（临床检验诊断学专业论文）人egfil18融合蛋白的表达纯化及实验室中试.pdf

温州医学院硕士学位论文 人e g f i l 18 融合蛋白的表达纯化及实验室中试 中文摘要 目的： 构建e g f i l 一1 8 融合基因的原核表达载体，分离纯化有活性的e g f i l 18 融合蛋白，使用发酵技术大量培养工程菌，得到大量重组e g f i l 18 融合蛋白， 为进一步研究其体外和动物体内的生物学作用奠定基础。 方法： i e g f i l 一1 8 融合蛋白原核表达载体的构建和表达采用p c r 方法，以质粒 p f u s e g f i l 一1 8 为模板，扩增e g f i l 1 8 融合基因，并将其分别亚克隆入原 核表达质粒p e t l 2 a ( + ) 、p e t 2 6 b ( + ) ，构建二种表达载体p e t l 2 a ( + ) e g f i l 1 8 、p e t 2 6 b ( + ) - e g f - i l 一1 8 ，限制性内切酶双酶切和测序鉴定质粒构建是否正 确。将二种表达质粒转化e e o l ir o s e t t a ( d e 3 ) ，i p t g 诱导其表达，s d s p a g e 和免疫印迹分析表达产物。 2 e g f i l 一1 8 融合蛋白包涵体的复性及纯化分离e g f i l 1 8 融合蛋白包涵体， 并用2m 尿素和1 t r i t o nx 1 0 0 反复洗涤。以8m 尿素溶解包涵体，将包涵 体裂解液上样于弱阴离子交换柱d e a e s f f ，进行柱上复柱，复性产物进一 步用分子筛s e p h a d e xg 7 5 纯化。 3 体外实验检测e g f i l 1 8 融合蛋白的初步生物学活性将纯化的e g f i l 1 8 融合蛋白复性纯化产物与人外周血单个核细胞( p b m c ) 共培养2 4h ，e l i s a 法检测培养上清中i f n 吖的分泌水平来初步评价e g f i l 18 融合蛋白的复性 效果和生物学活性。 4 利用发酵技术大量培养工程菌分别运用l b 培养基、半合成培养基和合成培 养基对工程菌进行发酵培养，并运用b i o f l o 发酵系统对发酵条件经行监控 和优化。 结果： 1 原核表达载体的构建和表达双酶切分析以及测序结果表明原核表达载体 p e t l 2 a ( + ) - e g f - i l 一1 8 、p e t 2 6 b ( + ) 一e g f i l 一1 8 与设计相符；工程菌e c o l i r o s e t t a ( d e 3 ) p e t l 2 a ( + ) e g f i l 一1 8 诱导表达后在分子量为2 1 k d a 处可产生特 异的表达条带，并能够被抗人i l 1 8 单克隆抗体所识别。工程菌e c o l i r o s e t t a ( d e 3 ) p e t l 2 a ( + ) 一e g f i l 1 8 诱导表达后在分子量为2 1 k d a 处可产生特 异的表达条带，并能够被抗人i l 1 8 单克隆抗体所识别，与预期一致。 2 温州医学院硕士学位论文 2 e g f i l 1 8 融合蛋白包涵体的复性及纯化变性的e g f i l 1 8 融合蛋白包涵体 经阴离子交换层析柱d e a e s f f 柱上复性和凝胶过滤层析s e p h a d e xg 7 5 进一 步纯化后纯度达9 5 。 3 体外实验检测e g f i l 1 8 融合蛋白的初步生物学活性 i f n - q , e l i s a 结果显 示，e g f i l 1 8 融合蛋白具有明显地诱导k g 1 细胞产生i f n - q 的能力，但活 性低于标准m e t l l 1 8 。 4 利用发酵技术大量培养工程菌通过发酵培养，普通l b 培养基发酵可以一次 性得到6 6 6 9 菌和l o 5 9 包涵体；半合成培养基可以一次性得到1 9 8 2 9 菌和 2 9 4 9 包涵体；而合成培养基发酵运用补料技术可以一次性得到4 8 2 9 菌和 9 0 5 9 包涵体。 结论： 我们成功构建原核表达载体p e t l 2 a ( + ) - e g f - i l - 1 8 和p e t 2 6 b ( + ) 一e g f - i l - 1 8 ， 分离纯化获得了具有天然n 端的、有活性的e g f i l 1 8 融合蛋白，同时建立了 一套发酵e g f i l 1 8 融合蛋白的条件，为进一步研究融合蛋白的体内外生物作用 及其工业化生产奠定基础。 关键词： 白介素1 8 ；表皮生长因子受体；融合蛋白；原核表达；包涵体；复性；肿瘤 靶向性；发酵 温州医学院硕士学位论文 e x ，p u r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i ,s t u d yo fegft三xpresslon p u r i t l c a t i o na n dt e r m e n t a t i o ns t u d yo ie g f i l 18 ，1 l l8 i u s l o np r o t e i ni n 也c o l i c t a bs t r a c t o b j e c t i v e t oc o n s t r u e ta p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rf o re g f i l - 18f u s i o ng e n ea n di s o l a t e a n dp u r i f i c a t ea c t i v ee g f i l - 18f u s i o np r o t e i ni ne c o l i u s i n gf e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g y c u l t i v a t i n gal a r g en u m b e ro fc e l l sa n da c c e s sr e c o m b i n a n te g f i l 18f u s i o np r o t e i n 。 a n dp r e l i m i n a r i l ye v a l u a t i n gt h eb i o l o g i c a la c t i v i t i e so fe g f i l 18f u s i o np r o t e i ni n v i t r oa n di nv i v of o rf u r t h e rs t u d y m e t h o d s 1 t h ec o n s t r u c t i o na n d e x p r e s s i o no fe g f i l 一1 8p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r ： t h eg e n ef r a g m e n to fe g f - i l - 18w a sa m p l i f i e db yp c r u s i n gp f u s - e g f - i l - l8a s t e m p l a t e ，a n dt h e nw a si n s e r t e di n t op e t 12 a ( + ) a n dp e t 2 6 b ( + ) t oc o n s t r u c tt h e p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t l2 a ( + ) - e g f - i l 一18a n dp e t 2 6 b ( + ) - e g f i l l 8 r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ed i g e s t i o na n ds e q u e n c i n gw a sc o m p l e t e dt ov e r i f yt h e p l a s m i dw a sc o n s t r u c t e dc o r r e c t l y t h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rw a s t r a n s f o r m e di n t oe c o l ir o s e t t a ( d e 3 ) a n di n d u c e dt oe x p r e s sb yi p t g t h e nu s e s d s - p a g ea n dw e s t e r nb l o tt oa n a l y s i st h ee x p r e s s i o n 2 t h er e f o l d e da n dp u r i f i c a t i o no fe g f - i l 一1 8f u s i o np r o t e i ni n c l u s i o n st h ee g f i l - 18i n c l u s i o nb o d yw a sw a s h e db y2m o l lu r e aa n dl t r i t o nx - 10 0r e p e a t e d l y a n dd i s s o l v e di n8m o l lu r e a t h ed e n a t u r e de g f i l 18w a s1 0 a d e do n t ot h ei o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yd e a e - s f fc o l u m na n dr e f o l d e dd u r i n gal i n e a r 8 - 2 m o l lu r e ag i a d i e n ta tf l o wr a t eo f0 6m l m i n f u r t h e r m o r e ，t h er e f o l d e ds a m p l ew a s p u r i f i e d 、加mg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h ys e p h a d e xg 一7 5 3 e v a l u a t i o nt h ea c t i v i t yo fe g f - i l 一1 8f u s i o np r o t e i ni nv i t r o ：c u l t i v a t i o no ft h e e g f - i l - - 18f u s i o np r o t e i nr e f o l d i n gp u r i f i e dp r o d u c tw i t hh u m a np e r i p h e r a lb l o o d m o n o n u c l e a rc e l l s ( p b m c ) f o r2 4h ，w et e s t e dt h el e v e lo fi f n - yi nt h es u p e r n a t a n t b ye l i s at oe v a l u a t et h el e v e lo fi l e g f - 18f u s i o np r o t e i na n di t sb i o l o g i c a l a c t i v i t y 4 u s i n gf e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yc u l t i v a t i n gal a r g en u m b e ro fe n g i n e e r i n g b a c t e r i ar e s p e c t i v e l yu s i n gl bm e d i u m ，s e m i - s y n t h e t i ca n ds y n t h e t i cm e d i u m m e d i u mt of e r m e n tc u l t u r ee n g i n e e r i n gb a c t e r i a ，u s i n gt h eb i o f l of e r m e t i t a t i o n s y s t e mt om o n i t o ra n do p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 4 r e s u l t s 1 t h ec o n s t r u c t i o na n de x p r e s s i o no fe g f - i l 一18p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r ： t h ep l a s m i dp e t12 a ( + ) - e g f i l 18a n dp e t 2 6 b ( + ) 一e g f i l 一18p r o v e dt ob er i g h t t h r o u g hs e q u e n c i n ga n dd o u b l e e n z y m ed i g e s t i o n t h et a r g e tp r o t e i nw i t hm o l e c u l a r s i z e2 1k d aw a sh i g h l ye x p r e s s e di n e c o l ir o s e t t a ( d e 3 ) p e t l 2 a ( + ) e g f i l 1 8 a n dc a nb ei d e n t i f i e db ya n t i - i l - 18m o n o c l o n a la n t i b o d y , j u s ta se x p e c t e d 2 t h er e f o l d e da n d p u r i f i c a t i o no fe g f i l 1 8f u s i o np r o t e i ni n c l u s i o n st h ee g f i l 一18f u s i o np r o t e i nw a sr e c o v e r e da n dp u r i f i e df r o mt h ei n c l u s i o nb o d i e su s i n gi o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h ys e p h a d e xg 7 5 ，t h e p u r i t yc a i lr e a c h9 5 a f t e rf u , r t h e rp u r i f i c a t i o n 3 e v a l u a t i o nt h ea c t i v i t yo fe g f - i l 一1 8f u s i o n p r o t e i ni nv i t r oi f n - y i n d u c i n g a c t i v i t yo fe g f - i l 一18f u s i o np r o t e i n ( w i t h o u tt a g s ) w a sd e m o n s t r a t e du s i n ga e l i s ak i t w ef o u n dt h a te g f - i l 18f u s i o np r o t e i nc o u l di n d u c et h ee x p r e s s i o no f i f n 吖i nk g l ，t h o u g hc o m p a r e dt os t a n d a r dm e t l l 18t h ea c t i v i t yw a sl o w e r 4 u s i n gf e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yc u l t i v a t i n gal a r g en u m b e ro fe n g i n e e r i n g b a c t e r i a sw e g o t6 6 6 9e n g i n e e r i n gb a c t e r i aa n d10 5 9i n c l u s i o nb o d i e sb yo r d i n a r y l bm e d i u mf e r m e n t a t i o n ，19 8 2 9e n g i n e e r i n gb a c t e r i a sa n d2 9 4 9i n c l u s i o nb o d i e s b ys e m i - s y n t h e t i cm e d i u mf e r m e n t a t i o n ，a n d4 8 2 9e n g i n e e r i n gb a c t e r i a sa n d9 0 5 9 i n c l u s i o nb o d i e sb ys y n t h e t i cm e d i u mf e r m e n t a t i o n c o n c l u s i o n w ec o n s t r u c t e dt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t 12 a ( + ) - e g f i l 一18a n d p e t 2 6 b ( + ) - e g f - i l - 18s u c c e s s f u l l ya n dh a r v e s t e da c t i v ee g f i l 18f u s i o np r o t e i n h a r b o r i n ga u t h e n t i cn t e r m i n a l m e a n w h i l e ，w ee s t a b l i s h e das e r i e so fm e t h o d sa n d p r o t o c o l sf o rr e f o l d i n ga n dp u r i f i c a t i o no fe g f i l - 18f u s i o np r o t e i ni n c l u s i o nb o d y a n dl a yas o l i df o u n d a t i o nf o rd e t a i l e de v a l u a t i o no fb i o a c t i v i t i e so fe g f - i l 18i n v i t r oa n di nv i v oa sw e l la sf o ri t sm a s sp r o d u c t i o n k e y w o r d s i n t e r l e u k i n - 18 ；二e p i d e r m a l g r o w t hf a c t o rr e c e p t o r ；f u s i o np r o t e i n ；p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n ；i n c l u s i o nb o d y ；r e f o l d i n g ；t u m o rt a r g e t i n g ，f e r m e n t a t i o n 5 温州医学院硕士学位论文 英文缩写词表 氨基酸缩写 代码 英文简写英文全称 中文全称 7 5 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已 经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中作了明确说明并表示谢意。 关于学位论文使用授权声明 本人完全了解温州医学院有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将 学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权 将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇 编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 日期：趟：型 学位论文作者签名：垒兰少争 1 日期：垫竺翌! 梦 导师签名： 温州医学院硕士学位论文 j - l 月u舌 恶性肿瘤是威胁人类的常见病，也是现在仅次于心血管系统疾病的死亡原 因，而且还有逐年上升的趋势，因此癌症的治疗始终是人们十分重视的课题。传 统的放、化疗存在抗肿瘤能力低、杀伤指数过小、副作用大等一系列缺点。为了 增加疗效减少毒性，人们提出介入治疗和定向放疗的方法，希望能以此达到特异 性杀灭癌组织的目的，但由于肿瘤的一些微小转移灶难以被检测到，这种物理学 方法对肿瘤的靶向治疗非常有限。近年，针对某些受体、基因或关键物质的靶向 治疗药物正在成为药物研制的重要方向。这类药物主要靶向作用于相关的肿瘤细 胞上，一方面提高对肿瘤细胞的杀伤力，另一方面减少对正常组织细胞的不良作 用。靶向治疗药物正在使肿瘤内科治疗从姑息性治疗向根治过渡，其最大优势就 在于针对性强、效果显著，在杀伤癌细胞时基本上不损伤正常组织，被认为是未 来癌症治疗中最具前景的研究方向。 白细胞介素1 8 ( i n t e r l e u k i n - 1 8 ，i l 1 8 ) 又称为i f n - 7 诱导因子，于1 9 9 6 年 由u s h i o 等克隆，其前体含1 9 3 个氨基酸，成熟肽为1 5 7 个氨基酸，以单体形式 发挥作用【1 3 】。其主要生物学活性是诱导t 细胞产生i f n - 7 ，促进t 细胞和n k 细 胞增殖活化以及促进f a s 配体表达，抑制血管生成等【4 - 。i l - 1 8 诱导i f n 吖的能 力以及诱导c t l 细胞生长的能力均强于i l 1 2 ，并与i l 1 2 有协同效应捧】。动物 实验表明，i l 1 8 具有明显的抗肿瘤作用，这一作用通过诱导小鼠体内的n k 细 胞和c d 8 + t 细胞的细胞毒活性而间接发挥1 1 。因此，i l 18 在肿瘤生物治疗方 面具有潜在的应用前景。但由于i l 1 8 的效应细胞孔1 和n k 细胞广泛分布于 人体各部位，容易激发炎症反应，产生副作用。因此，需要一种导向序列来加强 i l 1 8 对肿瘤细胞的靶向性，即如何使细胞因子在体内定向地作用于肿瘤细胞。 另一方面，表皮生长因子( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，e g f ) 受体( e g fr e c e p t o r ，e g f r ) 是跨膜受体酪氨酸激酶，介导e g f 等生长因子的生物效应【1 2 1 ，其功能失调与几 乎所有癌细胞关键特征诸如自发性生长、侵蚀性、促血管生成和远距离转移等的 出现有关【1 3 】1 3 ，约三分之一的人类肿瘤细胞中可检测到e g f r 的过表达，这与患 者对放化疗的敏感性及预后直接相关【1 4 l 。研究结果表明，e g f r 配体的第三个环 状结构保守基序( c 1 0 0 p ) 可特异性结合肿瘤细胞表面的e g f r 但并无活化 e g f r 的功能，即可干扰e g f r 介导的肿瘤细胞的刺激效应，被称为e g f 受体 干扰基序【1 5 - 1 7 1 。如果融合e g f 受体干扰基序和i l 1 8 成熟肽分子，能够得到一个 具有肿瘤细胞靶向性和抗肿瘤效应的多功能融合蛋白，而且融合蛋白特异性的靶 向作用可减少i l 1 8 在肿瘤治疗中的负反应。 6 温州医学院硕士学位论文 大肠杆菌是目前体外重组蛋白表达系统中应用最广泛的表达宿主，具有遗传 背景清楚、生产研究周期短、成本低、表达量高和易于操作等优点。本实验室前 期研究中，已经将e g f 4 l 1 8 融合蛋白从可行性论证【1 8 】、基因克隆、昆虫细胞中 的表达及活性检测【1 9 2 0 1 、原核细胞中的表达纯化复性及体内外活性鉴定跳2 2 1 。本 课题中，我们利用原核表达载体在大肠杆菌中高效表达了e g f i l 1 8 融合蛋白； 区别于师兄表达的t r x a e g f i l 1 8 ，我们去掉了礅a r a g + h i s t a g + s t a g 片段， 而只保留了e g f i l 1 8 的目的蛋白区域，因为m a r a g + h i s m g + s t a g 片段在蛋 白纯化后还是要用肠激酶酶切，需要进一步纯化也不利于扩大规模生产；理论上 我们表达的融合蛋白直接就有天然的n 端，但是因为没有了h i s t a g 标签。为我 们的蛋白纯化工作带来了一定的困难。从表达包涵体中，我们通过阴离子交换柱 层析d e a e s f f 和凝胶过滤层析s e p h a d e xg 7 5 等多步纯化，同时简便有效地复 性了纯化的e g f i l 1 8 融合蛋白，就获得了具有天然n 端的e g f i l 1 8 融合蛋 白，并对纯化产物进行了免疫印迹及初步的生物学活性鉴定：运用发酵工艺，我 们可以把工程菌的密度培养到o d 6 0 0 值大于3 0 ，每升发酵液可以得到大约5 0 克 菌体和8 克的包涵体。大量制备的包涵体蛋白，为进一步开展e g f i l 1 8 的动物 实验及融合蛋白的工业化生产打下了坚实的基础。 7 温州医学院硕士学位论文 第一部分e g f i l - 1 8 融合基因序列分析及其在p e t - 1 2a ( + ) e c o l i r o s e t t a ( d e 3 ) 系统中的表达 材料与方法 材料 一、菌株及质粒 p f u s - e g f i l - 1 8 ：由孟哲峰硕士构建，内含e g f 受体干扰序列连接区白介 素1 8 ( 下简称e g f i l 1 8 ) 的基因。p m d l 8 ts i m p l e ：t a 克隆载体，购自 t a k a r a 公司。p e t l 2 a ( + ) ，p e t 2 6 b ( + ) ：购自美国n o v a g e n 公司，质粒图谱见图 1 - 1 ，图1 - 2 。菌株ec o l id h 一5 t z 、b l 2 1 ( d e 3 ) 、r o s e t t a ( d e 3 ) 、r o s e t t a g a m i ( d e 3 ) 由本实验室保存。 图1 - 1p e t l 2 a ( + ) 融合蛋白表达载体 f i g 1 1v e c t o rm a po fp e t l 2 a ( + ) 8 温州医学院硕士学位论文 图1 1p e t 2 6 b ( + ) 表达载体 f i g 1 2v e c t o rm a po fp e t 2 6 b ( + ) 二、抗体 鼠抗人i l 一18 单克抗隆抗体购自m b l 公司，h r p - c o n j u g a t e dg o a ta n t i - m o u s e i g g 购于珠海百奥公司。 三、主要试剂及材料 限制性内切酶b a m hi 、n d ei 、p y r o b e s t 回d n a 聚合酶、t 4d n a 连接酶，质 粒小量抽提试剂盒、p c r 产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒购于大连宝生物工程有 限公司。核酸分子量标准、预染蛋白质分子量标准购自f e r m e n t a s 公司。标 准m e t l l 1 8 、鼠抗人i l 1 8 单克抗隆抗体购自m b l 公司，e c l 发光试剂盒购自 珠海百奥公司。r n a 酶购自r o c h e 公司，i p t g 购于大连宝生物工程有限公司： p v d f 膜为美国b i o r a d 产品。其他所用化学试剂均为国产分析纯。 9 温州医学院硕士学位论文 四、主要溶液及培养基的配制 l b 培养液及培养基： 成分量 胰蛋白胨 酵母提取物 n a c l 1 0g 5g 1 0g 加双蒸水至9 5 0m l ，用2 mn a o h 调p h 值至7 0 7 2 ，1 2 1 高压灭菌2 0 3 0 m i n ，置4 c 储存备用。在每升l b 液体中加入1 5g 琼脂粉即为固体l b 培养基， 经1 2 1 高压灭菌2 0 3 0r a i n ，置4 c 储存备用。 琼脂糖凝胶电泳缓冲液( 5 0 x t a e ) 成分 量 t r i s2 4 2g 冰乙酸 5 7 1m l 0 5 me d t a ( p h8 o )10 0m l 加蒸馏水定容至1 l ，工作液稀释5 0 倍； 质粒小提： 溶液i ：5 0m m 葡萄糖，2 5m mt r i s - h c i ( p h8 o ) ，1 0m l v le d t a ( p h8 0 ) 溶液i i ：0 2m n a o h ，1 s d s 溶液i i i ：6 0m l5 m 乙酸钾，1 1 5m l 冰乙酸，2 8 5m l 蒸馏水 t e 缓冲液( p h 8 o ) ：1 0m mt r i s - h c l ，1m me d t a ( p h8 o ) s d s p a g e 电泳与免疫印迹的主要溶液 1 5 mt r i s ( p h8 8 ) 2 0 0 m l - 称量 i r i s3 6 3 4 9 ，加蒸馏水1 6 0 m l ，用h c i 调p h 至8 8 ，加水定容至2 0 0m l ，置4 储存备用。 1 0 mt r i s ( p h6 8 ) 2 0 0 m l ：称量强s2 4 2 2g ，加蒸馏水1 6 0 m l ，用h c l 调p h 至 6 8 ，加水定容至2 0 0m l ，置4 c 储存备用。 1 0 s d s ( m v ) ：取s d s1 0g ，加蒸馏水9 0m l ，加热至6 8 助溶，用i q c 调p h 至7 2 ，定容至1 0 0m l 。 1 0 a p ( m v ) ：取o 1 9 过硫酸铵，加蒸馏水定容至1 血，于4 c 保存备用。 0 3 0 a c r b i s 母液( ，矶) ：称取b i s5g ，a r c y l a m i d e1 4 5g 于5 0 0 m l 烧杯中，加入 l o 温州医学院硕士学位论文 3 0 0m l 蒸馏水，于3 7 。c 充分搅拌溶解。加去离子水定容至5 0 0m l ，用0 4 5 1 t m 滤 纸过滤后4 避光保存。 0 1 2 分离胶1 0m l ： 0 5 聚合胶2m 1 - 0 5 x 蛋白上样缓冲液1 0 成分 量 d d h 2 0 3 0 a c 以i s 1 5 mt r i s ( p h 8 。8 ) l o s d s l o a p t e m e d 3 3m l 4 0m l 2 ，5 m l 0 1 m l 0 1 m l 0 0 0 4 m l 成分 量 d d h 2 0 3 0 a c r b i s 1 0 mt r i s ( p h 6 8 ) 1 0 s d s 1 0 a p 1 4 m l 0 3 3 m l o 2 5m 1 0 0 2 m l 0 0 2 m l t e m e do 0 0 2 m l 1mr if f s h c i ( 1 0 h6 8 ) 2 m e 溴酚兰 甘油 s d s 2 5m l 0 5 m l 0 0 5g 5m l 1 0g 加蒸馏水至1 0m l 。室温保存，2 - m e 临用前加。 考马斯亮蓝染色液1 0 0m 1 成分 量 甲醇 2 5m l 蒸馏水 6 5 m l 冰乙酸 1 0m l 称取考马斯亮蓝r 2 5 00 1 9 溶解，过滤除去杂质。 温州医学院硕士学位论文 考马斯亮蓝脱色液1 l ： 成分量 乙醇 冰乙酸 蒸馏水 5 0m l 1 0 0 m l 8 5 0m l 充分混合后使用。 s d s p a g e 电泳缓冲液1l ： 膜转移缓冲液： t b s 缓冲液1 l - 成分量 嘶s 甘氨酸 s d s 3 0 2g 1 8 8 9 1 9 充分溶于去离子水并定容至1 l 。 成分量 s 甘氨酸 s d s 甲醇 5 8g 2 9 9 o 3 7 9 2 0 0 m l 用去离子水定容至1 l ，试问保存。 成分 量 1 m i r i s h c l ( p h 8 0 ) 2 0m l n a c l 8 8 9 用去离子水溶解并定容至1 l 。 5 脱脂奶粉： 取5g 脱脂奶粉，溶于1 0 0m l t b s ( p h 7 4 ) 。 t b s t 缓冲液： 加0 5 m l t w e e n2 0 于1 l t b s 缓冲液中充分混匀。 1 2 温州医学院硕士学位论文 五、主要仪器 a i rt e c h 超净工作台( 苏净集团安泰公司) m y c y c l ep c r 仪( 美国b i o r a d 公司) m i c r o f a g e2 2 r 型离心机( 美国b e c k m a nc o u l t e r ) d y v 5 型稳压稳流电泳仪( 北京六一仪器厂) h a n g p i n gf a l 2 0 0 4 分析( 称量) 天平( 上海精科天平实业有限公司) 优普超纯水机( 优普公司) 蛋白电泳及电转移系统( 美国b i o r a d 公司) j y 9 2 2 d 型超声波细胞粉碎机( 宁波新芝生物科技股份有限公司) h z q x 1 0 0 振荡培养箱( 哈尔滨东联电子技术开发有限公司) g e n eg e n i u s 生物成像系统( 英国s y n g e n e 公司) d u 8 0 0 核酸蛋白分析仪( 美国b e c k m a nc o u l t e r ) s a n y o 生物医学冷柜( 日本s a n y o 公司) 方法 一、目的基因e g f i l 1 8 的获得 ( 一) 引物设计与合成 根据e g f i l 1 8 基因序列，用p r i m e r 5 0 ，设计一对特异性引物：上游引物 p 1：5 - c g c 垡墅0 蔓c i ：g c t g c t c c c a t g 一3 ：下游引物 p 2 ：5 - c g c g c t c a g c c t a g t c t t c a 【 t t t g 37 。p 1 、p 2 的5 端分别包含了b a m hi 、 n d ei 两个限制性内切酶酶切位点并在酶切位点前加了3 个保护性碱基。引物由 上海生工合成。用无菌去离子水将引物溶解，储存浓度为1 0 0 肛m o l l ，使用浓度 为2 0p m o l l 。 ( 二) 高保真p c r 反应 p c r 反应体系： r e a g e n t sv o l u m e g d ) d n t p ( 2 5m m ) p y r o b e s td n a 聚合酶( 5u u1 ) p f u s e g f i l - 18 质粒模板 上游引物 下游引物 10 x b u f f e r ( p l u sm 旷+ ) d d h 2 0 1 1 1 2 2 5 3 8 t o t a l5 0 p c r 反应条件如下：9 4 5m i n ；9 4 3 08 e c ，6 0 3 0s e c ，7 2 6 0s e e ， 温州医学院硕士学位论文 3 5 个循环；7 2 5m i n ，4 保存。取5 肛l 产物以1 5 的a g a r o s e 凝胶电泳鉴 定。 ( 三) p c r 产物加a 反应 在上述p c r 反应产物中按每5 0p 1 加入5u 的比例加入e xt a q 聚合酶， 7 2 1 0m i n 。 ( 四) 目的基因e g f i l 1 8 的纯化回收 加a 反应产物用p c r 产物纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的t e 或d d h 2 0 溶解洗脱备用。 ( 五) 目的基因片段与p m d l 8 一ts i m p l e 载体连接 按t a k a r a 公司的p m d l 8 ts i m p l ev e c t o r 试剂盒说明书进行t 载体与目的 基因的连接。连接反应体系： r e a g e n t sv o l u m e ( i x l ) p m d 18 一ts i m p l ev e c t o r e g f i l 1 8 回收产物 d d h 2 0 l i g a t i o ns o l u t i o n t o t a ll o 连接反应于1 6 过夜。 ( 六) 转化 l 、大肠杆菌d h 5 a 感受态细胞的制备( 一步法) ： ( 1 ) 将7 0 。c 冻存的d h 5 a 接种于约2 - - 3 m l 的l b 液体培养基中，3 7 。c ，2 0 0 r p m ，振荡培养过夜。 ( 2 ) 将振荡培养过夜的细菌5 0 0 “l 加入含有5 0m ll b 液体培养基的三角烧瓶 中，振荡培养2h - - 3 h 。 ( 3 ) 将菌液移入冰预冷的5 0 “聚丙烯管中，冰上放置1 0m i n 。 ( 4 ) 4 。c ，4 , 0 0 0r p m 离心1 0m i n ，弃上清，收集菌体。 ( 5 ) 用2m l 冰预冷的t s s 重悬沉淀，分装( 2 0 0l x l 每管) 。直接用于转化或加 入1 5 甘油，放于- 7 0 冻存。 2 、连接反应产物的转化 ( 1 ) 取2 0 0i x l 感受态细菌，加入上述连接产物，轻轻摇匀，冰浴3 0m i n 。 ( 2 ) 4 2 热休克9 0 1 2 0 秒_ 冰浴3 5m i n 。 ( 3 ) 加8 0 0p il b 液体培养基，摇匀，3 7 。c1 0 0r p m 振荡培养1 小时。 ( 4 ) 分别用l b 液体培养基稀释1 0 倍、1 0 0 倍，并各取0 3 m 1 分别涂于预温的 l ba m p + 的平板上。 1 4 温州医学院硕士学位论文 ( 5 ) 待菌液完全吸收后，倒置培养皿，3 7 c 过夜。 ( 七) 重组克隆p m d l 8 t e g f i l 1 8 的双酶切和目的片段e g f i l 1 8 的回收 l 、碱裂解法小量质粒d n a 的制备( 按分子克隆中的方法进行) ( 1 ) 用接种环从l ba m p + 平板上随机挑选几个白色单个菌洛，接种于新鲜的 l b 液体培养基中，1 0 0 1 5 0r p m ，3 7 过夜。 ( 2 ) 取1 5n d 过夜培养菌液加入e p 管中，4 ，1 0 ，0 0 0r p m x lm i n 离心，尽弃 上清。 ( 3 ) 加入1 0 0r t l 溶液i 剧烈振荡，悬浮沉淀。 ( 4 ) 加入2 0 0 山溶液i i 轻轻颠倒几次，冰上放置3 5m i n 。 ( 5 ) 加入1 5 0m 溶液i i i 轻轻颠倒几次，混匀，5 1 0m i n 。 ( 6 ) 4 ，1 2 0 0 0r p m x l 0m i n 离心，将上清移入另一e p 管，加等体积的饱和 酚：氯仿，上下颠倒混匀。 ( 7 ) 4 ，1 2 0 0 0r p m 1 0m i n 离心( 酚、氯仿抽提这一过程可反复几次) 。 ( 8 ) 将上清移入另一e p 管中，加入2 倍体积的无水乙醇，混匀，一2 0 。c ，3 0 m i n 。 ( 9 ) 4 ，1 2 0 0 0r p m 1 5m i n 离心，弃上清，7 0 乙醇洗涤两次。 ( 1 0 ) 4 ，1 2 0 0 0r p m x l 5m i n 离心弃上清，室温干燥3 0m i n ，使乙醇挥发干。 加适量的t e 或d d h 2 0 溶解备用。 2 、p m d l 8 t e g f i l 1 8 质粒的双酶切和目的片段e g f i l - 1 8 的回收 随机挑取转化平板上的白色单个菌落接种于3m ll ba m p + 夜体培养基中， 3 7 c 培养过夜。按上述碱裂解法提取质粒，然后进行双酶切，其反应体系如下： r e a g e n t sv o l u m e ( i d ) p m d 18 t - - e g f - i l 18 b a m hi ( 1 0 u # a ) n d ei ( 1 0 u i d ) 1 0 x b u f f e r d d h 2 0 2 0 1 1 5 2 3 t o t a l5 0 3 7 ，酶切2 小时。 目的片段e g f i l