（临床检验诊断学专业论文）tem型超广谱β内酰胺酶的体外定向进化研究.pdf

温州医学院硕士学位论文 t e m 型超广谱b 一内酰胺酶的体外定向进化研究 中文摘要 目的： 应用d n a 家族改组方法提高t e m 型超广谱p 内酰胺酶的活性，预测三级 结构来探讨t e m 型e s b l s 结构与活性的关系，为新型p 内酰胺类抗菌素清除剂 的研制打下基础。 方法： 1 b l a r e m 突变文库的构建、筛选和序列测定经d n a 家族改组获得与原基 因大小相同的改组后基因，将其克隆入原核表达质粒p e t 2 8 a ( + ) ，构建突变 文库。利用酶的催化特点建立了基于平皿初筛和琼脂稀释法复筛的筛选体系， 该筛选系统以最低抑菌浓度为指标。对活性增高菌株b l a t e m 基因进行序列测 定，并预测分析其蛋白质三级结构。 2 重组质粒p e t 2 8 a b l a r e m - 3 和p e t 2 8 a 6 缸t e m m 五在大肠杆菌中诱导表达及其 优化 将重组质粒p e t 2 8 a b l a r e m 3 和p e t 2 8 a - b l a i t m m 2 ( 从突变株m u t e 1 1 获得) 转化入ec o l i b l 2 1 ( d e 3 ) ，i p t g 诱导表达，s d s p a g e 分析。在 不同条件下( 诱导温度、诱导时间和i p t g 浓度) 诱导表达后比较不同条件 下重组蛋白表达情况，以选择最佳的诱导条件。 3 重组t e m 3 型e s b l 和t e m 们e s b l 包涵体的复性和纯化及其酶动力学分 析大量表达分离重组t e m 3 型e s b l 和t e m n 卜2e s b l 包涵体，并用2 m o l l 尿素和1 t r i t o nx 1 0 0 反复洗涤。以8 m o l l 尿素溶解包涵体，将包涵体裂解 液上样于弱阴离子交换柱d e a es e p h a r o s eff ，进行柱上复性，复性产物进 一步用分子筛s e p h a d e xg 。7 5 纯化。复性纯化产物进行酶动力学分析，比较 改组前后酶动力学变化情况。 结果： 1 突变文库的筛选及突变株的序列分析经过一轮d n a 家族改组成功构建 突变文库，并筛选获得两株耐药性增加的突变株m u te 7 和m u te 1 l ，m u te 7 菌株耐药性增高不明显，除c a z 对其m i c 较对改组前的菌株有4 8 倍增加 外，其他抗生素对其m i c 没有变化，其核苷酸序列有7 个碱基替换，氨基酸 改变为e 1 0 4 k ，r 1 6 4 s ：而对于m u te 1 l 菌株，耐药性增高表现为m i c 值增 高2 4 倍( 脚) 、4 8 倍( c e z ) 、4 8 倍( c x m ) 、1 6 3 2 倍( c a z ) 、8 倍以上( c r o ) 和4 8 倍( c t x ) ，其核苷酸序列有7 个碱基替换，氨基酸 温州医学院硕士学位论文 改变为s 5 9 g ，r 1 6 4 s ，a 2 3 7 t 和e 2 4 0 k 。 2 重组质粒在原核系统中的诱导表达及优化 重组菌p e t 2 8 a ( + ) 一b l a r e m - 3 b l 2 1 ( d e 3 ) 和p e t 2 8 a ( + ) - b l a t e m 眦b l 2 1 ( d e 3 ) 毛ee c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中上清表 达较少，主要以包涵体形式表达，通过优化诱导条件显示p t g 浓度为 0 1 m m o l l 、诱导温度为3 0 、诱导时间4 h 以上能高效表达t e m m - 2 e s b l 。 3 t e m 3 型e s b l 和t e m 们e s b l 包涵体的复性和纯化及酶动力学分析 变性的重组t e m 一3 型e s b l 和t e m m 。2 e s b l 包涵体经阴离子交换层析柱 d e a esf f 柱上复性、纯化和分子筛s e p h a d e xg 7 5 进一步纯化后纯度达 9 0 。改组前后t e m 型e s b l 酶动力学分析结果显示，经d n a 家族改组 t e m 盯卜2 e s b l 对p 内酰胺类抗生素的催化效率有不同程度的改变，与改组前 t e m 3 型e s b l 相比对青霉素g 和氨苄青霉素的址分别增高1 5 倍和4 4 倍，对头孢唑啉和头孢他啶的m 分别增高3 1 倍和2 8 倍，而对头孢曲松 和头孢噻肟的a t 却分别降低了1 7 倍和2 5 倍。 结论： 改组后菌株的t e m 型e s b l s 活性提高，d n a 家族改组是一种有效地改善 酶活性的体外定向进化技术。通过分析t e m 型e s b l s 结构与效应的关系，有助 于研究t e m 型e s b l s 的作用机制，并为新一代p 内酰胺类抗生素及其清除剂的 研制提供理论依据。 关键词： t e m 型超广谱p 内酰胺酶，d n a 家族改组，最低抑菌浓度，包涵体，离子 交换层析，柱上复性，酶动力学分析 2 温州医学院硕士学位论文 i nv i t r od i r e c t e de v o l u t i o no ft e m e x t e n d e d - s p e c t r u m p - l a c t a m a s e a b s t r a c t o b j e c t i v e ： i no r d e rt oi m p r o v et h ea c t i v i t yo ft e m e x t e n d e d s p e c t r u mb e t a - l a c t a m s eb y d n a f a m i l ys h u f f l i n g ，t oa p p r o a c ht h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t r u c t u r ea n da c t i v i t yo f t e me s b l sb yp r e d i c t e dt e r t i a r ys t r u c t u r e ，i ti sc o n t r i b u t e dt or e s e a r c ht h en e w b e t a - l a c t a ma n t i b i o t i c sp a r t n e r m e t h o d s ： 1 c o n s t r u c t i o na n ds c r e e n i n go fb l a t e mm u t a n tl i b r a r ya n ds e q u e n c eb l a t e m c h a n g e db yd n af a m i l ys h u f f l i n gi n s e r t e di n t op e t 2 8 a ( + ) t oc o n s t r u c tm u t a n t l i b r a r y , a n das c r e e n i n gs y s t e mw a sd e s i g n e da n db a s e do nd e t e c t i n gm i n i m u m i n m b i t o rc o n c e n t r a t i o n , w h i c hi n c l u d e dt h ee l e m e n t a r yp l a t es c r e e n i n ga n d s e c o n d a r ya g a r d i l u t i o n t h eg e n eo fm u t a n t s 、析t l li m p r o v e da c t i v i t yw a s s e q u e n c e da n da c c o r d i n g l yt h e i rp r o t e i n st e r t i a r ys t r u c t u r e sw e r ep r e d i c t e db y s 、历s sp d bv i e w e r 2 r e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t 2 8 a b a t e m - 3a n dp e t 2 8 a - b l a t e m m 2w e r ee x p r e s s e d i n d u c e dw i t hi p t gi ne c o l ib l 21r e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t 2 8 a - b l a t e m 3 a n dp e t 2 8 a 一6 如r e m 眦w e r et r a n s f o r m e di n t oec o l ib l 21 ( d e 3 ) a n di n d u c e d w i t hi p t gt h ee x p r e s s i o no ft e m - 3e s b la n dt e m m - 2 e s b lw a sa n a l y z e db y s d s p a g e w es e l e c tt h eb e s ti n d u c t i o n c o n d i t i o nt h r o u g hc o m p a r i n ge x p r e s s i o n o fr e c o m b i n a n ti nd i f f e r e n tc o n d i t i o n ( i n d u c e dt e m p e r a t u r e ，i n d u c e dt i m ea n d c o n c e n t r a t i o no fi p t g ) 3 t h er e f o l d i n g ，p u r i f i c a t i o na n de n z y m ek i n e t i c so fr e c o m b i n a n tt e m 一3 e s b la n dt e m m - 2 e s b lt h et e m 3e s b la n dt e m m 2 e s b li n c l u s i o n b o d i e sw e r er e p e a t e dw a s h e db y2m o i lu r e aa n dl t r i t o nx - 10 0a n dd i s s o l v e d i n8 m o l lu r e a t h ed e n a t u r e dt a r g e tp r o t e i nw e r el o a d e do n t ot h ed e a e s e p h a r o s effa n dr e f o l d e dd u r i n gal i n e a r86 - - 2 m o l lu r e ag r a d i e n ta tf l o wr a t e 0 6m l m i n f u r t h e r m o r e ，t h er e f o l d e ds a m p l ew a se l u t e dd u r i n gal i n e a r5 0 5 0 0 m m o l ln a c lg r a d i e n ta tf l o wr a t e1m l m i na n df l l r t h e rp u r i f i e db ys i z e e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h ys e p h a d e xg - 7 5 w ea n a l y z e de n z y m ek i n e t i c so ft h e 3 温州医学院硕士学位论文 r e f o l d e dt e m 3e s b la n dt e m m - 2 e s b la n dc o m p a r e dt h e i rd i f f e r e n c e r e s u l t s ： 1 s c r e e n i n go ft h em u t a n tl i b r a r ya n dt h e i rs e q u e n c ea n a l y s i s a f t e ro n e r o u n dd n a f a m i l ys h u f f l i n gf o l l o w i n gb ys c r e e n i n g ，t w om u t a n t s 谢也i m p r o v e d d r u gr e s i s t a n c ew e r eo b t a i n e d ，n a m e dm u t e 一7a n dm u te - 1 1 t 1 1 er e s u l t ss h o w e d t h a tm u te - 7e x p r e s s e di nec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) o n l yr e s u l t e di n1 3 - 1 a c t a r n a s e 谢t i l h i g h e rr e s i s t a n c e ( f o u rt oe i g h tt i m e s ) t oc e f f a z i d i m e ( c a z ) g e n ea n a l y s i so fm u t e 一7i n d i c a t e dt h a tn u c l e o t i d es e q u e n c eh a dh a p p e n e ds e v e nb a s es u b s t i t u t i o n sa n d t h em u t a n te n z y m eh a dh a p p e n e de10 4 k ，r 16 4 sm u t a t i o n s m u te 一1 le x p r e s s e d i i lec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) o n l yr e s u l t e di n1 3 - 1 a c t a m a s e sw i t hh i g h e rr e s i s t a n c et o 1 3 - 1 a c t a m sa n t i b i o t i c s ，s u c ha sa m p i c i l l i n ( t w ot of o u rt i m e s ) ，c e p h a z o l i n e ( f o u rt o e i g h tt i m e s ) ，c e f u r o x i m e ( f o u rt oe i g h tt i m e s ) ，c e r a z i d i m e ( s i x t e e nt ot h i r t y t w o t i m e s ) ，c e f o t a x i m e ( f o u rt oe i g h tt i m e s ) ，a n dc e f t r i a x o m e ( o v e re i g h tt i m e s ) g e n e a n a l y s i so fm u t e l1i n d i c a t e dt h a tn u c l e o t i d es e q u e n c eh a dh a p p e n e ds e v e nb a s e s u b s t i t u t i o n sa n dt h em u t a n te n z y m eh a dh a p p e n e d $ 5 9 g ，r 1 6 4 s ，a 2 3 7 ta n d e 2 4 0 km u t a t i o n s 2 t h ei n d u c e de x p r e s s i o na n di t s o p t i m i z a t i o no fr e c o m b i n a n tp l a s m i di n p r o k a r y o t i cs y s t e m r e c o m b i n a n tt e m 3e s b la n dt e m m 。2e s b l ( o b t a i n e df r o mm u te 一1 1 ) 谢mm o l e c u l a rs i z e3 lk d aw e r eh i g h l ye x p r e s s e di n ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) a n dw e r em a i n l yp r e s e n ti ni n c l u s i o nb o d yo b s e r v e db y s d s p a g e b o t hp r o t e i n sw e r eh i g h l ye x p r e s s e db yi n d u c e do v e rf o u rh o u r si n 0 1 m m o l li p t ga t3 0 3 r e f o l d i n g ，p u r i f i c a t i o na n de n z y m ek i n e t i c so ft e m - 3e s b la n dt e m m 五 e s b li n c l u s i o nb o d v1 1 1 ed e n a t u r e dt e m 3e s b la n dt e m 盯卜ze s b lw e r e s u c c e s s f u l l yr e f o l d i n gb yd e a esf fc o l u m na n dp u r i f i e db yd e a esf fa n d s e p h a d e xg 一7 5 t h ep u r i t yo fa c t i v ep r o t e i nw a s9 0 m o r e o v e rt h ee n z y m e k i n e t i c so ft e m m 2e s b la n dr e c o m b i n a n tt e m 3e s b lw e r ed e t e r m i n e d t h e o v e r a l lc a t a l y t i ce f f i c i e n c y ( 砒 ，m ) o fh y d r o l y s i sf o r1 3 - 1 a c t a m sa n t i b i o t i c ss u c ha s p g ，栅，c e za n dc a z ，w a st os o m ei n t e n ti n c r e a s e dr e s p e c t i v e l y ，i n s t e a do f c e f o t a x i m ea n dc e f t r i a x o m e c o n c l u s i o n ： t h ea c t i v i t yo ft e me x t e n d e d s p e c t r u m1 3 - 1 a c t a m a s ew a se n h a n c e db yd n a f a m i l ys h u f f l i n g ，w h i c hc a ni m p r o v et h ea c t i v i t yo fe n z y m ee f f e c t i v e l yt h r o u g h n v i t r od i r e c t e de v o l u t i o n b ya n a l y z i n gt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t r u c t u r ea n de f f e c t ， 4 温州医学院硕士学位论文 t h i s s t u d yp r o v i d e s t h eb a s i sf o rr e s e a r c ho ft h em e c h a n i s mb e t w e e nt e m i b - l a c t a m a s e sa n ds u b s t r a t e ，a n di sc o n t r i b u t et od e v e l o pt h en e wg e n e r a t i o nl b - l a c t a r n s a n t i b i o t i c sa n di t sp a r t n e r k e yw o r d s ： t e m e x t e n d e d - s p e c t r u m l 3 - l a c t a m a s e ，d n a1 f a m i l ys h u f f l i n g ，m i n i m u m i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ，i n c l u s i o nb o d y ，i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，o n - c o l u m n r e f o l d i n g ，e n z y m ek i n e t i c s 5 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已 经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：叠!日期： 关于学位论文使用授权声明 2 0 毋f 雩。 本人完全了解温州医学院有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将 学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权 将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇 编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 日期：2 1 堡：尘：i 里 学位论文作者签名： 嗽飞 导师签名： 温州医学院硕士学位论文 前言 b 内酰胺类抗生素( p 1 a c t a ma n t i b i o t i c s ) 由于抗菌作用强、抗菌谱广、毒 性低是目前临床抗感染治疗最普遍应用的一类抗生素，随着这类药物的广泛使用 ( 特别是滥用和误用) 以及致病菌的变迁，产生了病原菌对药物的耐药性问题， 而且耐药发生率相当高。细菌对p 内酰胺类抗生素耐药的机制有4 种：( 1 ) 产生使p 一 内酰胺类抗生素水解失活的酶( b 内酰胺酶，1 3 - 1 a c t a m s e ，b l a ) ；( 2 ) 青霉素结 合蛋白( p e n i c i l l i nb i n dp r o t e i n s ，p b p s ) 改变( 被修饰或获得新的细胞壁合成酶) ： ( 3 ) 经过特殊的药物泵排出；( 4 ) 进入细菌细胞的量减少( 允许抗生素进入的膜蛋 白通道丢失) 【i l 。其中产生d 内酰胺酶是革兰氏阳性菌对p 内酰胺类抗生素耐药 的主要原因。d 内酰胺酶是指能催化水解6 氨基青霉烷酸( 6 a p a ) 和7 - 氨基头孢烷 酸( 7 a c a ) 及其n 酰基衍生物分子中d 内酰胺环酰胺键的灭活酶( 如图l 所示) ， 即水解含有d 内酰胺环的青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和p 内酰胺酶抑制 剂类等b 内酰胺类抗生素。目前8 内酰胺酶的分类主要有两种方法：b u s h - m j 例 分类法和a m b l e r 【3 】分类法。前者根据b 内酰胺酶的功能相似性( 底物和抑制物轮 廓) 分为4 组，其中2 组和3 组又可分为许多亚组；后者根据酶的氨基酸序列的保 守性和相似性将p 内酰胺酶分为4 类，其中a 、c 、d 类在活性位点上都有丝氨酸， 故又称为活性位点丝氨酸酶，b 类是金属p 一内酰胺酶，它的活性依赖于z n 2 + 。 8 - 1 a c t a mr i n g ：t h e t a r g e t o fb l a c t a m a s e s 一4 t 0 一代 曼幽一! 厂弋 气减f b l a c t a mr i n go p e n e d b y 8 - 1 a c t a m a s e ：t h er e s u l t a n t p r o d u c ti sh a r m l e s st ot h eb a c t e r i a 图lp 一内酰胺酶对1 3 - 内酰胺环上酰胺键的水解作用 f i g u r e1 h y d r o l y t i cr e a c t i o no fp l a c t a m a s eo nt h ea m i d eb o n do ft h e1 3 - 1 a c t a mr i n g 超广谱d 内酰胺酶( e x t e n d e ds p e c t r u mb e t al a c t a m a s e s ，e s b l s ) 是由质粒介导 的p 一内酰胺酶基因( b l a ) 突变而形成的一类酶，主要产生于大肠埃希菌和克雷 伯菌属，能使第三代头孢菌素如头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和青霉素类及单 环酰胺类抗生素如氨曲南耐药，并被b l a 抑制剂如克拉维酸所抑制【4 j 。自1 9 8 3 年 在德国首次报道以来，世界各地e s b l s 在革兰阴性杆菌中的检出率也逐年升高 p j 。2 0 多年间，e s b l s 的亚型种类不断增加，至少包括3 8 7 种基因型。根据亚型编 6 温州医学院硕士学位论文 码基因同源性的不同分为t e m 型、s h v 型、o x a 型、c t x m 型和其他类，其中 以t e m 和s h v 型最多见，它们分别由广谱酶t e m 1 、t e m 2 和s h v 1 编码基 因中数个位点发生点突变而来。t e m 型约有1 5 5 种，s h v 型有9 1 种、o x a 型 8 8 种、c t x 型5 3 种【6 j ( h t t p ：w w w 1 a h e y o r e , s t u d i e s t e m t a b l e a s p ) 。由于d 内酰 胺类抗生素在医疗行业和畜禽业中的广泛应用，导致日常食用的牛奶，鱼肉类食 品和环境中都有该类抗生素残留，这不仅对人体产生伤害，如因进食含p 内酰胺 类抗生素的食品，人体肠道内的正常菌群受到抑制而导致致病菌、条件致病菌大 量繁殖的肠道菌群失调，而且会促进针对该类抗生素耐药菌的产生，使全球耐药 性问题更加严重。近年来，大肠埃希菌产e s b ls 菌株逐年增多，e s b l s 在菌株间 的转移和传播，使其耐药性成为突出问题。 而e s b l s 产生耐药的机制主要是b 内酰胺酶上的几个氨基酸发生了突变，其 活性中心的构象发生改变，使其作用底物谱发生变化。本课题从逆向思维方式着 手，目的在于将严重影响b 内酰胺类抗生素治疗效果的e s b l s 开发成为一种d 内 酰胺类抗生素清除剂。与p 内酰胺酶类抗生素合用时，使分泌到微生态环境的此 类抗生素在杀灭正常菌群前失去药效，从而起到保护正常菌群和防止耐药菌株产 生的作用。本研究旨在通过d n a 家族改组( d n af a m i l ys h u f f l i n g ) 这一定向进化 技术改变e s b l s 的活性，同时大肠杆菌是目前体外重组蛋白表达系统中应用最广 泛的表达宿主，具有遗传背景清楚、生产研究周期短、成本低、表达量高和易于 操作等优点，故利用原核表达载体在ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中高效表达经d n a 改组后 蛋白，建立了一种简便有效的复性纯化突变体酶的方法，并对纯化产物进行酶动 力学参数的测定，对改组前后酶特性的改变进行比较，这为研制新一代d 一内酰胺 类抗生素提供理论依据，也为把d 内酰胺酶开发成为抗生素清除剂打下了基础。 7 温州医学院硕士学位论文 第一部分t e m 型超广谱b 一内酰胺酶基因的d n a 家族改组研究 材料 1 1 菌株与质粒： 重组质粒p e t 2 8 a ( + ) 一b l a t e m i b l 2 1 、p e t 2 8 a ( + ) 一b l a t e m 2 b l 2 1 和p e t 2 8 a ( + ) 子一b l a t e m 3 b l 2 1 ；大肠杆菌( ec o l i ) 受体菌d h 5 c t 、表达菌b l 2 1 ( d e 3 ) ；标 准菌株大肠埃希菌( a t c c 2 5 9 2 2 ) ；表达载体p e t 2 8 a ( + ) ，其结构见图l l ；以上 均由温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室保存。 旦端删柏j 亟磊璧螋划立 肛 i ef c g at c c c p , , c g a a a t r a at a c g a cr c c ：- a t a g g g g a ar cf g a g c ： at a a c a a tt c c c c t ct a c a a t a a r t r t t t t a a c t t t a a 瓦4 c c 瓦 i hb-tmo凸睃!型塑!tt-t伽i t a t c c t c g c c a c c a c c ：a lc a ： ： c ar c a c a c c a c c c g c c t c ct b c c o c c c c c ： c c c r a ：c ct 0 c f c cr 0 g 0 c a c a g c 黯：岱l y s o r 5 r f h h h h j hj - s r s e r c l y t 口u v d i p r n r o y s # h i ，培t 1 4 s 口f 一t ：h r g l y o l y g l g t n e i 研 烹垦鲤划麟l 逝i锺i 削m塑l _ 麴l! 芝! 竺 at ：c 0 i c c c a l c c c a a lf c c cr c c c l “ c 比tr g c c ：c c c c ct c 二a c c a c c a c c a c c a c c a c c a c f “l c c g c c i g c l a a c a a g c c c 蛭1 - 2 毫口i i t 0 i y a r 够i y s e r g l u p l g 1 w l u a e q 。q g i a i y t g i y “口t h r r q i o # 1 r o p r o p r o p r o p r o l e u a r 9 3 s r 引v c y s e ，d ：一。g g - 1 c g ，g g a p p t c c ，。g 。a a 5 rl ：c 嚣嚣：；：；：兰竺譬：；晋i 瑟 笠二三器：篙：? ：；警。7 g c i 砭丽百i = j i 丽可 堑；i ! 釜i 錾! 茎；薹! ：堑；錾i 舞、c a ，a 铀g c 。i ：甓! ：簿翳：；：跨篆 ：i 琵；c c ，：i ； c ：器： i ：i 搿：g c ：馁：s ! ：p e ，- z e c t 叟堕堕i ! ：竺唑坚 c “越1 口 c “吖c c t g t c a c c g c t g a g c a | t a a c t 砧e at a a c c ：c c 豳盎c c f c , a a a c c g g t cr t g g 酝i t i t 亓记 号磊忑石磊i 丽硒 p e t - 2 8 a - c “) c l o n i n g e x p r e s s i o nr e g i o n 8 温州医学院硕士学位论文 图1 1p e t 2 8 a ( + ) 融合蛋白表达载体 f i g 1 - 1t h ev e c t o rm a po f p e t 2 8 a ( + ) 1 2 主要试剂 1 2 1 分子生物学相关试剂 限制性核酸内切酶n c oi 、x h oi 、t 4d n a l i g a s e 、d n a s ei ( r n a s ef r e e ) 、 r n a s ea 、p r o t e i nm a r k e r 、t a k a r at a q t m 、t a k a r ae xt a q 和p y r o b e s t d n a p o l y m e r a s e 以及d n am a r k e rd l 2 0 0 0 、d l l 5 0 0 0 均购自大连宝生物工程有限公 司；质粒小量抽提试剂盒、d n a 片段纯化试剂盒、d n a 胶回收试剂盒购自大连 宝生物工程有限公司；小分子量d n a 片段高效快速回收试剂盒购自北京博大泰 克生物基因技术有限责任公司；i p t g 购自华美生物工程公司；琼脂糖、溴化乙 啶、溴酚蓝等常用分子生物学试剂购自上海生工生物工程公司。扩增引物由大连 宝生物公司合成；其它试剂均为进口或国产分析纯。 1 2 2 抗生素 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ，a m p ) 和青霉素g 购自石家庄制药有限公司，头孢 他啶( c e f t a z i d i m e ，c a z ) 购自美国礼来公司，头孢曲松( c e f t r i a x o n e ，c r o ) 购 自上海罗氏制药有限公司，头孢唑啉( c e f a z o l i n ，c e z ) 购自潍坊三江医药化工 有限公司，头孢噻肟( c e f o t a x i m e ，c t x ) 购自齐鲁制药有限公司，头孢呋辛 ( c e f u r o x i m e ，c x m ) 购自深圳市制药厂。卡那霉素( k a n a m y c i n ，k a n ) 购自上 海普飞生物技术有限公司，n i t r o c e f i n 购自o x o i d i n c ，其余常用化学试剂购自 杭州华东医药股份有限公司分公司。 1 2 3 主要培养基 m h 液体和固体培养基购自杭州天和微生物试剂有限公司。 1 3 主要仪器 数显式电热恒温水浴锅( 上海跃进医疗器械厂) 紫外线透射仪w p 2 0 0 a ( 温州奥利生物医学仪器厂) h a n g p i n gf a 2 0 0 4 分析称量天平( 上海精科天平实业有限公司) h z q x 1 0 0 振荡培养箱( 哈尔滨东联电子技术开发有限公司) h z q - f x 全温振荡器( 哈尔滨东联电子技术开发有限公司) g z x d h 一4 0 0 一b s i i 电热恒温干燥箱( 上海贺德实验设备有限公司) y x q - l s 一5 0 si i 立式压力蒸汽灭菌器( 上海博建迅实业有限公司医疗设备厂) p y x - d h s - 4 0 0 一b s i i 隔水式电热恒温培养箱( 上海贺德实验设备有限公司) a 瓜t e c h 超净工作台( 苏净集团安泰公司) m y c y e l ep c r 仪( 美国b i o r a d 公司) m i c r o f a g e 2 2 r 型离心机( 美国b e c k m a nc o u l t e r ) 9 温州医学院硕士学位论文 d y y 5 型稳压稳流电泳仪( 北京六一仪器厂) 优普超纯水机( 优普公司) g e n eg e n i u s 生物成像系统( 英国s y n g e n e 公司) s a n y o 生物医学冷柜( 日本s a n y o 公司) t h e r m o 低温冰箱( 美国t 旺i 湖0 公司) p h s 3 c 精密p h 计( 上海雷磁仪器厂) 旋涡混合器x w 二8 0 a ( 江苏省金坛医疗仪器厂) 台式离心机t g l 1 6 g ( 上海安亭科学仪器厂) 1 4 主要试剂的配制 l b 液体培养基及固体培养基： 成分量 酵母提取物 胰蛋白胨 n a c l 5 9 1 0 9 1 0 9 加入约9 5 0 m l 双蒸水，用1 0 m n a o h 调p h 值至7 0 7 2 ，加双蒸水定容至 1 l ，1 5 p s i 高压1 2 1 灭菌2 0 分钟，置4 c 储存备用。在每升l b 液体培养基中 加入1 5 9 琼脂粉即为固体l b 培养基，经1 5 磅高压1 2 1 。c 灭菌2 0 分钟，置4 。c 储存备用。 琼脂糖凝胶电泳缓冲液( 5 0 t 短) ： 成分量 i r i s 2 4 2 9 冰乙酸5 7 1 m l o 5 m e d t a ( p h8 0 ) 10 0 m l 加蒸馏水定容至1 0 0 0 m l ，工作液稀释5 0 倍。 质粒提取所用溶液： 溶液i ： 成分 量 1m t r i s h c i ( p h8 0 ) o 5 m e d t a ( p h8 o ) 2 0 g l u c o s e 2 5 m l 2 0 m l 4 5 m l 加去离子水定容至1 0 0 0 m l ，4 。c 保存，使用前每5 0 m l 溶液i 中加入2 m l 的 r n a s ea ( 2 0 m g m 1 ) 。 溶液i i ：0 2 m n a o h ，i s d s ( 临用前配) 溶液i ： 1 0 温州医学院硕士学位论文 成分量 乙酸钾 冰乙酸 d d h 2 0 1 4 7 9 5 7 5 m l u p t o5 0 0 m l 高温高压灭菌后，4 c 保存。 t e 缓冲液( p h8 0 ) ：1 0 m m t r i s - h c i ，l m m e d t a ( p h 8 0 ) s t e 缓冲液( p h8 0 ) ：o 1 m n a c l ，1 0 m m t r i s h c i ，l m m e d t a ( p h 8 0 ) 2 5 c 下不同p h 值0 1 m o l l 磷酸钠缓冲液 注：根据i s c o ( 1 9 8 2 ) 的资料汇编 用蒸馏水将混合的两种1 m o l l 贮存液稀释至1 0 0 0m l ，根据 h e n d e r s o n h a s s e l b a l c h 方程计算其p h 值： p h = p k ，+ j 0 9 ( 质子受体质子供体) 在此，p k - - 6 8 6 ( 2 5 ) d n a 家族改组所用试剂： ( 1 ) 1 5 0 m m o l l n a c l 的配制：0 8 7 9 n a c l 溶入1 0 0 m l 双蒸水中。 ( 2 ) d n a s ei 消化缓冲液配制：4 0 0 m m t f i s h c i ，p h 7 5 ，8 0 m m m g c l 2 ，5 0 m md t t 。 ( 3 ) o 1 u p l 的d n a s ei 的配制：1 1 1 1 ( 5 u t 1 ) 的d n a s ei 溶于4 9 p 11 5 0 m m o l l n a c i 中，2 0 保存备用。 方法 2 1d n a 家族改组的设计思路 为进一步提高t e m 型p 一内酰胺酶水解抗生素的能力，本研究设计了以三种 t e m 型d 一内酰胺酶基因为模板的d n a 家族改组的体外分子定向进化实验( 见 图1 - 2 ) ，分别在基因的两端加上了在t e m 型p 内酰胺酶基因中不存在，而在 p e t 2 8 a ( + ) 载体上的限制性酶切位点n c oi 和x h oi ，以便于基因的克隆和表达 载体的构建。本研究采用的定向进化策略是以m n 2 + 为d n a s ei 的辅因子进行 d n a 家族改组，这个实验方案的优点是突变频率低且可以快速积累有益突变， 温州医学院硕士学位论文 从而实现酶特性的快速进化。 _ o 一 具有同源序列的 卜一 亲本基因 一) _ 一 l i d n a s ei 随机片断化 二! i 三三消化的小片断 啡一7 月化删j 、斤断 _ 一一一1 卜一 _ | 卜一卜 l省苗霎器磊莩耄 n c oi 和踟i 双i 酶切和回收纯化1 i _ i 卜 卜一 电卜卜突变体的基因库 i 渤l 和劢dl 双酶切和回收纯化 重组的突变质粒库 j 一 性能改善的突变体 图1 2d n a 家族改组构建突变文库 f i g1 - 2t h ec o n s t r u c t i o no fm u t a n tl i b r a r yo fd n as h