的 S O D序列的同源 性均在7 7 以上。C u Z n S O D蛋白质分子上与金属原 子相结合 的位 点十分保 守： C u原子与 4 5 ， 4 7 ， 6 2 ， l 1 9 位的组氨酸相结合； Z n原子与 6 2 ， 7 0 ， 7 9 位 的组氨酸和 8 2 位 的天冬氨酸相结合 。除此之外， 5 6 位和 1 4 5 位的 半胱氨酸组成一个二硫键 ， 在所有报道的 C u Z n S OD 序列中也是非常保守的。Mr S O D1 分子与金属分子 的 7处 结合 位 点 和 二 硫 键 形 成 位 点 同 所 有 报 道 的 C u Z n S O D一 样 ， 仍保 守存 在 。本 研 究 通 过 D NA S t r i d e r 1 2 软件和 P r o s i t e 软件分别对 Mr S O D1 的氨基 酸疏水性分析和蛋 白位点分析 ， 有利于探索 S O D逆境 调控机 理 。 S O D是公认的抗逆酶之一， 但 S OD是如何在基因 水平调控其耐胁迫能力的， 所知甚少。从分子生物学 角度对杨梅中的 S OD进行研究， 对于揭示杨梅 的抗逆 机理具有十分重要 的意义。S O D在逆境胁迫下增 强 表达， 但是 ， 任何酶发挥其表达调控都是多个因素同时 作用 的结果， 植物体内的S O D的表达与植物的生长发 育及所处环境有密切关系 ， 也可能与植物激素的调节 有关 ， 当植物处于逆境胁迫时内源激素和活性氧共同 调节 S O D的表达f l 。杨梅 的超氧化物歧化酶在其 生 长发育的过程中究竟是单独起到抗逆的作用还是与其 他一些未知 因素相互影响共同抵御恶劣的环境， 这些 问题都有待进一步的研究。 参考文献 I 】 Mc C o r d J M，F r i d o v i c h I S u p e mx i d e d i s mu t a s e a n e n z y mi c f u n c t i o n f o r e r y t h r o c u p r e i n( h e mo c u p r e in ) 【 J J B i o 1 C h o re, 1 9 6 9 ， 2 4 4 ( 2 2 ) ： 6 0 4 9 6 0 5 5 2 Ma X J ，Z h u D HF u n c ti o n a l r o l e s o f t h e p l a n t s u p e r o x i d d i s mu t a s e J He r e d i t a s ， 2 0 0 3 ， 2 5 ( 2 ) ：2 2 5 2 3 1 3 K i m E J ，Ki m H P ， Ha h Y C ，e t a 1 D i ff o e n t i a l e x p r e s s i o n o f s u p e r o xi d e d i s mu t a s e s c o n t a i n i n g Ni a n d Fe Zn i n St r e p t o my c e s c o e l i c o t o r J E u r J Bi o c h e m ， 1 9 9 6 ， ( 2 4 1 ) ： 1 7 8 1 8 5 4 5 3 5 2 5 1 5 0 王 芳等： 杨梅 C u Z n 超氧化物歧化酶基因( Mr S O D1 ) c DNA的克隆及表达分析 3 3 4 5 】 6 T s a n g E W Bo wl e r C，He r o u a r t D，e t a 1 Di ffe r e n tia l r e g ul a t i o n o f s u p e r o x i d e d i s mu t a s e s i n p l a n t s e x p o s e d t o e n v ir o n me n t a l s t r e s s J P l a n t C e l l ， 1 9 9 1 ， 3 ( 8 ) ： 7 8 3 7 9 2 Pe r l T I 己 Ga l u n E Th e t o ma t o Cu， Zn s u p e r o x i de d i s mu ta