第二章 培养基ppt课件.ppt

,第一部分：细胞培养用液及培养基,培养用液水平衡盐溶液消化液培养基天然培养基合成培养基,细胞培养基本技术,1,第二部分内容：,原代细胞分离、培养（酶消化法和组织块培养法）。细胞生长状况的观察。培养细胞一代生长过程。传代。冻存与复苏。细胞培养注意事项（如细胞污染）。细胞培养的一些专业术语介绍（如细胞株、系，上皮细胞型、成纤维细胞型）,2,第一部分：动物细胞用液的制备,3,细胞培养用液及培养基,培养用液水平衡盐溶液消化液培养基天然培养基合成培养基,细胞培养基本技术,4,配液前准备：,滤器、滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、注射器。贮液瓶（生理盐水瓶）、瓶塞、15磅，121，20分钟蒸气灭菌NaHCO3、NaOH、HCl、胎牛（小牛）血清、青霉素、链霉素、三蒸水、培养基粉剂,5,配液过滤无菌操作要求：,操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口。在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行,6,一、细胞培养用液及培养液水,（一）水营养物、代谢物溶于水中调节渗透压、平衡pH值普通自来水含大量杂质，不利于细胞生长高度纯化水离子交换水：蒸馏水：三蒸、新鲜超纯净水：,7,离子交换水：,离子交换水中仍有一些非离子物质及有机物，一般在细胞培养中较少使用。,8,双蒸水、三蒸水：,细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水,9,超纯净水：,采用进口的RO膜、离子交换膜、离子交换树脂、抛光核子级树脂、静音高压泵、电磁阀等，产品性能得到最大化的保证；分子生物学、生命科学、基因研究、组织培养、试管婴儿、生物工程、动物细胞培养、培养基制备、DNA测序、氨基酸分析、疾控中心、水质检测中心、药检所、质检所、高校科研等标准实验室及各种高端精密仪器用水。,10,（二）、平衡盐液体（Balancedsaltsolution,BSS）：,组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分如：PBS、Hanks用途：用于洗涤组织、细胞或配制消化液时等,11,平衡盐液体：,组成无机盐、葡萄糖种类：氯化钠浓度、离子浓度、缓冲系统不同EarleNaHCO3含量高、缓冲能力高，5%CO2平衡HanksNaHCO3含量低、缓冲能力低，空气平衡D-Hanks不含钙、镁离子Dulbecco含少量钙、镁离子PBS磷酸缓冲系统,12,PBS（Phosphate-BufferedSallines）,DPBS（DulbeccosPhosphate-BufferedSallines）标准型,13,D-Hanks平衡盐溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS),14,（三）、消化液分散组织、细胞,作用：（1）在进行原代培养过程中需分散组织、细胞。（2）在传代中要使细胞脱离附着的底物时均需使用消化液。类型：组织细胞培养中常用的消化液为胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二钠（EDTA）及胶原酶溶液，可以分别单独使用或混合使用。,15,使细胞间的蛋白质水解、细胞分散培养细胞传代。分离组织、细胞团消化所需时间和浓度与细胞特性相关特点：1、胰蛋白酶的活力用解离酪蛋白的能力来表示，常用的有1：125和1：250两种。2、许多学者认为钙、镁离子和血清的存在都会降低胰蛋白酶的活力。消化细胞时，加入一些血清（10%）或含血清的培养液，能终止消化作用。,胰蛋白酶液(Trypsin),16,称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks平衡盐（或PBS）溶液调成糊状，再补足D-Hanks平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡次日，过滤除菌，分装入瓶中，-20保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25%（0.1%-0.5%）。如果短期内要使用，就放置4冰箱。,胰蛋白酶溶液配制：,17,EDTA4Na溶液：,一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长（E-cadherin)EDTA溶液配制：用D-Hanks平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4冰箱保存,18,联合使用：胰蛋白酶和EDTA联合使用可提高消化效率(细胞与细胞之间的粘附分子需要Ca2+:cadherin,selectin,integrin).但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。,19,联合使用：常用的配制方法（0.25%trypsin-0.04%EDTA溶液）：胰蛋白酶0.25g，EDTA0.04g，PBS(-)液100mL，烧杯内磁力搅拌充分溶解，0.22m滤膜正压过滤，-20冰箱保存。,20,消化细胞间质，分离上皮细胞与胶原成分。根据细胞类型选用不同型号胶原酶（-）。新鲜配制、37-38oC作用、时间控制。EDTA不可与胶原酶联用，因胶原酶的消化作用依赖于钙。附：细胞外基质成分有胶原、纤粘蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）、弹性蛋白等）,胶原酶液：,21,（四）、pH调整液：,NaHCO3溶液常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4保存,22,（五）、HEPES溶液：,一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES使用终浓度一般为10-50mmol/L（分子量238.31）溶液常配成1M储存液：用20ml双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4保存。使用时可向100ml培养液中加入2mlHEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L,23,（六）、谷氨酰胺补充液：,谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加.配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内,24,使用终浓度为1-4mmol/L一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mmol/L（29.22g/L），配制方法为：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mmol/L,25,（七）、酚红：,大多数培养液中使用酚红作为pH指示红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH,26,七、酚红：,在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用.,27,（八）、抗生素溶液：,抗生素使用种类与浓度：工作浓度储存温度杀灭细菌penicillin100u/ml-20G(+)streptomycin100ug/ml-20G(+)、G(-)gentamicin50ug/ml-20G(+)、G(-)、支原体amphotericinB2.5ug/ml-20真菌(二性霉素B）nystatin50ug/ml-20真菌（制霉菌素）,28,抗生素溶液通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位,29,抗菌素液（青、链霉素：）：,青、链霉素：最终浓度为青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。一般市售市售链霉素为100万U/瓶，将其溶解在10mlHanks液或三蒸水中，取8ml链霉素液溶解80万U/瓶青霉素，即成为青霉素、链霉素各1.0105U/ml的母液.使用时每100ml培养液中加0.1ml，即成最终浓度为100U/ml。,30,三、培养基,培养基维持体外细胞生存和生长的溶液天然培养基取自动物营养成分丰富；来源受限血清：小牛、胎牛、马、人（市售）须灭活补体（56oC、30min）、-20oC保存质量差异大（无细菌、支原体、病毒）血浆鸡血浆；现少单独使用合成培养基：,31,合成培养基：,合成培养基一般需加血清等成分氨基酸、维生素、糖类、无机离子、辅助成分,32,市场上可提供干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便,33,种类根据细胞特性选择（文献）199成分复杂，不常用；改良为109效果较199好Eagle系列MEM（Eagle最低必需培养液）BMEM（氨基酸改良）DMEM（增加成分）：高糖、低糖RPMI1640常用、悬浮细胞、多种细胞HamF12：加微量元素等，可少用血清单细胞、克隆化培养，无血清培养,34,细胞培养基应用选择：,选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：(1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。(3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选RPMI1640。,35,RPMI1640种类,RPMI1640（A）（不含谷氨酰胺、可高压灭菌）RPMI1640（A）无酚红（不含谷氨酰胺、高压灭菌）RPMI1640（含谷氨酰胺、除菌过滤灭菌）,36,DMEM细胞培养基,是在MEM培养基的基础上研制的与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】。,37,干粉培养基的配制,认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。所用器皿应严格消毒。配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。,38,合成培养基的配制：,滤器、滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒（容量瓶）、贮液瓶（生理盐水瓶）、瓶塞、注射器。NaHCO3、NaOH、HCl、胎牛（小牛）血清、青霉素、链霉素、三蒸水、培养粉,39,步骤：,配制培养基需新制备的三蒸水，一般在配制当天或前一天制备为最好，这样可以保证水的纯度和质量。调节培养液pH值的HCl和NaOH溶液也需用这种水配制。配制培养基的各种器皿都应做到绝对干净，烤干后使用（专用）。将干粉型培养基溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。培养液中加入磁性搅棒，把盛培养液的器皿放在磁力搅拌器上搅拌，补加水到最终量。培养液配制过程中一般不需加热助溶。,40,根据包装袋上的要求和实验需要补加NaHCO3和谷氨酰胺。加抗生素：上述溶液配制好后，用过滤法消毒除菌，采用0.22m和0.45m滤膜各1张。分装于玻璃瓶中，使用时再加血清。,41,取样培养2日以检测污染（防止污染的处理：检查过滤装置3次。每次操作烧瓶口）使用加入牛血清、抗菌素,42,合成培养基一般在培养细胞时均需要加入血清。,43,一、牛血清在细胞培养中的主要功能：,提供激素、基础培养基中少有的营养成份、低分子营养物。提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，调变结合物质活力。与有毒金属和热原质结合，起解毒作用。是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子的来源。起酸碱度缓冲液作用。提供蛋白酶抑制剂，使胰酶失活，保护细胞。,44,二、牛血清的主要成份,蛋白质：携带金属离子、脂肪酸和自身激素类蛋白、白蛋白、球蛋白纤维粘连素、2巨球蛋白、胎球蛋白（胎牛血清）。多肽：血小板促生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等。激素：胰岛素和、类胰岛素生长因子、促生长激素、氢化可的松。其他成份：氨基酸、葡萄糖、酮酸、结合状态的微量元素等。,45,三、牛血清的利与弊：,血清虽是常用的天然培养基，对绝大多数细胞的生长有利，但其成分复杂，有些尚未明确，其中某些成份可能对有些细胞有害。故做一些细胞因子对细胞的影响时，常常不加血清。（0.1%,或0.05%),46,四、灭活与分装过程：,1、一般外购的血清只作过灭菌，在用前常需进行灭活处理。2、热灭活：56,30分钟加热已完全解冻的血清（加温到56，30min），以消除补体活性，未灭活血清应保存在20冰箱。,47,3、血清中的沉淀物,絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。在显微镜下表现为“小黑点”。可用离心3000rpm,5分钟去除，也可不用处理一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长。但如果怀疑血清