高二生物 1.2基因工程的基本操作程序课件.ppt

基因工程的基本操作程序,基因操作的基本步骤,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因操作的基本步骤,一、目的基因的获取,目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,1.从基因文库中获取目的基因,1)基因文库的概念:,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。,2)基因文库的种类:,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,基因组文库与部分基因文库的关系,3)基因组DNA文库与cDNA文库,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,与运载体连接导入,基因组文库,cDNA,受体菌群体,与运载体连接导入,cDNA文库,某种生物某个时期的mRNA,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性,4)从基因文库中得到目的基因的方法,1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNAB、线粒体DNAC、总mRNAD、tRNA,2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,2、利用PCR技术扩增目的基因,PCR聚合酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。,以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,指数,2n,方式,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,结果,原理：,DNA双链复制,PCR技术,前提：条件,PCR扩增仪,一段已知目的基因的核苷酸序列,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,PCR技术的操作过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、边解旋边复制,半保留复制、全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等,反转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,推测,推测,单链DNA,合成,3.人工合成化学合成法,基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成,变式迁移,1(多选)下图表示限制酶切割某DNA的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切点是()ACTTAAGBGAATTCC切点在G和A之间D切点在C和T之间,P4,2、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是双链DNA分子为模板ATGTG或TACAC模板链四种脱氧核苷酸四种核苷酸DNA聚合酶热稳定DNA聚合酶引物温度变化恒温ABCD,D,3、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个B.8100个C.17280个D.7560个,B,1000个脱氧核苷酸对，即2000个核苷酸。由于A=T=460个，所以，C=G=540个。所以，一个目的基因有胞嘧啶脱氧核苷酸540个。扩增4代可产生16个DNA分子，根据DNA半保留复制原则，其中有一个DNA分子“相当”于亲代的DNA。所以，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸数为（16-1）*540=8100个。,4、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、cDNA文库法D、聚合酶链反应,5、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因反转录法通过DNA合成仪利用化学方法人工合成ABCD,A,D,二、基因表达载体的构建基因工程的核心,1、目的：所需物质：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么?,2、基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们各自的作用是什么?,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,启动(终止)转录,启动(终止)翻译,作用,位于DNA上,位于mRNA上,位置,DNA片段,三个相邻碱基,本质,启动(终止)子,启始(终止)密码子,三.将目的基因导入受体细胞,1.转化：,2.方法：,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,优点,经济和有效,（2）基因枪法（3）花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：,用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子,四、目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,1、鉴定分子水平的鉴定,转基因生物的DNA,探针,15N,15N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,基因探针：,指用荧光或放射性同位素标记的DNA分子,方法,DNA分子杂交技术,变性,变性,1、鉴定分子水平的鉴定,变性,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物的mRNA,1、鉴定分子水平的鉴定,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,思考？,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,2、鉴定个体水平的鉴定,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,变式迁移,4下列技术中不是依据DNA分子杂交原理的是()A检测目的基因是否导入了受体细胞B检测目的基因是否转录了mRNAC检测目的基因是否翻译合成蛋白质D快速灵敏地检测饮用水中病毒的含量,C,点评：(1)涉及目的基因的检测与鉴定习题时，应注意审题，辨清是要求从“分子水平”还是从“个体水平”。(2)DNA探针及其应用DNA探针是指用荧光或放射性同位素标记的DNA分子，其应用依据的原理是DNA分子杂交。应用：DNA探针可用来检测DNA或RNA分子，因此其应用广泛，如a从基因文库中准确提取目的基因。b检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因和检测目的基因是否转录出了mRNA。c鉴定物种亲缘关系。d疾病的诊断和治疗。e环境监测。,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：,变式迁移,3采用基因工程方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是()将毒素蛋白质注射到棉花受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列注射到受精卵中将编码毒素蛋白质的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞再进行组织培养将编码毒素蛋白质DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵ABCD,P10,C,点评：(1)农杆菌转化法中有二次拼接和二次导入。第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒上T-DNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA进入受体细胞。(2)因为动物体细胞的全能性受到一定限制，故一般将目的基因导入动物的受精卵或卵细胞，而不是体细胞；而植物体细胞的全能性相对容易表达，故一般将目的基因导入植物的体细胞，然后再通过植物组织培养技术获得转基因植株。,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处，DNA连接酶作用于处。（填“a”或“b”）,a,a,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术，该技术的核心是和。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交检测，又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪法（花粉管通道法）,植物组织培养,脱分化（去分化）,再分化,耐盐基因（目的基因）,一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）,基因组文库的构建,（2）基因文库的构建方法,通过对受体菌的培养而储存基因,cDNA文库的构建-反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA(目的基因),1)基因组文库,是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体细菌的群体中储存，这个群体就称为该生物的基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,1.基因文库,1、原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录,RNA聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质.,不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的基因结构,有调控遗传信息表达的核苷酸序列.包括启动子和终止子,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启