（中药学专业论文）黄褐毛忍冬皂苷脂质体的制备工艺及质量研究.pdf

贵阳中医学院硕士学位论文相关声明 原创性声明 4 i ii ii ll l l i i i ii ii l111 y 18 3 7 0 9 2 本文声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表论文中撰写过的研究成果，也不包含为获得贵阳中医学院或其他 单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均 已在论文中作了明确说明。 作者： r 期：力一年f 月日 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文；学校可根据国家或贵州省有 关部门规定送交学位论文。 作者签导师签名日期：伽f o 年r 月“日 目录 中文摘要1 英文摘要2 前言3 一刖吾 第一部分黄褐毛忍冬总皂苷中q 常春藤皂苷的含量测定5 l 仪器与试药5 2 实验方法与结果5 3 结果和讨论7 第二部分黄褐毛忍冬总皂苷对小鼠急性肝损伤的保护作用8 l 材料与方法8 2 实验方法与结果8 3 讨论9 第三部分包封率测定方法的确定1 0 1a 一常春藤皂菅的包封率测定1 0 2 总皂营的包封率测定1 l 3 结果和讨论1 2 第四部分黄褐毛忍冬总皂苷脂质体制备工艺及处方优选1 3 1 黄褐毛忍冬总皂苷脂质体的制备工艺的优选1 3 2 黄褐毛忍冬总皂苷脂质体的处方优选1 5 第五部分黄褐毛忍冬总皂苷脂质体的质量研究1 9 1 脂质体中c t 一常春藤皂苷包封率测定的方法学考察1 9 2 黄褐毛忍冬总皂苷脂质体的显微形态研究2 1 3 黄褐毛忍冬总皂苷脂质体的粒径和粒度分布研究2 2 4 黄褐毛忍冬总皂苷脂质体的初步稳定性研究2 3 第六部分全文总结2 4 1 结论与讨论2 4 2 创新点2 5 6 7 5 9 o o 厶0 厶口u 工u r u 一述图谢介 i 一 简 、 一 人 综附致个 献文 一 二 三四考录录录录参附附附附 贵阳中医学院硕：f ：学位论文 中文摘要 目的在已有研究基础上，将黄褐毛忍冬总皂苷制备成脂质体。优选出黄褐毛忍 冬总皂苷的最佳制各工艺及处方，并研究其质量标准。 方法黄褐毛忍冬总皂苷对小鼠急性肝损伤的保护作用以联苯双酯为阳性对 照药，测定血清中a l t 和a s t 值的变化，证明黄褐毛忍冬总皂苷对c c l 。致小鼠 急性肝损伤有保护作用。建立h p l c 测定黄褐毛忍冬总皂苷中0 常春藤皂苷含 量的方法包封率测定方法的确定以0 常春藤皂苷为指标，优选出包封率测定 的最佳方法甲醇超声破膜。在此基础上考察超声时间对破膜的影响，以破膜 之后释放出a 常春藤皂苷的量为指标，优选出最佳破膜时间。同时以重量法测 定总皂苷的包封率制备工艺的优选精密称取处方量物质，分别采用薄膜分散 法、逆向蒸发法和乙醇注入法制备黄褐毛忍冬总皂苷脂质体，以仪常春藤皂苷 的包封率为评价指标，优选出乙醇注入法为黄褐毛忍冬总皂苷脂质体的最佳制备 工艺。制备处方的优化以o t 常春藤皂苷、总皂苷的包封率为指标，通过均匀 实验优化处方。质量研究以优选出的最佳处方在最佳制备工艺的条件下制备 三批黄褐毛忍冬总皂苷脂质体，用h p l c 法测定其包封率、透射电镜观察形态并 统计其粒径分布范围。 贵掰1 中医学院顾i ：学位论文 a b s t r a c t p u r p o s eo nt h eb a s i so ft h ep r i m a r yr e s e a r c h ，m a k i n gl i p o s o m eo ft o t a ls a p o n i n si n l o n i c e r af u a ，o t o m e n t o s ah s ue ts c c h e n g t h eo p t i m u mp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n so f l i p o s o m eo ft o t a ls a p o n i n s i nl o n i c e r af i t h o t o m e n t o s ah s ue ls cc h e n gw e r e s e l e c t e dw i t hu n i f o r md e s i g nm a di t sq u a l i t ys t a n d a r dw a ss t u d i e d m e t h o d t oi n v e s t i g a t et h ep r o t e c t i v ee f f e c to fl i p o s o m eo ft o t a ls a p o n i n si n l o n i c e r a f u l v o t o m e n t o s ah s ue tx c c h e n g a c u t eh e p a t i ci n j u r yi nm i c e b i f e n d a t ea s a ne f f i c i e n td r u g ，d e t e c t e dt h ec h a n g eo fs e r u ma s t 、a l tt oc o n f i r mt h ep r o t e c t i v e e f f e c t so ft o t a ls a p o n i n si nl o n i c e r af u l v o t o m e n t o s ah s ue ts cc h e n go na c u t e h e p a t i ci n j u r yb ya n i m a lm o d e l a nh p l cm e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no f 一h e d e r i ni nt o t a ls a p o n i n si nl o n i c e r a f u h , o t o m e n t o s ah s ue ts cc h e n gw a s d e v e l o p e d t oe s t a b l i s ha nm e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no fe n t r a p m e n tr a t eo f l i p o s o m eo ft o t a ls a p o n i n s i nl o n i c e r af i t h , o t o m e n t o s ah s ue ts cc h e n g t a k e o c h e d e r i na st h et a r g e tt oc h o o s et h eb e s tm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fe n t r a p m e n t r a t e b r o k i n gt h em e m b r a n ew i t hm e t h a n o lb yu l t r a s o n i c o nt h a tb a s i s ，s t u d i e dt h e i n f l u e n c eo fu l t r a s o n i ct i m ei no r d e rt og e tt h eb e s tt i m e g r a v i m e t r i ca n a l y s i st h e e n t r a p m e n tr a t eo ft o t a ls a p o n i n s t os t u d yt h eb e s tp r o c e d u r et op r e p a r e ，t a k i n gt h e p r o d u c ti nr e c i p ep r e c i s e l y , p r e p a r i n gt h el i p o s o m e sb yt h i n f i l md i s p e r s i o nm e t h o d ， t h er e v e r s ee v a p o r a t i o nm e t h o da n de t h a n o li n j e c t i o nm e t h o d t a k ee n t r a p m e n tr a t eo f 仪一h e d e r i na st h et a r g e tt oc h o o s et h eb e s tm e t h o df o rl i p o s o m eo ft o t a ls a p o n i n si n l o n i c e r af i d v o t o m e n t o s ah s ue ts c h e n g ( 重) o p t i m i z i n gt h ep r e p a r a t i o np r o c e d u r e t a k i n ge n t r a p m e n tr a t eo f o r - h e d e r i na n dt o t a ls a p o n i n sa st h et a r g e t ，p r e s c r i p t i o nw a s o p t i m i z e db yu n i f o r md e s i g n ( 查) q u a l i t yr e s e a r c hp r e p a r i n gt h el i p o s o m e sb yt h eb e s t p r o c e d u r ea n db e s tm e t h o d ，d e t e c t i n gt h e i re n t r a p m e n tr a t e a n do b s e r v i n gt h e i r m o r p h o l o g yb yt e m 2 贵掰1 中医学院颂l j 学位论文 】j l l ， 日百 脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种。系指载体将药物通 过局部给药或全身血液循环而选择性地浓集定位于靶组织、靶器官、靶细胞或细 胞内结构的给药系统。它最初是在2 0 世纪6 0 年代由英国学者b a n g h a m 和 s t a n d i s h 将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。【l 】脂质体是指将药物包封于 类脂质双分子层内而形成的微型小囊，类脂质双分子层厚度4 n m 。 脂质体可以包封脂溶性或水溶性药物，具有靶向性和淋巴定向性、细胞亲和 性与组织相容性、长效作用、降低药物毒性等特点。其最突出特点是高度的靶向 性、并可控释、缓释药物，保护被包封的药物。脂质体因其内在的优势，已经成 为研究的热点。脂质体是治疗肝寄生虫病、利什曼病等网状内皮系统疾病理想的 药物载体，在肿瘤治疗方面，利用脂质体的靶向作用，将脂质体作为抗肿瘤药物 的有效载体而得到广泛应用。【z 】 经过多年的研究，目前国外上市的脂质体制剂已有1 0 余种，还有很多的制 剂在进行临床研究。脂质体作为一种药物制剂，已经经历了比其他药物传递系统 更全面、系统的研究。之所以这个过程如此漫长，主要是由于适合工业化生产的 工艺选择以及在制剂产品的稳定性等方面存在很多问题。 正因为脂质体制剂在药学质量方面无法保证其一致性，研制单位一般对脂质 体进行较为全面的药理、毒理、药代和组织分布研究，这种研究多为与普通制剂 比较的研究。需要指出的是，脂质体制剂一般会改变药物在体内的组织分布特征， 如在网状内皮系统摄取增加，肿瘤组织的药物浓度升高，血液中药物维持时间延 长。另外，脂质体制剂的研发目的是改善普通抗肿瘤药物制剂的某些问题，如减 轻多柔吡星的剂量限制性心脏毒性。因此，药理毒理研究中应关注组织分布变化 可能带来对其药效、毒性的影响，其试验研究需采用对比试验。对于试验项目的 要求，国外品种基本对p k 、组织分布、药效、急毒、长毒、局部刺激性均进行 研究，必要时也可能研究其特殊毒性。根据这些试验研究结果来看，脂质体制剂 可能会引发的药理毒理问题有：p k 参数和组织分布的改变。如在网状内皮系统 摄取增加，肿瘤组织的药物浓度升高，血液中药物维持时间延长。药效学作用的 增强、相似、或因毒性反应降低可增加给药剂量以提高疗效。 肝脏疾病，如病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等，是临床上的常见病和多发病。 贵阳中医学院硕f ：学位论文 据不完全统计，目前世界上各类肝病的总发病率已经高达1 7 ；在我国，肝病 的发病率接近1 4 。我国更是肝炎大国，掘权威资料显示病毒性肝炎发病数位 居法定管理传染病的第一位，仅慢性乙型肝炎病毒感染者就达1 2 亿。因此， 研制和开发保护肝脏、灭活病毒的药物对于治疗肝脏疾病具有重大意义。市场上 治疗肝病的药物大多数以西药为主，但是西药的疗效也远远不能满足现在的要 求。根据药物的特点和临床用药选择合适的剂型，可以提高药物的治疗效果，降 低药物的毒副作用。经我院对黄褐毛忍冬多年、大量的药理学研究，证实黄褐毛 忍冬总皂苷( 含o c 常春藤皂苷、无患子皂苷b 等) 具有很强的保肝作用，能够 增加谷胱甘肽的含量，增加肝脏抗坏血栓含量，诱导肝金属疏蛋白，降低肝微粒 体细胞色素p 4 5 0 。 3 - 6 】但以仪一常春藤皂苷为例，其属于三萜皂苷类，具有溶血 性和刺激性，不宜供静脉注射用。脂质体作为载体能将药物通过局部给药或全身 血液循环而选择性地浓集定位于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞内结构的给药系 统。脂质体可以包封脂溶性或水溶性药物，具有靶向性和淋巴定向性、细胞亲和 性与组织相容性、长效作用、降低药物毒性等特点。其最突出特点是高度的靶向 性、并可控释、缓释药物，保护被包封的药物。为了能最大程度的发挥药物的疗 效，同时又要尽可能的降低药物的毒副作用，将黄褐毛忍冬总皂苷制成脂质体是 其研究方向之一。从i i i i i 学的角度考虑，将它做成脂质体，既能最大程度的发挥 药物的疗效，同时又能降低药物的毒副作用，使它在到达靶器官之前不易失活， 提高它的生物利用度。 4 贵阳中医学院顾十学位论文 第一部分黄褐毛忍冬总皂苷中q 一常春藤皂苷的含量测定 1 仪器与试药 l c - 2 0 a t 型岛津高效液相色谱仪( 日本岛津公司) ；科导s k 8 2 1 0 超声波清洗器 ( 上海科导超声仪器有限公司) ；h e - 2 4 0 电子分析天平( 梅特勒一托利多仪器上海 有限公司) ；q 一常春藤皂苷对照品( a p p li c h e m a 2 0 6 0 0 0 1 0 ，天津一方科技公司 代购) ；黄褐毛忍冬总皂苷( 贵阳中医学院药剂实验室自制) ；色谱级乙腈( 江苏 汉邦科技有限公司) ；水为纯净水。 2 实验方法与结果 2 1 色谱条件及系统试用性实验色谱柱：a g i l l e n tc 埔柱( 5 1 l m ，4 6 2 5 0 m m ) ； 流动相：乙腈一0 1 磷酸溶液( 4 3 ：5 7 ) ；流速1 o m l m i n ；柱温：3 0 0 c ；检测 波长：2 0 5 n m ；进样量：l o t x l ；理论塔板数按q 一常春藤皂苷计不低于1 0 0 0 0 。对 照品和样品的色谱图见图l 。 ab 图1 对照品( a ) 和黄褐毛忍冬总皂营样品( b ) 色谱图 2 2 对照品溶液的制备精密称取4 0 减压干燥至恒重的对照品q 一常春藤皂苷 7 9 5 m g ，置2 5 m l 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得0 3 1 8 m g m l 对照品溶液。 2 3 供试品溶液的制备精密称取自制黄褐毛忍冬总皂苷约o 1 9 ，置l o m l 容量 瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，0 4 5 9 m 微孔滤膜滤过即得。 2 4 线性关系的考察按上述色谱条件，分别精密吸取上述对照品溶液0 5 m l 、 l m l 、2 m l 、3 m l 、4 m l 至5 m l 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，加上原液共得到6 个不同浓度的标准品溶液，设置进样体积为l o i t l 进样。以q 一常春藤皂苷的绝对 质量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程y = 2 4 1 3 2 1 x + 1 3 6 8 7 ，r = o 9 9 9 9 ，表明q 一常春藤皂苷在进样0 3 1 8 p g - 3 1 8 p g 范围内与峰面积 贵m 中医学院顾i ：学位论文 呈良好的线性关系，线性曲线见图2 。 图2 线性曲线图 2 5 精密度试验精密吸取对照品溶液l o i t l ，连续进样5 次，记录色谱图，以峰 面积计算，其r s d 为0 7 9 ，表明精密度良好。 2 6 重复性试验取黄褐毛忍冬总皂苷，按供试品溶液的制备方法，按取样量的 8 0 、1 0 0 、1 2 0 ，按“2 3 项下制备3 个不同浓度的供试品溶液各3 份，分别 注入色谱仪l o l l 测定峰面积。结果a 一常春藤皂苷平均含量1 2 4 4 ，r s d 为 1 4 1 。试验结果重现性好，所得数据准确。结果见表l 。 表l 重复性实验结果 2 7 稳定性试验取同一份供试品溶液在0 h 、2 h 、4 h 、6 h 、8 h 、1 2 h 内分别测定， 测定峰面积以算q 一常春藤皂苷含量。结果q 一常春藤皂苷平均含量1 2 5 7 ，r s d 为1 8 2 。表明供试品溶液在1 2 h 内稳定。结果见表2 。 表2 稳定性实验结果 2 8 加样回收率试验精密称取已知含量的供试品9 份，每份各约0 0 5 9 ，三份 6 0 o o o 0 0 o o o 0 0 o o o o o o o 0 0 o o o 0 d o o 8 6 4 2 l 贵阳中医学院硕： ：学位论文 一组，每组分别加入q 一常春藤皂苷对照品溶液( 0 3 1 8 m g m 1 ) 2 4 m l 、2 m l 、1 6 m l ， 依法处理制成供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果见表3 。 表3a 一常春藤皂苷同收率实验结果 3 结果与讨论 文献报道，q 一常春藤皂苷为主的总皂苷类成分对对乙酰氨基酚所致小鼠肝 脏毒性、醋氨酚所致肝损伤、镉所致急性肝损伤等化学性肝损伤具有很强的保护 作用。故本文测定了自制黄褐毛忍冬中q 一常春藤皂苷的含量，并进行方法学考 察。对黄褐毛忍冬总皂苷中的主要指标成分q 一常春藤皂苷进行了分析，得回归 方程y = 2 4 1 3 2 1 x + 1 3 6 8 7 ，r = 0 9 9 9 9 ，表明q 一常春藤皂苷在0 3 1 8 9 9 一3 1 8 肛g 范 围内与峰面积呈良好的线性关系。经过测定，q - 常春藤皂苷的平均含量为 1 2 4 4 ，r s d 为1 4 1 ，加样回收率为9 9 7 6 ，r s d 为0 6 4 。实验结果表明， 该方法简便、快速、可靠，该法的建立为黄褐毛忍冬总皂苷制剂的研究奠定了基 础。 7 贵阿1 中医学院硕 ? 学位论文 第二部分黄褐毛忍冬总皂苷对小鼠急性肝损伤的保护作用 为了确保黄褐毛忍冬总皂苷的制剂开发具有一定的社会和经济意义，在进行 制剂学研究之前，我们对黄褐毛忍冬总皂苷进行了简单的药效学考察，确保其生 物活性。 _r l 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 动物s p f 级小鼠，体重( 2 0 2 9 ) ，雌雄各半，贵阳医学院实验动物中心 提供。 1 1 2 药品与试剂黄褐毛忍冬总皂苷( 自制) ，天门冬氨酸氨基转移酶( a s t ) 、 丙氨酸氨基转移酶( a l t ) 试剂盒( 上海荣盛生物技术有限公司) 。 1 1 3 仪器设备a u y 2 2 0 万分之一分析天平( 日本岛津) ；g l a m o u r l 6 0 0 全自动生化 分析仪( u v v i sm e t r o l a bs a 公司) ；低速自动平衡微型离心机( 北京医用 离心机厂) 。 1 2 方法 1 2 1 动物分组和处理取s p f d 、鼠6 0 只，随机分组，设空白组( a ) 、模型组( b ) 、 阳性对照组即联苯双酯组( 0 6 9 k g 水溶液) ( c ) 、黄褐毛忍冬总皂苷低剂量组 ( o 0 0 7 5 m g m 1 ) ( d ) 、黄褐毛忍冬总皂苷中剂量组( 0 1 5 5 m g m 1 ) ( e ) 、黄 褐毛忍冬总皂苷高剂量组( 0 2 3 3 m g m 1 ) ( f ) 共6 组，每组1 0 只。按按体重2 0 m l k g 用联苯双酯和不同剂量的黄褐毛忍冬总皂苷分别给c 、d 、e 、f 组灌胃，每天1 次， 正常组与模型组每天灌服等体积的纯净水，连续7 天。 1 2 2c c l 。诱导小鼠急性肝损伤动物模型的建立最后一次用药1 h 后造模，除空白 对照组外，其余5 组小鼠均腹腔注射0 1 c c l 。花生油溶液，剂量为1 0 m l k g ，空白对 照组同法腹腔注射等量的花生油，禁食( 自由饮水) ，1 6 h 后各组经颈部取血作有关 检测。 1 2 3 检测指标及方法 1 2 3 1 血清的制备将颈部取得的全血放入离心管中，室温放置3 0 m i n 后再以 2 0 0 0 r m i n 的转速高速离, 心2 5 m i n ，取上部即得。 1 2 3 2 试剂工作液的制备分别将a l t 、a s t 试剂盒中试剂1 和试剂2 按照4 ：1 的 比例混匀即得。 1 2 3 3 检测方法将工作液和标本放入g l a m o u r l 6 0 0 全自动生化分析仪，在检测 波长为3 4 0 n m 条件下进行检测。 2 实验结果 模型组血清a l t 、a s t 水平升高，与空白组相比较，p o 0 1 ，说明模型建立成功； 黄褐毛忍冬总皂苷高、中、低剂量组均能降低小鼠血清中升高的a l t 、a s t 活性， 高、中剂量组与模型组比较，p t 。) 融化，反复操作5 - - 6 次。 为了降低脂质体的粒度和层数，使其粒度分布更均匀，可采取探头式超声、 微射流、高压匀质、加压挤出等手段。但处理过程中应避免温度过高，同时温度 也应该保持在t 。之上心1 。 如阎家麒等o ”采用薄膜分散法制备了紫杉醇脂质体，其配方紫杉醇、心磷脂、 卵磷脂和去氧胆酸钠的摩尔比为l ：l ：5 ：l ，混合溶液在旋转蒸发器内减压除去溶 剂，形成磷脂和药物的薄膜。然后加入缓冲液溶解干燥膜。溶液用超声波处理 0 5 h ，然后经中空纤维透析器对溶液透析，将透析液离心，除去并收集末被包封 的紫杉醇以备再用。薛玉英等川以硫酸氢黄连素与p v p 之比为1 ：5 制成共沉淀物， 采用药脂比为1 ：2 0 ，胆固醇与豆磷脂之比为2 ：7 5 1 j 备硫酸氢黄连素脂质体，包封 率为4 8 7 2 。具体方法为：将一定比例的豆磷脂和胆固醇溶于无水乙醇中，减压 成膜，将硫酸氢黄连素溶于磷酸盐缓冲液中，用该溶液将膜沈脱，超声处理即得。 1 1 2 逆相蒸发法 逆向蒸发法是将磷脂、胆固醇和十八胺按一定的物质的量比混合后，溶解于 有机溶媒中，短时超声振荡，直至形成稳定的水油乳剂，然后减压蒸发除掉有 机溶媒，达到胶态时再加缓冲液，充分混匀后继续减压蒸发，直到所有的有机溶 媒蒸发完全。将制得的水性混：悬液经层析柱或高速离心，除去未包封的药物即得 大单层脂质体。该制备方法包封容积和包封率都很高( 6 0 ) 左右，设备要求相 对简单，适用于大部分磷脂的混合物，适于大规模生产。 董平等1 用逆相蒸发法制备脂质体鬼臼毒素混悬液，以壳聚糖作为涂膜剂的 成膜材料，配置成0 5 的脂质体鬼臼毒素涂膜剂。结果得到的脂质体为单层，粒 度在2 0 0 n m - - 8 0 0 n m 之间，平均包封率为7 6 3 ，平均回收率为9 6 3 ，壳聚糖涂膜 剂稳定性较脂质体混悬液高，脂质体鬼臼毒素涂膜剂制备方法可行，质量控制简 单可靠。 1 1 3 注入法 将磷脂与胆固醇等类脂质及脂溶性药物溶于有机溶剂中( 一般多采用乙醚) ， 然后将此药液经注射器缓缓注入加热至5 0 c ( 并用磁力搅拌) 的磷酸盐缓冲液( 或 含有水溶性药物) 中，加完后，不断搅拌至乙醚除尽为止，即制得大多孔脂质体， 其粒径较大，不适宜静脉注射。再将脂质体混悬液通过高压匀质机二次，即得成 贵阳中医学院顾十学位论文 品。成品大多为单室脂质体，少数为多质体，粒径绝大多数在2 i i m 以下。本法的 优点是类脂质在乙醚的浓度不影响脂质体大小；缺点是使用有机溶剂和高温，会 使大分子物质变性和对热敏感物质灭活，脂质体粒度不均匀。 宁晓闵等阳1 用注入法制备雷公藤内酯酮多相脂质体，其操作过程为：先将丙 酮封盖的精制大豆磷脂减压蒸发，以除去丙酮，称取蒸干的大豆磷脂、胆固醇、 油酸、吐温- 8 0 、司盘- 8 0 ，与雷公藤内酯酮共溶于乙醇中。另将p v p 溶于磷酸缓 ! 冲液中，预热6 0 c ，在6 0 恒温磁力搅拌器上，将大豆磷脂胆固醇等及雷公藤内 酯酮溶于无水乙醇的溶液缓缓注入6 0 的p v p 磷酸缓冲液中，随加随搅拌( 挥发乙 醇) ，全部加入后继续搅拌0 5 h ，移入6 0 恒温的组织捣碎机中搅拌1 5 m i n ，最后 加缓冲液至足量，过滤，1 0 0 c 3 0 m i n 流通蒸汽消毒。注入法制备雷公藤内酯酮多 j 相脂质体，所形成脂质体大小形状取决于脂溶性溶液的浓度及注入的速度，搅拌 要剧烈均匀。但是，t 采用注入法制备温度要求高于磷脂相变温度1 0 ，温度的控 制对成品质量影响较大。 1 1 4 冷冻干燥法 将磷脂( 胆固醇) 、二糖溶解于比例适宜的叔丁醇水共溶剂中，形成单相 溶液。将上述单相溶液冷冻干燥，可得到脂糖的固体分散体。此种工艺可解决 脂质体制剂的稳定性问题，且工艺简单，易得到无菌制剂。但对相变温度低的天 然磷脂较适合，并且处方中应添加少量荷电的磷脂。 李晓光等盯1 先用薄膜分散法制得甘草酸单铵盐的半透明混悬液，冷至室温， 按冻干保护剂一卵磷脂( 4 ：1 ，w w ) 的比例加入蔗糖，冻干即得。脂质体在液态条 件下易发生聚集、融合，不能长时间保存，冻干后保存是较常用的方法。冻干的 关键在于选取适当的冻千保护剂及投料比。通过正交试验考察了蔗糖、葡萄糖、 甘油等常用冻干保护剂的效果，最终选定为蔗糖、糖脂比为4 ：1 。结果显示，冻 干前后脂质体的外观、含量均无明显变化。 由冷冻干燥法衍生出了许多其它的相关方法。如储茂良等阳1 采用冻融法制备 了丹参酮脂质体，结果表明，经冻融处理的丹参酮脂质体的包封率明显提高，稳 定性也更好；一定范围内，脂质体的包封率和粒度随冻融次数的增加而略有增大； 冻融后搅拌或超声均可使聚集的脂质体解聚。邓英杰等阳1 采用筛选的处方、熔融 法制备了十几批黄芪多糖脂质体，所得黄芪多糖脂质体体系稳定。 2 9 贵m 中医学院颂i ：学位论文 1 1 5 流化床包衣法 将磷脂胆固醇溶解在乙醇中，用得到的溶液对载体物质( 如二糖) 粉末进 行包衣，得到自由流动的粉末。口服给药后，包裹在粉末表面的磷脂膜与胃肠道 液接触，就会自发形成多室脂质体。经过进一步处理后，此类粉末可以制成口服 制剂，如片剂、硬胶囊等。采用此种手段的目的就是为了提高脂溶性药物的生物 利用度。 1 i 6a l z a 公司的制备技术 在制备的过程中，可以调整乙醇、磷脂、水3 种组分的比例，使其落到脂质 体区，形成不均匀的脂质体。之后再使用挤出、匀质等手段将其处理成小粒度、 单分散的脂质体。上述方法经过合理调整后，可以应用于产业化。目前已经被a l z a 公司使用。 1 2 主动载药制备技术 该技术制备工艺通常包括如下步骤：制备空白脂质体；通过透析、柱层 析等手段创造特定的梯度；在合适的温度下，将膜内外已经形成梯度的空白脂 质体和待包封的药物孵育，以便完成药物的装载。 1 2 1p h 梯度法 该方法是使空白脂质体膜两侧内外水相形成p h 浓度梯度，主动包封药物的载 药脂质体制备方法。根据l j h e n d e r s o n 理论，每个p h 单位的变化会产生分子型 与离子型药物浓度1 0 倍之差。如果制造脂质体内外p h 梯度为3 0 个单位时，理论 上就会造成药物分子型与离子型浓度的1 0 0 0 倍之差。由于分子型药物易与脂质体 双分子膜结合，加之在膜相变温度下孵化时，脂质体由“胶晶 态变为“液晶 态，膜的通透性大为增加，从而加快了药物分子的跨膜内转过程。 人们在了解了p h 梯度法的原理后，做了大量的工作。h w a n g 等n 们用p h 梯度法 使被荧光素异硫氰酸盐标记的胰岛素( f i t c ：i n s u l i n ) 的包封率最高达到5 0 ，而 传统逆相蒸发法制备的胰岛素脂质体最高包封率仅为2 0 。w a n g 等1 用p h 梯度法 制备多柔比星隐形前体脂质体，平均粒径为1 1 2 n m ，研究得出由于溶剂不同，其 包封率也不同，在纯水中为9 6 5 ，在5 葡萄糖溶液中为9 5 5 ，而在0 9 n a c i 中为9 8 0 1 。s h i m i z u 等n 羽则用p h 梯度法制备了新型拓扑异构酶抑制剂41 3 一氨基 一47 一o 去甲基一4 一去氧鬼臼霉素( t o p - 5 3 ) ，包封率大于9 0 ，研究表明，制得的 贵阳中医学院硕：上学位论文 脂质体虽不能加强药物的抗癌活性，但大大降低了毒副作用。w a t e r h o u s e 等n 3 1 用p h 梯度法制备长春新碱脂质体，并对脂质选择、摩尔比、制备方法、粒径、表 面电荷、生物利用度及药效进行了深入研究。 1 2 2 硫酸铵梯度法 该法首先使用硫酸铵缓冲液制备空白脂质体，之后采用交叉流透析等手段除 去脂质体外相的硫酸铵，造成磷脂膜内外的硫酸铵梯度，然后在加热的条件下完 成药物的装载。此法的优势在于制备空白脂质体的过程中，接近中性的硫酸铵水 溶液不会引起过多的磷脂分子水解。 2 脂质 近 途径和 主要问 双分子 漏等n 4 1 行质量 2 1 形 脂 不同粒 体大小 不仅能 2 2 主 脂 结合分 以分光 2 3 体 体 质体的 适宜的 透析管 i i j i ；，i | l ir - j “jjn 、f , j 一j i “j j，l - ji j i il ，：u ，ll 。i ” 2 4 药物在脂质体内包封率的测定 脂质体的包封率足影响脂质体质量的主要因素之一。包封率主要足由药物性 质、脂质体的制备方法以及脂质膜的组成所决定的，其中药物性质是影响脂质体 包封率最主要的因素。中国药典2 0 0 5 年版规定，等分散在液态介质中的脂质 体应测定包封率。包封率的测定主要是将游离药物与被包裹药物分离，要求在保 证被包裹药物稳定的前提下将游离药物分离出来，分离方法的选择至关重要。选 择合理的分离方法首先必须充分了解药物和制剂的性质，然后通过预实验确定分 离的终点和测定方法，可以同时比较不同方法的分离效果，最终确定合适的分离 方法。 文献报道n 印测定包封率的方法较多，主要有葡聚糖凝胶过滤法、超速离心法、 透析法等。葡聚糖凝胶过滤法为一种经典的测定方法，但方法烦琐、耗时长，原 材料也较贵；超速离心法仪器要求条件高，价格昂贵；透析法则需不断更换透析 液。 3 研究进展 经过多年的研究，目前国外上市的脂质体制剂已有1 0 余种，还有很多的制 剂在进行临床研究。脂质体作为一种药物制剂，已经经历了比其他药物传递系统 更全面、系统的研究。之所以这个过程如此漫长，主要足由于适合工业化生产的 工艺选择以及在制剂产品的稳定性等方面存在很多问题。 正因为脂质体制剂在药学质量方面无法保证其一致性，研制单位一般对脂质 体进行较为全面的药理、毒理、药代和组织分布研究，这种研究多为与普通制剂 比较的研究。需要指出的是，脂质体制剂一般会改变药物在体内的组织分布特征， 如在网状内皮系统摄取增加，肿瘤组织的药物浓度升高，血液中药物维持时间延 长。另外，脂质体制剂的研发目的是改善普通抗肿瘤药物制剂的某些问题，如减 轻多柔吡星的剂量限制性心脏毒性。因此，药理毒理研究中应关注组织分布变化 可能带来对其药效、毒性的影响，其试验研究需采用对比试验。对于试验项目的 要求，国外品种基本对p k 、组织分布、药效、急毒、长毒、局部刺激性均进行 研究，必要时也可能研究其特殊毒性。根据这些试验研究结果来看，脂质体制剂 可能会引发的药理毒理问题有：p k 参数和组织分布的改变。如在网状内皮系统 贵阳中医学院硕 ：学位论文 摄取增加，肿瘤组织的药物浓度升高，血液中药物维持时间延长。药效学作用的 增强、相似、或因毒性反应降低可增加给药剂量以提高疗效。 目前国内批准上市的脂质体药物主要有注射用紫杉醇脂质体和注射用两性 霉素b 脂质体，另外还有十余个脂质体药物向s f d a 递交了申请，大多处在技术 审评和临床研究阶段。现阶段越来越多的高校和研究机构都在深入进行有关脂质 体的研究，发表的论文及成果在逐年增加，这将极大的推动脂质体技术的应用。 从总体上看，我国在脂质体技术和药物新剂型某些方面与国外先进水平还有较大 差距，必须加大人力物力的投入，才能使我们跟上国际的发展水平。脂质体药物 新剂型属于高技术研究领域，技术难度高。由于不同类型药物的理化性质差异， 如结构、溶解性、稳定性等均有相应的制备技术要求，同时在技术、膜材料、中 试放大、人才培养等环节需要不断完善，这些因素都从客观上对脂质体这一新剂 型提出了进一步深入研究的要求，特别是对从实验室研究到工业化生产过程中的 共性问题的研究。 参考文献 ， 1 b a n g h a ma d d i f f u s i o no fu n i v a l e n ti o n sa c r o s st h el a m e l l a eo fs w o ll e n - 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n 惋测器a ： 0 5 l 鼙 l八压 、- ，、，- - ，- - 一、一 o5 01 0 01 5 o2 0 02 5 0m i n 4 l 贵阳中医学院顾f ：学位论文 o 05 01 0 01 5 0 2 0 02 5 0 0 05 01 0 01 5 02 0 02 5 0m i n m v 0 05 01 0 01 5 02 0 02 5 0m i n 0 05 01 0 01 5 02 0 02 5 0m i n m v 0 05 01 0 01 5 02 0 02 5 0 m i n 0 05 01 001 5 o2 0 02 5 0 r a i n 0 二 榆测器 ： 0 5 骠 | l 一 天 柃测器a ： 0 5 盯 l k 一、 八 盆 寸n寸n 拎删器a 【： 0 5 l ，、 八盆 l ， ， n 寸卜