（中西医结合临床专业论文）转染hsg基因干预copd气道成纤维细胞增殖的研究.pdf

i fl口lim* 贵阳中医学院硕士学位论文相关声防i 殇h 。i 。i i i i 1 i i 2 1 4 i i i 原创性声明 本文声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表论文中撰写过的研究成果，也不包含为获得贵阳中医学院 或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作 的贡献均已在论文中作了明确说明。 作者： 套辛 日期： 2 0 1 0年0 3 月2 0 日 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部 分内容，可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文；学校可根据国家或贵 州省有关部门规定送交学位论文。 作者签名套寺导师签 日期幽f o 年岁月知日 p ， ， 。o-_ l l i 目录 中文摘要1 英文摘要3 前言“”“”6 第一部分：r h s g 基因在c o p d 模型大鼠气道成纤维细胞中的表达研究 1 材料与仪器_ 8 2 试验方法1 0 2 1 制造c o p d 大鼠模型1 0 2 2 组织标本采集及原代培养1 0 2 3 时差贴壁法纯化成纤维细胞1 1 2 4 成纤维细胞的鉴定：”1 1 2 5 免疫组化检测大鼠气道成纤维细胞中的r h s g 表达1 1 3 结果一一”1 1 3 i c o p d 大鼠造模结果1 l 3 2 c o p d 大鼠和正常大鼠气道成纤维细胞原代培养及纯化结果1 3 3 3 成纤维细胞鉴定结果”：1 3 3 4 免疫组化检测两组细胞中r h s g 蛋白表达：“1 3 第二部分：p e g f p - h h s g 体外转染对c o p d 气道成纤维细胞生长影响 一、质粒p e g f p - n 1 、p e g f p - h h s g 的转化、扩增、鉴定、抽提 l 材料与仪器1 5 2 实验方法1 7 2 1 用氯化钙法制备感受细胞_ j 1 7 2 2 质粒转化1 8 2 3 质粒扩增 o oo ob oooo o 1 8 2 4 质粒抽提1 8 2 5 质粒d n a 的浓度测定1 9 2 6 质粒鉴定2 0 3 结果b i ou oo lo 2 0 3 i p e g f p h h s g 、p e g f p n l 转染级质粒纯度和浓度测定2 0 3 2 p e g f p - h h s g 的酶切鉴定结果2 0 3 3 目的d n a 测序结果2 l 二、p e g f p - h h s g 体外转染对c o p d 气道成纤维细胞生长影响 l 材料与仪器2 3 2 实验方法2 4 2 1 脂质体介导的基因转染2 4 2 2 免疫组化检测转然后细胞与空白对照组中h h s g 表达2 4 3 观察指标2 5 3 1 荧光显微镜观察转染情况2 5 3 2 细胞计数2 5 3 3 m t t 实验及细胞生长曲线的测定：“2 5 4 结果”“”一“2 5 4 1 荧光显微镜观察转染情况2 5 4 2 免疫组化检测结果2 6 4 3 细胞计数结果2 6 4 4 m t t 实验及细胞生长曲线描绘2 7 讨论 “2 9 全文总结与展望3 1 参考文献3 4 附录一缩略语表3 6 附录二综述3 7 附录三致谢4 1 附录四个人简介4 2 贵阳中医学院硕士学位论文 中文摘要 目的： 免疫组化法检测大鼠细胞增殖抑制基因( r a th y p e r p l a s i as u p p r e s s o rg e n e ， r h s g ) 蛋白在正常及慢性阻塞性肺疾病( c h r o n i co b s t r u c t i v ep u l m o n a r y d i s e a s e ，c o p d ) 大鼠气道成纤维细胞细胞中的不同表达；通过体外转染( h o m o h y p e r p l a s i as u p p r e s s o rg e n e ，h h s g ) 基因至c o p d 气道成纤维细胞中，观察 p e g f p - h h s g 对成纤维细胞增殖的影响，为进一步基因治疗打下理论基础。 方法： 通过制造c o p d 大鼠模型，组织块法培养气道成纤维细胞，用免疫组化检测r h s g 基因在正常大鼠和c o p d 大鼠气道成纤维细胞中的表达；感受态细胞转化质粒 p e g f 卜n 1 、p e g f p h h s g ，碱裂解法抽提质粒，经电泳及d n a 测序鉴定，然后通过 脂质体法将p e g f p - h h s g 质粒转染c o p d 患者气道成纤维细胞，荧光显微镜观察转染 情况，转染后用免疫组化检测空白对照组( c o p d 未转染组) 、转染p e g f p - n l 组、 转染p e g f p h h s g 组中h h s g 蛋白的表达，m t t 、细胞计数法观察转染后细胞生长状 况。应用s p s s i i 0 软件对数据进行统计学分析，实验数据以i s 表示。均数比 较采用单因素方差分析，组间q 检验，p o 0 5 为差别有显著性统计学意义。 结果： c o p d 造模成功后，经过细胞培养，免疫组化学结果显示r h s g 蛋白在c o p d 大鼠 组和正常大鼠组中皆有表达，其灰度值分另 j 1 1 3 7 9 6 _ 4 - 1 3 1 7 3 、1 8 4 3 2 7 _ _ _ 3 2 3 8 ，r h s g 基因在c o p d 大鼠气道成纤维细胞中表达明显低于正常大鼠气道成纤维细胞中的 表达，两者之间的差异具有统计学意义( p o 0 5 ) 。原代培养正常人和c o p d 患者 气道成纤维细胞，抗波形蛋白鉴定实验所得细胞为成纤维细胞，时差法纯化得到 纯气道成纤维细胞；氯化钙法制备得到高转化率的感受态细胞( d h 5 a ) ， p e g f p n l 、p e g f p h h s g 质粒转化、扩增，e c o i 和s n a b l 酶双酶切电泳鉴定得到片 段长度约为2 2 7 4 b p 的基因片段，测序结果证实质粒中含有h h s g 基因编码区，其片 段长为2 2 7 4 b p 。 经g e n e b a n kb l a s t 分析证实d n a 插入序列与目的片段d n a 序列完 全完全一致。将p e g f p - n l 、p e g f p - h h s g 质粒转染至c o p d 气道成纤维细胞中，在银 光显微镜可见转染组( p e g f p - n l 、p e g f p - h h s g ) 细胞中皆有绿色荧光蛋白基因 ( g f p ) 的表达，其主要位于细胞核周围。通过免疫组化方法检测得h h s g 在空白 贵阳中医学院硕士学位论文 组对照、p e g f p n l 、在p e g f p h h s g 三组细胞的细胞核及核周均呈现不同程度的阳 性反应，其中空白对照组( 未转染组) 和转染p e g f p - n l 组阳性反应较弱，而转染 p e g f p h h s g 组细胞阳性反应较强，空白对照组、转染p e g f p _ n 1 组与转染 p e g f p h h s g 组所测灰度值比值具有统计学意义( p o 0 5 ) ，说明h h s g 在这些细胞中 均有不同程度的表达。细胞计数、m t t 并描绘细胞生长曲线，结果示转染 p e g f p h h s g 组细胞增殖受到明显抑制，而空白对照组和转染p e g f p n 1 组细胞增殖 无明显改变。转染p e g f p - h h s g 组在第l 、2 、3 、4 、5 天对c o p d 气道成纤维细胞增 殖的抑制率分别为2 4 6 ，2 8 7 ，4 3 6 ，5 2 3 和6 2 ，且抑制 率与时间呈正相关。转染p e g f p - h h s g 组与空白对照组、转染p e g f p - n 1 组之间有明 显差异( p o 0 5 ) 。 结论： r h s g 基因在c o p d 大鼠气道成纤维细胞中表达明显低于正常大鼠气道成纤维 细胞中的表达。体外转染h h s g 至c o p d 患者气道成纤维细胞后，h h s g 在细胞核 周边稳定表达，细胞增殖受到明显抑制。 关键词：h s g ；e o p d ；成纤维细胞：转染：气道重塑 贵阳中医学院硕士学位论文 o b j e c t i v e ： a b s t r a c t i m m u n o h i s t o c h e m i c a ld e t e c t i o nr h s g ( r a th s g ) p r o t e i ni nn o r m a la n dc o p d a i r w a yf i b r o b l a s t c e l l sw i t hd i f f e r e n te x p r e s s i o n ；b yi nv i t r o t r a n s f e c t i o nh h s g ( h u m a nh s g ) g e n et ot h ec o p da i r w a yf i b r o b l a s t s ， o b s e r v e dp e g f p h h s go nf i b r o b l a s tp r o l i f e r a t i o n ，i no r d e rt ol a yt h e t h e o r e tic a lb a sisf o rf u r t h e rg e n et h e r a p y m e t h o d ： c o p dr a tm o d e l b yc r e a t i n g ，o r g a n i z i n g b l o c kc u l t u r ea i r w a y f i b r o b l a s t s ，u s i n gi m m u n o h i s t o c h e m i s t r yr h s gg e n ei nn o r m a lr a t sa n d c o p d a i r w a yf i b r o b l a s tc e l l s ：c o m p e t e n tc e l l st r a n s f o r m e di n t op l a s m i d p e g f p - n l ，p e g f p h h s g ，a l k a l i n ee x t r a c t i o np l a s m i db yg e le l e c t r o p h o r e s i s a n d d n as e q u e n c i n g ，a n dt h e nli p o s o m et r a n s f e c t e dp e g f p h h s gc o p d p a t i e n t sw i t ha i r w a yf i b r o b l a s t s ，t r a n s f e c t i o nb y f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p ya f t e rt r a n s f e c t i o nw i t hi m u n o h i s t o c h e m i s t r yd e t e c t i o no ft h e c o n t r o lg r o u p ( c o p du n t r a n s f e c t e dg r o u p ) ，t u r nn a t u r a lp e g f p n lg r o u p ， t u r nn a t u r a lp e g f p h h s gg r o u ph h s gp r o t e i n ，m t t ，c e l lc o u n t i n go f t r a n s f e c t e dc e l l si ng r o w t hs t a t u s a p p l i c a t i o ns p s s i i 0s o f t w a r ef o r 趸 ss a i d s t a t i s t i c a la n a l y s i s ，e x p e r i m e n t a ld a t at h ec o m p a r a t i v e a n a l y s i so fv a r i a n c ew i t ho n eb e t w e e ng r o u p sqt e s t ，p 0 0 5f o rt h e d i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n ts t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t r e s u l t s ： c o p da f t e rt h em o d e li n g ，a f t e rc e l l c u l t u r e ，i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e ss h o w e dr h s gp r o t e i ni nc o p dg r o u pa n dn o r m a lr a t sr a t sw i t h i ne a c h ， e x p r e s s i o n ，t h eg r a yv a l u eo f11 3 7 9 6 1 3 1 7 3 ，1 8 4 3 2 7 3 2 3 8 ，r h s g g e n ei nal a r g ec o p dr a ta i r w a yf i b r o b l a s t se x p r e s s e ds i g n i f i c a n t l yl o w e r a i r w a yf i b r o b l a s tc e l l s ，t h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w ow a ss t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t ( p o 0 5 ) p r i m a r yc u l t u r eo fn o r m a ls u b j e c t sa n dp a t i e n t s w i t hc o p da i r w a yf i b r o b l a s t s ，a n t i v i m e n t i ni d e n t i f i e dt h ee x p e r i m e n t a l 一3 贵阳中医学院硕士学位论文 f i b r o b l a s tc e l l s ，p u r i f i e db yt i m ed i f f e r e n c eo fp u r ea i r w a yf i b r o b l a s t ： c a l c i u mc h l o r i d ep r e p a r e db yt h eh i g hc o n v e r s i o nr a t eo fc o m p e t e n tc e l l s ( d h 5 a ) ，p e g f p - n l ，p e g f p - h h s gp l a s m i dt r a n s f o r m a t i o n ，a m p l i f i c a t i o n , e c o ia n ds n a b ir e s t r i c t i o ne n z y m e d i g e s t i o ne n z y m ee l e c t r o p h o r e s i s i d e n t i f i c a t i o nb yf r a g m e n tl e n g t ha b o u t2 2 7 4 b pg e n ef r a g m e n ts e q u e n c i n g c o n f i r m e dt h a tt h ep l a s m i dc o n t a i n i n gt h eg e n ec o d i n gr e g i o nh h s g ，t h e f r a g m e n tl e n g t hi s2 2 7 4 b p t h eg e n e b a n kb l a s ta n a l y s i sc o n f i r m e dt h a t f r a g m e n to fd n ai n s e r t i o ns e q u e n c e sa n d c o m p l e t e l yi d e n t i c a ld n a s e q u e n c e s t h ep e g f p - n l ，p e g f p h h s gp l a s m i di n t oc o p da i r w a yf i b r o b l a s t s ， c a nb es e e ni nt h es il v e rm i c r o s c o p et r a n s f e c t e d ( p e g f p - n l ，p e g f p - h h s g ) c e l l sh a v et h es o u n do fg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) e x p r e s s i o nt h e m a i ni sl o c a t e da r o u n dt h en u c l e u s d e t e c t e db yi m u n o h i s t o c h e m i s t r yi n t h ec o n t r o lg r o u pw e r eh h s gc o n t r o l ，p e g f p n l ，i nt h ep e g f p - h h s gt h r e e g r o u p so fc e l l si nt h en u c l e u sa n dt h en u c l e u ss h o w e dap o s i t i v er e a c t i o n t ov a r y i n gd e g r e e s ，i nw h i c ht h ec o n t r o lg r o u p ( n o n t r a n s f e c t i o ng r o u p ) a n dt r a n s f e c t e d p e g f p n lg r o u po f w e a k p o s i t i v er e a c t i o n ，w h i l e t r a n s f e c t i o no fp e g f p - h h s gs t r o n gp o s i t i v er e a c t i o nc e l l s ，t h ec o n t r o l g r o u pt r a n s f e c t e dw i t hp e g f p n lg r o u pa n dt h eg r o u pt r a n s f e c t e dw it h p e g f p - h h s gg r a yv a l u em e a s u r e db yt h er a t i ow a ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ( p 0 0 5 ) ，s h o w sh h s gi nt h e s ec e l l sh a v ed i f f e r e n tl e v e l so fe x p r e s s i o n c e l lc o u n t i n g ，m t ta n dd e s c r i b ec e l lg r o w t hc u r v e ，t h er e s u l t ss h o w t r a n s f e c t e dp e g f p - h h s gc e l l p r o l i f e r a t i o nw a si n h i b i t e d 。w h i l et h e c o n t r o lg r o u pt r a n s f e c t e dw i t h p e g f p n lc e l lp r o l i f e r a t i o nw a sn o t c h a n g e d t r a n s f e c t e dw i t hp e g f p h h s gg r o u pi n1 ，2 ，3 ，4 ，5d a y so ft h ec o p d a i r w a yf i b r o b l a s tp r o l i f e r a t i o ni n h i b i t i o nr a t e sw e r e2 4 6 ，2 8 7 ，4 3 6 ， 5 2 3 a n d6 2 ，a n dt h ei n h i b i t i o nr a t ew a s p o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ht h e t i m e t r a n s f e c t e dw i t hp e g f p h h s gg r o u pa n dt h ec o n t r o lg r o u pt r a n s f e c t e d p e g f p n lsig n if ic a n td if f e r e n c eb e t w e e ng r o u p s ( p 4 贵阳中医学院硕士学位论文 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ： r h s gg e n ei nc o p da i r w a yf i b r o b l a s t se x p r e s s e ds i g n i f i c a n t l yl o w e r a i r w a yf i b r o b l a s tc e l l s i nv i t r ot r a n s f e c t i o nh h s gt oc o p dp a t i e n t sw i t h a i r w a yf i b r o b l a s t sh h s gs t a b l ee x p r e s s i o ni nt h en u c l e u sp e r i p h e r y ，c e ll p r 0 1 i f e r a t i o nw a si n h i b i t e d k e yw o r d s ：h s g ；c o p d ；f i b r o b l a s t ；t r a n s f e c t i o n ：a i r w a yr e m o d e l i n g 5 贵阳中医学院硕士学位论文 前言 慢性阻塞性肺病( c h r o n i co b s t r u c t i v ep u l m o n a r yd i s e a s e ，c o p d ) 是呼吸 系统常见病，其主要病理改变是气道重塑，气道重塑的主要原因是小气道成纤维 细胞的过度增殖s 近年来关于气道重塑的研究大部分局限于多种细胞因子促进气道纤维细胞 增殖的作用的研究n 3 。但谁是主要启动因子，谁是主要导致成纤维细胞增殖的主 要控制因子，尚不明确。因此通过干扰细胞因子达到抑制纤维组织增生，治疗靶 点不明确，临床疗效低，从而导致至今没有寻找到抑制c o p d 气道重塑的有效药 物嘲。目前基因研究成为热点，现在研究多局限于基因多态性与c o p d 发病关系 研究，a d a m 3 3 口3 等基因的研究多是促进气道重塑，未见将基因引入抑制c o p d 气 道重塑的相关报道。可见h s g 基因调控气道重塑研究目前尚属空白。由此限制了 其用于基因治疗的前景。要使主导气道重塑的纤维组织受到靶位明确的干扰，就 要提高抑制成纤维细胞增殖的基因表达，从而从源头上进行干扰。 1 9 9 7 年，我国学者陈光慧等利用差异显示技术对正常( w i s t a rk y o t o ，w k y ) 大鼠和自发性高血压大鼠( s p o n t a n e o u s l yh y p e r s e n s i t i v er a t ，s h r ) 血管平滑 肌细胞( v a s c u l a rs m o o t hm u sl ec e ll ，v s m c ) 的c d n a 文库进行筛选时分离得到 的一个新基因，其在w k y 中高表达，在s h r 中低表达故命名为高血压相关基因 ( h y p e r t e n s i o nr e l a t e dg e n e ，h r g ) 。接着，他们发现这一基因可以抑制 r a s r a f 一职k 一姒p k 途径，从而有效地阻遏细胞周期和抑制细胞增殖，证明其可 明显抑制血管细胞的增殖、迁移和重塑，并将此基因改名为细胞增殖抑制基 ( h y p e r p l a s i as u p p r e s s o rg e n e ，h s g ) h 1 。2 0 0 1 年，在肺组织中也克隆出这一基 因，并证明其可以促进线粒体的融合，命名为线粒体融合蛋白- 2 ( m i t o f u s i n - 2 ， m f n 2 ) h 1h s g 基因是一种比较新的基因，全长4 11 6 k b ，可编码6 6 1 个氨基酸。目前国 内外有报道称细胞增殖抑制基因h s g 有抑制成纤维细胞增殖作用，发现h s g 在正常 细胞高表达，在增值细胞中低表达嘲。 由于气道重塑导致c o p d 发展为慢性肺心病的患病率和病情严重程度均逐年 增高，成为呼吸系统疾病沉重经济负担的主要原因1 。干预气道重塑病理过程的 药物治疗，除了现正使用的如肾上腺皮质激素( 激素) 、白三烯受体拮抗剂、1 32 肾上腺受体激动剂等药物，近年来又出现了一些新的干预措施，如转化生长因 贵阳中医学院硕士学位论文 子一bl ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r 2b1 ，t g f - 1 31 ) 抗体、n 一乙酰半胱氨 酸、寡聚脱氧核苷酸佐剂等口】，但目前没有一个药物能够有效的阻止和逆转气道 重塑。故基因调控是目前及未来治疗成纤维细胞增殖的主要手段，目前国内外尚 未见将h h s g 基因引入抑制c o p d 气道重塑的相关研究。体外转染h h s g 至过度增 殖的细胞后，h s g 基因会不依赖其内源性表达而对细胞起抑制增殖作用，那么转 染外源性h h s g 至c o p d 大鼠气道成纤维细胞有望能抑制其增殖、促进凋亡。 可见小气道重塑是c o p d 病程发展的病理关键，气道成纤维细胞增殖是气道 重塑的实质，本实验通过体外转染含有绿色荧光蛋白基因( p e g f p ) 的 p e g f p - h h s g 至c o p d 气道成纤维细胞，以达到抑制气道成纤维细胞的过度增殖， 促进其凋亡，从而为抑制气道重塑、逆转气道重建打下理论基础。 贵阳中医学院硕士学位论文 第一部分：r h s g 基因在c o p d 模型大鼠气道成纤维细胞中的表达 研究 1 材料与仪器 1 1 试验试剂 木瓜蛋白酶：德国s i g m a 公司。 高糖d m e m ：g i b c o 公司。 四季青胎牛血清：天津灏洋生物制品科技有限公司。 胰蛋白酶：s i g m a 公司。 青、链双抗：美国g i b c o 公司。 p b s 干粉( i l 包) ：上海西唐生物科技有限公司。 二甲基亚砜( d m s o ) ：美国s i g m a 公司。 7 5 r a m 2 玻璃培养瓶：c o n i n g 公司。 小鼠抗波形蛋白( v i m e n t i n ) ：博士德公司。 山羊抗小舂i i g g f i t c - s i g m a 公司。 抗鼠r h s gc 末端及n 末端抗体由陈光慧教授教授赠送。 h r p 标记的羊抗鼠抗体：中山生物技术公司。 4 ，6 - 联脒一2 一苯基吲哚( d a p i ) ：s i g m a 公司。 6 孔培养板：广州雅怡生物科有限公司。 针头滤器( 孔径：0 2 2pm ) ：美国c o s t a r 公司。 眼科剪：常熟市亨利医疗器械有限公司。 镊子：常熟市亨利医疗器械有限公司。 其余试剂皆为国产分析纯。 1 2 常用试剂配置 胎牛血清的灭活 首先将胎牛血清解冻，把恒温水浴箱温度恒定于5 6 ，取紫外线照过的无菌 塑料袋将血清密封，然后把血清置于恒温箱中，定时灭活3 0 m i n 。取灭活后的胎 牛血清抽样行无菌试验，并分装成l o m l 瓶，于- 2 0 c 冰箱中冻存备用。 高糖d m e m 培养基的配置 将一袋d m e m ( 9 6 9 ) 粉溶于1 l 三蒸水中并加2 2 9 n a h c 0 3 ，调p h 值至7 3 ， 8 贵阳中医学院硕士学位论文 过滤后分装于4 冰箱保存。在使用前加胎牛血清。 p b s 液体( 0 0 1 m ) 配置 称n a c i8 o o g ，k c l0 2 9 ，n a 2 i p 0 41 2 h 2 01 5 4 9 ，k h 2 p 仉0 2 0 9 ，将其溶9 0 0 r a l 三蒸水中，把p h 值调至7 3 5 ，剩下的由去离子水补充，体积调至1 0 0 0 m l ，高 压消毒，分装后4 保存。 胰蛋白酶的配置 用电子天平准确称取胰蛋白酶粉剂0 2 5 9 溶入小烧杯中的双蒸水l o o m lp b s 液中。充分搅拌混匀，放于4 冰箱里过夜。用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶 溶液要在超净台内用注射滤器( 0 2 2 微米微孔滤膜) 抽滤除菌。再分装于无菌 小瓶置于- 2 0 x 2 冰箱保存以备使用。由于胰蛋白酶溶液偏酸，过滤前可调用碳酸 氢钠溶液调p h 至7 2 左右。 细胞冻存液 按血清：培养基：d m s o = 6 ：3 ：1 ( 体积比) 配制，经o 2 2l jm 微孔滤膜过滤 除菌。- 4 0 存放，现用现配，不能久存。 青、链霉素双抗 取l o m l 三蒸水溶解1 0 0 万单位的硫酸链霉素，用8 m l 硫酸链霉素溶液溶解 8 0 万单位青霉素粉，制成1 0 万单位m l 的青链霉素液，在使用时每i l d m e m 培养 基中加入i m l 双抗。由于配置好的青霉素易分解，最好现用现配。 1 3 仪器 ( 1 ) 超净工作台：j h t - s d c ，济南空气净化消毒设备厂。 ( 2 ) c 0 2 恒温培养箱：j a p a n 。 ( 3 ) 倒置显微镜和荧光显微镜：日本o l y m p u s 公司。 ( 4 ) 电泳仪：北京六一仪器厂。 ( 5 ) 常温离心机：上海安亭科学仪器厂。 ( 6 ) 冷冻离心机：德国h e t t i e h 公司。 ( 7 ) 烘箱：四川成都电烘箱厂。 ( 8 ) 隔水式电热恒温培养箱：宁波机电工业研究设计院。 ( 9 ) 电子天平：m e t t l e ：a e z 0 0 。 ( 1 0 ) 5 - 6 磁力搅拌器。 ( 1 1 ) 微量移液器：l o u l 、2 0 u l 、2 0 0 u l 和1 0 0 0 u l ，法国g 1 i s o n 公司产品。 贵阳中医学院硕士学位论文 ( 1 2 ) 4 c 、一4 0 冰箱：h a i r 。 ( 1 3 ) g a l a n z 微波炉。 ( 1 4 ) 超纯水系统：美国m i l l i p o r e 公司。 ? ( 1 5 ) 往复式水浴恒温振荡器：太仓市实验设备厂。 ? ( 1 6 ) 高压灭菌器：中国北京。 2 试验方法： 2 1 制造c o p d 大鼠模型 2 1 1 实验动物 鼠龄为1 2 周的健康清洁级w i s t a r 雄性大鼠2 0 只，体重2 6 0 9 + 2 0 9 ，由贵 阳医学院实验动物中心提供。所有动物饲养于贵阳中医学院动物所，平均温度 2 0 - 2 5 ，平均湿度4 0 - 6 0 。 2 1 2 实验分组：随机分两组：c o p d 模型组1 2 只；正常对照组8 只。 j j c o p d 模型组：自制的l o o c m x 5 0 c m x 5 0 c m 大纸箱内，箱顶留有直径2 a m 的通气孔，箱内放置石灰吸收c 0 2 ，以无水c a c l ：吸收水蒸气。鼠笼盛鼠放在箱 内，将烤烟叶6 9 放置于铁丝网上，下以酒精灯加热，用烧杯混合n a 2s 0 33 0 9 和h c l1 5 m l 生成s 0 2 ，另一烧杯盛氨水1 5 m l 自行蒸发氨气，封闭箱口综合使箱 中烟雾浓度为1 0 左右，每天2 次，持续3 0 m i n ，2 次之间间隔5 h ，连续6 0 d 。 于造模开始后第3 0 、3 2 、3 4 、3 6 天给以上各组大鼠木瓜蛋白酶雾化吸入， 具体方法如下：在大鼠清醒状态下，每次将六只大鼠放入一4 0 4 0x4 0 c m 的与 超声波雾化器相连的透明雾化箱中，通过雾化器向箱中喷入用0 9 生理盐水稀 释的3 9 l 的木瓜蛋白酶，每次雾化量2 m l 。连续造模2 个月后。 正常对照组：按正常大鼠饲养。 2 2 组织标本采集及原代培养 ( 1 ) 处死大鼠，无菌条件下开胸，将切除的新鲜的c o p d 大鼠和正常大鼠气道 组织标本立即投入含无菌双抗的p b s 液中带回实验室。 ( 2 ) 在无菌工作台里对组织标本反复用含双抗的p b s 冲洗5 遍。 ( 3 ) 无菌手术刀刮去气道周围组织和气道内膜，用消毒好的眼科剪将组织块剪 成2x2 m m 大小。 ( 4 ) 将剪好的组织块贴到培养瓶中( 图1 ) ，将培养瓶翻转置于3 7 0c 0 2 培养箱 贵阳中医学院硕士学位论文 中4 小时。 ( 5 ) 待其完全贴壁后在培养瓶中加入5 m l 含双抗的1 0 9 6 胎牛血清d m e m 培养基， 三天换液一次。 ( 6 ) 待细胞长满至8 0 时，去除组织块，用0 2 5 胰蛋白酶消化l o 分钟后传 代，取第4 代用于试验。 2 3 时差贴壁法纯化成纤维细胞 往培养瓶里加入与培养基等量的0 2 5 胰蛋白酶消化8 m i n ，轻轻吹打细胞 使之脱壁，使用2 0 0 目滤网过滤并离心，弃去上清液收集细胞用含胎牛血清的 d m e m 培养液重悬浮细胞。3 7 于c 0 2 孵箱内静置3 0 r a i n 后保留贴壁的气道成纤维 细胞，吸出d m e m 培养液并重复操作以纯化成纤维细胞。 2 4 成纤维细胞的鉴定 取第4 代细胞以3 1 0 4 个m 1 移至放有无菌盖玻片的6 孔板内制成细胞爬片， 3 d 后取出爬片，p b s 洗3 次。4 0r l 多聚甲醛固定细胞2 0 r a i n ，p b s 洗4 次。i 抗波形蛋白的浓度为1 ：1 5 0 ，i i 抗山羊抗小鼠i g g - f i t c 的浓度为1 ：1 5 0 ，d a p i 复染核，荧光显微镜观察。阴性对照组不必加i 抗波形蛋白，余步骤同前。 2 5 免疫组化检测大鼠气道成纤维细胞中的r h s g 表达 ，。 ( 1 ) 收集培养的c o p d 大鼠和正常大鼠气道成纤维细胞，把细胞密度调至3 1 0 4 5 x1 0 5 m l ，每点4 0i ll 的细胞数行离心甩片，2 5 0 0r m i n ，3m i n 。 ( 2 ) 等待涂片完全干燥后，以1 0 0 的丙酮固定1 0m i n ，在空气中自动干燥后 以1 的h 。0 2 处理1 5 m i n ，然后用o 0 1m o l l 的p b s 浸泡6m i n 。 ( 3 ) 细胞涂片分三组且p c o p d 大鼠、正常大鼠和对照组，在实验组的细胞涂片分 别加抗r h s gn 端或c 端抗体( 1 ：8 0 稀释) ，对照组则用p b s 代替。于3 7 孵育3 0m i n ， 用p b s 洗3 遍，在各组的细胞涂片都滴j j i h r p 标记的羊抗鼠i g g ( 1 ：8 0 稀释) ，于3 7 孵育3 0m i n ，用p b s 洗3 遍，以二氨基联苯氨( d a b ) 显色，在显微镜下观察，并 测蛋白表达阳性的灰度值。 3 结果 3 1c o p i ) 大鼠造模结果 以上方法连续造模2 个月后，2 月后模型组大鼠均出现气急、咳嗽等症状， 且在次期间症状呈进行性加重，并随机取2 只大鼠进行病理活检，均出现典型 重笪壁燮堕堡堂壁鲨塞 的c o p d 病理改变( 见图1 、2 ，3 ) ，提示造模成功。 擎孳o _ 气 “ ?47 叁l ? ? ! - 二麓 毫 q 鬣 ”肭扩 啕 l 墨 1 警 霞二。_ 0 盎 图2 c o p d 模型组大鼠4 0 0 可见支气管壁淋巴细胞、 浆细胞浸润，支气管粘膜上皮纤毛倒伏或脱落，杯状细胞明 显增多，包体增大。 鬻餐。0i “。、：芝 ；l 。”。j t 。 ” 辩二一：y 。o 、。- 。_ 吧。心、矿 ，t 、。kf ； ： ；- ， ；， 卜： 舡t、：狲 一“ 。 目 _ ：”“? ：4i ：二i ? ，j l 蠡。；：。、7 j 。“：1 7 。、， ”母， ，噜4t * “ 。 、谚嗡-t 啼l4 。；= “一 ：鼍 。； 图3c o p d 模型组大鼠肺组织l o o x 多数肺泡扩大融合， 弹力纤维呈破坏性改变，肺泡数量减少，泡壁吞噬细胞增多。 贵阳中医学院硕士学位论文 3 2c o p d 大鼠和正常大鼠气道成纤维细胞原代培养及纯化结果 c o p d 大鼠和正常大鼠气道经组织块法贴壁6 d 后，在倒置显微镜下可见组织 块周围有生长晕，8 d 后可组织块附近有较多细胞爬出，以三角形细胞和多边形 为主，有少量梭形细胞；1 2 d 后细胞铺满7 0 培养瓶底部，细胞形态以梭形、多 边形和三角形为主。将纯化的c o p d 大鼠气道成纤维细胞培养4 8 h 后，倒置显 微镜下可见成纤维细胞贴壁生长，大部分细胞呈梭形，少部分细胞呈多边形( 图 5 ) 。所有组织所得细胞平均可获纯化的细胞( 4 0 士0 5 ) x1 0 5 个。 图5 原代培养大鼠气道成纤维细胞( 组织块法)图6 第三代大鼠气道成纤维细胞 3 3 成纤维细胞鉴定结果 经时差法纯化后在倒置显微镜下可见