（临床兽医学专业论文）利用小鼠mi期卵母细胞获取孤雌胚胎的研究.pdf

两南大学硕十学位论文摘要 利用小鼠m i 期卵母细胞获取 孤雌胚胎的研究 临床兽医专业硕士研究生：慈书峰 指导老师：李跃民教授 摘要 目前对孤雌发育的研究多使用m i i 期卵母细胞，得到的孤雌胚胎多为单倍体。利用细胞 松弛素d ( c d ) 抑制小鼠m l 期卵母细胞排出第一极体可以保持染色体组的倍性。尽管由于 基因印记的缘故，这样做并不能使孤雌胚胎发育到期，但是却可以给孤雌胚胎细胞提供一个 更加丰富的遗传背景。国外研究表明，从这样的孤雌囊胚中可以分离得到与卵母细胞供体的 m h c 相匹配的孤雌干细胞。本研究从激活方法和培养液的选择方面对利用c d 处理获取二倍 体孤雌胚胎进行了初步研究，并且与m l l 期卵母细胞孤雌胚的发育能力进行了比较。同时， 对利用纺锤体移植的技术路线获取二倍体孤雌胚胎进行了探索性的研究。 1 不同激活方法对小鼠m i i 期卵母细胞孤雌激活效果比较。实验采用5 种方法对经c d 处 理的m i 期卵母细胞进行孤雌激活。a 2 3 1 8 7 + 6 一d m a p 的卵裂率和囊胚率分别为6 9 5 6 和 2 8 8 6 ，极显著高于乙醇、s r c l 2 、a 2 3 1 8 7 和电激活的卵裂率和囊胚率( p 0 0 5 ) 。m m l 6 的4 8 细胞率极显著高f 其 它3 种培养液( 6 8 5 0 v s 5 8 6 3 、4 8 3 9 、3 6 8 6 ，p 0 0 1 ) 。囊胚率也以m m l 6 最高( 4 3 3 7 v s 2 6 8 5 、1 6 1 3 、7 9 6 ，p 0 0 1 ) 。 3m l 期卵母细胞与m i i 期卵母细胞孤雌发育能力的比较。实验采用a 2 3 1 8 7 + 6 d m a p 联 合处理的方法对卵母细胞进行孤雌激活，激活卵用m m l 6 培养。经c d 处理的m i 期卵母细胞 发育到囊胚的比率极显著高于m l i 期卵母细胞( 4 6 2 5 v s 3 4 3 7 ，p 0 0 5 ) 。 4 不同电场强度对重构卵融合的影响。通过核移植手段将m l 期纺锤体移入去核m i i 期卵 母细胞的透明带下构成重构卵，选用0 3m o l l 甘露醇，含0 1m m o l lm g c l 2 、0 ，0 5m m o l i - c a c 1 2 、0 0 5 的b s a 和0 5m m o l l h e p e s ，作为电融合介质，固定脉冲宽度为4 0 s ，依次采用 4 种电场强度( 1 0k v c m ，1 5k v 惩m ，2 ok v c m ，2 5k v 哪) 对重构卵进行融合处理。 两南大学硕十学位论文 摘要 其中，1 5k w c m 与2 0k v ，c m 场强的融合率显著高于2 5k v c m 场强( 1 5 0 9 、1 4 9 2 v s 6 3 4 。p 0 0 5 ) 。 6 重构卵的激活与培养。选用o 3m o l l 甘露醇，含0 1m m o l l m g c l 2 、0 0 5m m o c ac 1 2 、 o 0 5 的b s a 和0 5m m o l lh e p e s ，作为电融合介质，采用电场强度2 0k v c m ，脉冲宽度 4 0 u s ，对重构卵进行融合处理。重构卵的激活率为8 6 2 9 ，2 细胞率为6 1 7 8 ，4 8 细胞率 为3 2 8 8 ，囊胚率为4 1 7 。 结论：( 1 ) 经c d 处理的小鼠m l 期卵母细胞激活后能发育到囊胚阶段，并且其发育能 力明显强于m l l 期卵母细胞的孤雌胚。( 2 ) 乙醇、s 疋1 2 、a 2 3 1 8 7 、电激活与a 2 3 1 8 7 + 6 - d m a p 五种激活方法中，以a 2 3 1 8 7 + 6 d m a p 对经c d 处理的小鼠m i 期卵母细胞的激活效果最好， 激活后孤雌胚发育到囊胚的比率也最高。( 3 ) m c z b 、k s o m 、m 1 6 和m m l 6 四种培养液中， 以m m l 6 对小鼠m l 期孤雌胚的发育最为有利。( 4 ) 小鼠m l 期纺锤体移植的重构卵，在本 实验室以1 5k v 恐m 2 ok m 之间的电场强度和4 0 雌的脉冲宽度进行融合的效果最好。( 5 ) 小鼠m l 期纺锤体与去核的m i i 期卵母细胞融合后经激活处理，有一小部分能够发育到囊胚阶 段。( 6 ) 利用c d 处理小鼠m i 期卵母细胞，抑制第一极体的排出，再对其激活可以得到二 倍体孤雌胚胎。通过纺锤体移植，再利用重构卵获取二倍体孤雌胚胎的方法效率太低，不实 用。 关键词：小鼠卵母细胞m i 期孤雌激活纺锤体 两南大学硕十学位论文a r s t r a c ，i s t u d y o n a c c e s s i i l gp a i t l l e n o g e n e t i ce n l b r y o s b ym o l l s e d i s c i p l i n e ：c l i n i c a lv e t e r i n a r y c a n d i d a t e ：c is h u f e n g a d v i s o r ：p r o f y h e m i nl i a b s t r a c t c u r r e n tr e s e a r c ho n p a n h e n o g e n e t i cd e v e l o p m e n ti s o f t e nu dm 1 10 0 c ”e s ， a n dt h e p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o sa r eu s u a l l yh a p l o i d u s i n gc y t o c h a l a s i nd ( c d ) f b ri n h i b i t i n gt h er e l e a s e o ft h ef i r s tp o l a r b o d yc a nm a i n t a i nt h eg e n o m ei n2 n 伽t h o u g l lf o rt h eg e n o m i ci m p 血t i n g ，l od o t h i sc a nn o tm a k ep a n h e n o g e n e t i ce m b r y o sd e v e l o pt 0 t e 姗，b u tc a np r o v i d ep a n h e n o g e n e t i c e m b r ) r o n i c c e l l sam o r ee x t e n s i v e g e n e t i cb a c k 目d u n d f b r e i g nr e s e a r c h e rr e p o r t st h a tt h e p a n h e n o g e n e t i cs t e mc e l l sm a t c h e dw i t ht h e0 0 c y t ed o n o r sm h cc a nb ei s o l a t e df 如mt h i s b l a s t o c y s t ap r e l i m i n a r ys t u d yo na c c e s s i n gp a n h e n o g e n e t i ce m b r ) ，o sb ym io o c ) r t e si sc o n d u c t e d ， w h i c hi n c l u d e dc h o s i n gt h em e t h o d so fa c t i v a t i o na n ds u i t a b l em e d i u mf o rc u l t u r i n g t h e r ea r ea l s o ac o m p a f i s o no nd e v e l o p m e n tc a p a b i l i t yw “ht h ep a n h e n o g e n e t i ce m b r ) ，ow h i c ho b t a i n e d 仃o mm l l o o c ”e s i i la d d i t i o n n ，t h i se x p e r i i i l e n ta d o p t e ds o m a t i cc e nn u c l e a rt r a n s f e rt e c h n o l o g i e st 0r e s e a r c h o na c c e s sd i p l o i dp a n h e n o g e n e t i ce m b r y o s 1e a e c t so fd i f i e r e n ta c t i v a t i o no nt h ed e v e l o p m e n to fp a r t h e n o g e n e t i cm o u s em io o c ”e s 5 w a y so na c t i v a t i o no fm o u s em io o c ) ，t e sd e a l e dw i t hc dw e r ei i l v e s t i g a t e d a 2 31 8 7 + 6 d m l 气pt h e c l e a v a g er a t ea n dt h er a t eo fb l a s t o c y s tw e r e6 9 5 6 柚d2 8 8 6 ，w h i c hs i g i l i f i c a n t l yh i g h e r t h a n t h a to fe t h a n o l ，s 疋1 2 ，a 2 3 1 8 7 ，a n de l e c t r i c a la c t i v a t i o n 2e f l b c t so fd i f f 色r e n tc u l t u r em a d u i mo nt h ed e v e l o p m e n to f p a n h e n o g e n e t i cm o u s em lo o c y t e s w ec o m p a r e dt h ed e v e l o p m e n to ft h e p a n h e n o g e n e t i ce m b r y o sc u l t u r e di n4d i f f e r e n tc u l t u r e m a d u i m ( m c z b 、k s o m 、m 1 6a n dm m l 6 ) t l l l e r eg o tn os i g n i f i c a n td i f e r e n c ei nc l e a v a g er a t e ( 7 9 3 9 、7 7 5 4 、7 7 4 7 、7 8 0 2 ，p 0 0 5 ) b u tp e r c e n t a g eo f t h ee m b r ) r o sd e v e l o p i n g1 0 4 8 一c e l l sa r es i g n i f i c a n t l yh i g h e ri nm m l 6t h a nt h eo t h e r s ( 6 8 5 0 v s 5 8 6 3 、4 8 3 9 、3 6 8 6 ， p 0 0 1 ) ，a sw e na si nr a t eo f b l a s t o c y s t ( 4 3 3 7 v s 2 6 8 5 、1 6 1 3 、7 9 6 ，p 0 0 1 ) 3t l l l ec o m p a r i s o no ft h ed e v e l o p m e n tb e t w e e nm io o c y t e sa n dm i i o o c y t e s a 2 318 7 + 6 d m a p w a su s e dt os i m u l a t eo o c y t e sa n dm m 16f o rc u l t u r i n g t h em io o c y t e sd e a l e dw i t hc ds h o wab e t t e r i i i 两南大学硕+ 学位论文 a b s t r a c t d e v e l o p m e n tc a p a c i t yt h a nm 1 10 0 c ) ，t e sa f t e rb e e na c t i v e d ( 4 6 2 5 v s 3 4 3 7 ，p 0 0 5 ) 4t h ee f i - e c to fd i 虢r e n te l e c t r i cf i e l ds t r e n g t ho nt h er e s u l to fa c t i v a t i o nw i t hr e c o n s t i t u t e d o o c ) ，t e s m is p i n d l ew a sp u tt o g e t h e rw i t he n u c l e a r e dm i io o c y t et of o mar e c o n s t i t u t e do o c y t e sb y s p i n d l et r a n s f o r c h o o s i i l gi s i o nm a d i at h a tc o n t e n t so 3m o l lm a n n i t a l ，0 0 5m m o l l c a c l 2 、 o 0 5 b s aa n d0 5i 砌o l lh e p e s ，血i n ge l e c t r i cf i e l dd u r a t i o no n4 0 岬，w eu s e4d i m r e n te l e c t r i c f i e l ds t r e n g t h ( 1 0k v c m ，1 5k v c m ，2 0k v c m ，2 5k 、i c m ) t of i i s i o nt h er e c o n s t i t u t e d0 0 c y t e s w h e ne l e c t r i cf i e l ds t r e n g t ha r e1 5k v c mo f2 ol i ，1 w c i i l ，i h ef u s i o nr a t ei ss i g n i f i c a n t l yh i g l l e r t h a n t h a ti so n2 5k v c m ( 1 5 0 9 、1 4 9 2 v s 6 3 4 ，p o 0 5 ) ，a n dv e r ys i 印让i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti s o n1 0k v c m ( 1 5 0 9 、1 4 9 2 v s 4 6 1 ，p 0 0 1 ) b u tt h e r ea r en os i g i l i f i c a n td i f f e r e n c ei nf u s i o n r a t eb e t w e e n1 5k v c ma n d2 0k v 尼m 5t h ee f l e c to fd i f f e r e n te l e c t r i cf i e l dd u r a t i o no nt h e 陀s u l to fa c t i v a t i o nw i t hr e c o n s t i t u t e d o o c y t e s m is p i n d l ew a sp u tt o g e t h e rw i t he n u c l e a r e dm i i0 0 c y t et of o 咖ar e c o n s t i t u t e do o c ”e sb y s p i n d l et r a n s f o lc h o o s i n gf i i s i o nm a d i at h a tc o n t e n t so 3m o l lm a n n i t a l ，0 0 5m m o l l c a c l 2 、 0 0 5 b s aa n d0 5m m o l l h e p e s ，f i x i n ge l e c t r i cf i e l ds t r e n g t ho n2 0k v 忙m ，w e u s e3 d i f e r e n t e l e c t r i cf i e l dd u r a t i o n ( 4 0 s ， 8 0 岬， 1 2 0 s ) t of u s i o nt h er e c o n s t i t u t e do o c y t e s w h e ne l e c t r i cf i e l d d u r a t i o na r e4 0 so r8 0 “sf u s i o nr a t ei sh i g h ，b u tt h e r ea r en os i g n i f i c a n td i f e r e n c eb e t w e e nt h e m 6t l l ea c t i v a t i o na n dc u l t u r eo fr e c o n s t i t u t e do o c y t e s c h o o s i n gf u s i o nm a d i at h a tc o n t e n t s0 3 m o l lm a n n i t a l ，o 0 5m m o l l c a c l 2 、0 0 5 b s aa n d0 5 姗o l lh e p e s ，f i x i n ge l e c t r i cf i e l d s t r e n g t ho n2 0k v 屉ma n de l e c t r i cf i e l dd u f a t i o no n4 0 “s ，w eg o t m er e c o n s t i t u t e do o c y t e sf u s e d 1 1 1 ea c t i v a t i o nm t eo fr e c o n s t i t u t e do o c ”e sf u s e di s8 6 2 9 ，2 c e ur a t ei s6 1 7 8 ，4 。8 c e l l sr a t ei s 3 2 8 8 a i l dt h er a t eo f b l a s t o c y s ti s4 1 7 1 nc o n c l u s i o n ：( 1 ) m o u m io o c y t e sd e a l e dw i t hc dc a nd e v e l o pt 0 b l a s t o c y s t ，a n di t 、s d e v e l o p m e n tc a p a c i t yi sb e t t e rt h a nm i ip a r t h e n o g e n e t i ce m b r ) ，o s ( 2 ) a 2 3 1 8 7 + 6 d m a pi st h eb e s t c h o i c ef o rm 1o o c y t e sa c t i v a t i o na n ds u p p o nah i g h e s tr a t eo f b l a s t o c y s td e v e l o p i n ga m o n ge t h a n o l ， s r c l 2 ，a 2 3 1 8 7 ，e l e c t r i c a la c l i v a t i o na n da 2 3 1 8 7 + 6 一d m a p ( 3 ) m m l 6i st h eb e s tm a d i u mf o rm i p a n h e n o g e n e t i ce m b r y o sa m o n gm c z b 、k s o m 、m 1 6 柚dm m l 6 ( 4 ) w h e ne l e c t r i cf i e l ds t r e n g t hi s 2 ok ：v e ma n de l e c t r i cf i e l dd u r a t i o ni s4 0 “s ，t h er e c o n s t i t u t e do o c y t e sg o tt h eh i g h e s tf u s i o nr a t e ( 5 ) t h e r ea r ef e wr e c o n s t i t u t e do o c y t e sc a nd e v e l o pt ob l a s t o c y s ta f t e rb e e na c t i v a t e d ( 6 ) d e a lt h e m lm o u s eo o c y t e sw i t hc di no r d e rt oi n h i b i tt h er e l e a s eo ft h ef i r s tp o l a rb o d y ，a n dt h e na c t i v a t e t h eo o c y t e sc a ng e td i p l o i dp a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o s i t 、sn o tg o o dt oa c c e s sd i p l o i dp a n h e n o g e n e t i c e m b r y o sb yr e c o n s t i t u t e d k e yw o r d s ：m o u s e 。m o o c y t e sb e c a u s eo fal o we f f i c i e n c y i ，o o c y t e ，p a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o n ，s p i n d i et r a n s f e r i v 独创性声明 学位论文作者：劫哞 签字日期：沙矿年，月扫日 学位论文版权使用授权书 奎堂鱼途塞往耋塞全工鲤酉直太堂直差堡留! 焦旦堂僮途窒的趣 定l 直拯堡留羞囱国塞直羞部 鱼扭捡鲎窒途塞丝复虫鲑塑磁盘：盒 迕途窒越查阅塑垡因! 奎厶拯褪酉直太堂硒塞生部亘丛鉴堂僮途塞的 全部亟部筮囱空缠直差数据座堂堑捡塞：亘丛墨旦髭虫! 缠虫重扫 描笠复剑壬题堡在! 逛缠堂僮迨塞! ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至 等 肚) 。 毋， 学位论文作者签名：渤肆导师签名彬幻 签字日期：o 秽吕年歹月踟日签字日期：沙汐彦年厂月劲日 西南大学硕+ 学位论文文献综述 第一部分文献综述 1 卯母细胞发生及成熟的大致过程 卵母细胞从发生到成熟要经历一个漫长而复杂的过程。它从胚胎发生早期开始，经过胚 胎期，出生，直至性成熟才完成。其具体变化过程是：由原始生殖细胞形成卵原细胞；卵原 细胞经增殖期形成初级卵母细胞；初级卵母细胞经生长期达到充分生长，再经成熟期形成次 级卵母细胞；停滞在第二次减数分裂中期的次级卵母细胞，即成熟卵母细胞。 1 1 原始生殖细胞的起源与迁移 原始生殖细胞( p 池1 0 r d i a lg e 珊c e l l s ，p g c s ) 最早是在胚盘原条后部形成。在人胚胎第3 周、小鼠胚胎第8 5 天，此处即出现低度分化的p g c s 。接下来伴随着原条细胞从原沟处内卷， p g c s 到达尿囊附近的卵黄囊背侧内胚层。随后p g c s 以阿米巴运动，沿卵黄囊的尾部通过新 形成的后肠，然后沿背侧肠系膜迁移到胚胎两侧未分化的生殖嵴上皮内。人大约在妊娠( 受 精后) 5 6 周、小鼠在妊娠1 3 5 天时，p g c s 迁至生殖嵴【1 1 。迁移过程中，p g c s 不断进行有丝 分裂而增殖。 1 2 卵原细胞的形成与增殖 到达生殖嵴上皮的p g c s 进一步迁移到未分化性腺的原始皮质中，与其它来自中胚层的生 殖上皮细胞结合在一起形成原始性索。p g c s 在原始性索中定位后很快发生形态学和生理学的 变化而转化为卵原细胞，卵原细胞以有丝分裂的方式进行增殖【2 1 。 1 3 初级卵母细胞的形成与生长 在卵原细胞增殖的同时，未分化性腺逐渐分化为卵巢。卵原细胞边增殖边向卵巢皮质迁 移，大约在第二代卵原细胞时到达卵巢皮质。随后，卵原细胞开始进入减数分裂，并被次级 性索细胞包裹后形成原始卵泡，而卵原细胞也停止有丝分裂，进入并停滞在第一次减数分裂 前期，形成初级卵母细胞。 在第一次减数分裂前期的细线期，d n a 进行复制。接着进入偶线期，同源染色体配对。 随后经历粗线期，同源染色体之间发生等位基囚之间部分d n a 片段的交换和重组。接着就进 入了双线期。卵原细胞的减数分裂进入双线期后，被阻滞在第一次减数分裂前期形成初级卵 母细胞。哺乳动物出生前后绝大多数卵母细胞都已进入第一次减数分裂前期。 处于双线期的初级卵母细胞，伴随着卵泡生长的启动，开始迅速生长。其染色体松散膨 胀，形成灯刷状染色体，r n a 转录活跃。细胞质内细胞器大量复制增生，r n a 含量成倍增长， 并有大量的蛋白质合成和能量物质积累【3 】。期间，卵母细胞体积可增加数倍：小鼠卵母细胞直 两南火学硕十学位论文文献综述 径约从1 5 p m 增加到8 0 斗m ，人约从3 5 m 到1 2 5 “m ，牛、绵羊、山羊约从3 5 斗m 到1 5 0 m ， 猪约从3 0 “m 到1 3 0 址m 【。双线期持续时间一般较长。人卵母细胞双线期从胚胎期的第5 个月 开始，短者可持续十几年，到性成熟才开始有部分卵母细胞离开双线期进入后面的发育阶段； 长者可持续达四五十年，到生育期结束。 1 4 初级卵母细胞减数分裂的恢复与第一次减数分裂的完成 初级卵母细胞完成生长后往往停留在第一次减数分裂前期，需在外来信号的刺激下才能 恢复减数分裂。在体内，卵母细胞是在l h 峰的作用下恢复减数分裂的。排卵之前，一般都出 现促性腺激素排卵峰，在高水平的促性腺激素刺激下，卵母细胞重新开始减数分裂。表现为 生发泡破裂( g v b d ) ，核内物质与胞质物质相互混合，染色体进入第一次减数分裂中期赤道 板，然后迅速进入后期、末期，排出第一极体，完成第一次减数分裂。极体中只含有极少量 的胞质，不久就退化。 如若将卵母细胞从卵泡中移走，其成熟分裂亦可在没有促性腺激素的作用下得以恢复和 完成。目前关于促性腺激素诱导卵母细胞恢复减数分裂的机制有不同的假说1 4 l ： ( 1 ) 通过降低 细胞内卵母细胞成熟抑制因子的水平来实现；( 2 ) 通过颗粒细胞分泌的成熟促进因子克服卵泡 抑制环境来实现：( 3 ) 通过遏制或者破坏卵丘和卵母细胞之间的缝隙连接来实现。 1 5 卯母细胞停滞在第二次减数分裂中期 卵母细胞排出第一极体后，成为次级卵母细胞，其染色体迅速再次对齐在第二次减数分 裂纺锤体上并停滞在这一时期，成为成熟卵母细胞。不久以后，成熟卵母细胞就在排卵过程 中被排出。小鼠在l h 峰后大约2 5 4 h 发生g d ，约1 0 h 后排出第一极体，1 1 1 3 h 即发生 排卵。大部分脊椎动物的成熟卵母细胞只有在受精后才完成第二次减数分裂。 2 卯母细胞成熟的涵义及成熟的相关机理 2 1 卵母细胞成熟的涵义 卵母细胞的成熟是指，卵母细胞具备正常的受精和支持早期胚胎发育的能力。其涉及到 的事件有：卵母细胞通过减数分裂使染色体数目减半；卵母细胞在受精过程中能结合精子， 在精子穿过透明带后能完成皮质反应、透明带反应和卵黄膜反应；精子进入卵母细胞膜后， 卵母细胞能支持其完成精核解聚并形成雄原核。同时，卵母细胞m i i 期纺锤体完成第二次减 数分裂排出第二极体并形成雌原核；雌、雄原核相互融合，形成受精卵的细胞核，接着启动 卵裂；在2 细胞、4 细胞或者8 细胞等时期，能顺利的完成核基因组转录功能的启动，越过阻 滞期等等。只有这些事件能被正常的执行，才认为卵母细胞是成熟的。 卵母细胞成熟的标准一般认为是：1 生发泡破裂，排除第一极体，停滞于第二次减数分 裂中期，达剑核成熟；2 达剑一定体积，细胞质内含有充足的蛋白质、细胞器、r n a 、d n a 2 西南大学硕十学位论文文献综述 和能量，达到胞质成熟：3 卵母细胞膜及透明带发生变化，为接纳精子做好准备。 2 2 卵母细胞成熟与卵泡细胞的关系 卵母细胞与其周围的卵泡细胞紧密联系。卵泡细胞主要包括内膜细胞、颗粒细胞和卵丘 细胞。卵泡内膜细胞是雄激素的主要分泌者，而雄激素又是颗粒细胞合成雌激素的必备底物； 卵泡内膜细胞或壁层颗粒细胞能分泌一些因子，促进颗粒细胞的增殖，还可能分泌某种或某 些物质来维持卵丘细胞和卵母细胞之间的间隙联结，并抑制卵母细胞恢复减数分裂1 5 1 ，这对于 卵母细胞在恢复减数分裂前充分生长，积累足够的蛋白质和m r n a ，以及卵母细胞内细胞器 的重分布是极其重要的。颗粒细胞一方面可以为卵母细胞提供营养，另一方面通过分泌一些 生长因子调节卵母细胞的生长、成熟。反过来，卵母细胞也可分泌一些特异性的因子调节颗 粒细胞的增生、分化及其功能。 猪卵母细胞成熟过程中，卵母细胞和卵丘细胞间的间隙连接可允许小分子、离子如某些 代谢产物、氨基酸通过，这为卵母细胞提供了必需的丙酮酸、草酰乙酸和核苷等物质，并有 利于调节卵母细胞内谷胱甘肽的含量【6 ，7 1 ，防止卵母细胞被氧化诱导而凋亡。卵丘细胞分泌的 物质调节着猪卵丘卵母细胞复合体( c u m m l u s 啪c ”ec o m p l e x e s ) 的间隙连接和卵丘细胞扩散。 一些抑制减数分裂的物质，例如c a m p 和嘌呤( 次黄嘌呤和腺嘌呤) ，通过缝隙连接到达卵母细 胞内，保持卵母细胞减数分裂阻滞。研究表明f 引，壁层颗粒细胞和卵丘细胞上含有l h 和h c g 的受体，而卵母细胞上未检测到，由此可见，促性腺激素是通过作用于壁层颗粒细胞或卵丘 细胞而使卵母细胞恢复减数分裂的。哺乳动物排卵前，在促性腺激素峰促进卵母细胞完成减 数分裂过程的同时伴随着卵丘的扩散。卵丘细胞之间缝隙连接的丢失阻止了卵丘细胞内减数 分裂抑制信号进入卵母细胞【9 】；另一方面，卵丘细胞能分泌促进卵母细胞发生减数分裂的物质， 研究表明，小鼠卵丘细胞能分泌一种可能是甾醇类的物质，这种物质能促进卵母细胞恢复减 数分裂【l 。因此，卵丘细胞在卵母细胞减数分裂的抑制以及恢复中都起着重要作用。 2 3 卯母细胞核成熟 2 3 1 卯母细胞减数分裂的阻滞与恢复 在多数物种，卵泡发育到有腔卵泡时，卵母细胞完成生长，具有恢复减数分裂的能力。 但是，卵泡颗粒细胞和内膜细胞分泌的卵母细胞成熟抑制因子( o o c y t em a t u r a t i o ni n h i b i t i n g f a c t o r ，0 m i ) 和c a m p ( 环腺苷酸) ，以及卵泡液内存在的次黄嘌呤( h y p o x a n t h i n e ，h x ) 等物质， 使得卵母细胞在l h 峰到来前停留在核网期( g v 期) 【1 】o o m l 是一种小肽，分子量低于2 0 0 0 d a ， 可抗胰蛋白酶的消化，冷冻和解冻及活性炭吸附皆对其活性无影响【1 1 1 。o m l 的活性无种属特 异性【l 引，但其提纯和鉴定至今仍没有获得成功。众多试验都证明，维持高水平的c a m p 可抑 制卵母细胞的成熟。c a m p 类似物、阻止c a m p 降解的磷酸二脂酶抑制剂( 如i b m x ) 、激活腺 苜酸环化酶活性的试剂( 如f o r s k o l i n ) 也能维持卵母细胞的减数分裂阻滞。一般认为，具有抑制卵 3 - 西南大学硕+ 学侮论文文献综述 母细胞成熟能力的0 m i 、c a m p ，是由卵丘细胞产生，并通过间隙转运至卵母细胞中的1 1 引。 d o w n s 和e p p i g 研究发现卵泡液内存在的次黄嘌呤也是通过抑制磷酸二脂酶的活性，使c a m p 降解减少，从而维持卵母细胞内的枷浓度，进而抑制卵母细胞的成熟。 卵母细胞第一次减数分裂的恢复是在促性腺激素作用下发生的。促性腺激素在排卵前迅 速升高，出现峰值。人的l h 能达到5 0 1 0 0 i u l ，f s h 达到1 0 一2 0 i u l 。由于蛋白质由血液进 入卵泡速度较慢，促性腺激素峰出现5 6 h ，才能在卵泡内出现相应的峰。虽然确定卵母细胞 减数分裂的恢复是由促性腺激素诱导的，但l h 与f s h 的精确调控机制并不清楚。由于促性 腺激素受体只存在卵泡细胞上，卵母细胞上没有。因此，促性腺激素的刺激必然通过卵泡细 胞介导。l h 可以刺激卵丘细胞两个独立的信号系统：一方面l h 激活腺甘酸环化酶的活性，使 卵母细胞内的c a m p 短暂上升，c a m p 作为膜信号转导通路的重要第二信使进而促进卵丘细胞 分泌刺激物质诱发卵母细胞成熟：另一方面u i 激活磷酯酶c ( p h a o s p h o l i p a s ec ，p i _ ) ，水解 磷酯酰肌醇产生三磷酸肌醇( i n o s i t o l i r i p h o s p h a t e ，i p 3 ) 。l p 3 可使细胞内贮存的c a 2 + 释放。孙青 原等( 1 9 9 4 ) 【1 4 l 研究表明，一定浓度的c a 2 + 一a m 复合体抑制剂能抑制生发泡的破裂。这表明 c a 2 + 浓度的升高可能是减数分裂中一个不可缺少的中间过程c a 2 + 的存在可能加强m p f 对微管 系统形成的促进作用。此外，卵母细胞内c a “浓度增加，能引起腺甘酸环化酶的抑制，从而 抑制c a m p 的产生，使卵母细胞能够发生生发泡破裂l h 另一条可能途径是促进卵丘细胞合 成孕酮，孕酮再作用于卵母细胞，参与m p f 的激i 舌【”】，m p f 具有导致卵母细胞恢复减数分 裂直至成熟的作用。f s h 也能以类似l h 的机制引起卵母细胞内贮存的c a 2 + 从内质网释放到胞 浆中。 当卵母细胞排出第一极体后，m p f 活性再次升高，并在c s f 的协同下维持高活性，使得 卵母细胞停止在第二次减数分裂中期( m i i 期) ，直到精子穿入或其他因素作用后，才完成第 二次减数分裂。如果没有这些因素的刺激，卵母细胞将维持在m i i 期，并最终退化。 2 3 2 成熟促进因子( m a t u r a t i o np r o m o t i n gf a c t o r m p f ) m p f 最早于1 9 7 1 年在两栖类卵中发现，是一种调控细胞周期的蛋白激酶，因能促进卵母 细胞的成熟而得名。后来在所有研究过的动物，包括哺乳动物，都发现有m p f 存在，并且发 现其功能无种属特异性【1 6 1 7 】。m p f 在卵母细胞减数分裂的分裂过程中起着关键性的作用，它是 由细胞周期素b ( c v c l i n b ) 和p 3 4 甜c 2 两个亚基组成。p 3 4 c d c 2 是由细胞分裂周期基因c d c 2 和c d c 2 8 编码的蛋白质，是m p f 的催化亚基，p 3 4 c d c 2 本身具有h 1 组蛋白激酶作用。c v c l i n b 是m p f 的调 节亚基。c v c l i n b 在细胞周期内间断性存在，在s 期前期开始合成，在m 期后消失，它与p 3 4 阳c 2 亚基结合或游离，决定m p f 的激活或欠活。因此m p f 的活性也随着c v c l i n b 的合成而早周期性 的变化f 1 8 l 。在卵母细胞进入m 期之前，m p f 活性大大增加，在m 期的中、后期，m p f 活性迅速 下降直至消火。 m p f 的活性是由一系列复杂的蛋白质磷酸化作用和玄磷酸化作用米调1 了的。m p f 没有活 4 两南大学硕十学位论文文献综述 性时，其1 4 位苏氨酸( m 1 4 ) 和1 5 位酪氨酸( t y r l 5 ) 2 个位点的氨基酸高度磷酸化。当m p f 活化时，首先c y c l i n b 和p 3 4 础2 结合，同时需要p 3 4 c d c 2 以及磷酸化的1 4 位苏氨酸和1 5 位酪氨酸的 氨基酸残基去磷酸化，而s e r l 6 位点的丝氨酸保持磷酸化状态。已知c d c 2 5 基因的产物可使 p 3 4 咄2 的酪氨酸和苏氨酸去磷酸化，从而最大限度的活化m p f 。 m p f 的作用十分广泛，涉及到与有丝分裂和减数分裂有关的蛋白质的磷酸化。m p f 能够 催化组蛋白h l 磷酸化。h 1 磷酸化以后，可以使染色体充分浓缩；m p f 能够催化核纤层蛋白磷 酸化，使核纤层解体，导致核膜崩解；并能作用于微管蛋白，调节微管蛋白的组装从而影响 染色体的向极运动；m p f 能使肌球蛋白的轻链磷酸化，抑制微丝的功能，从而抑制细胞分裂； m p f 能使核仁蛋白磷酸化，可能对m 期核仁分解及核仁染色质凝集起重要作用；m p f 还能使一 些原癌基因产物磷酸化，产生一系列与细胞分裂有关的效应：例如，m p f 使c m y b 原癌基因产 物磷酸化，可能降低这些蛋白质在m 期与d n a 结合的功能，有利于染色质凝集【3 1 。 2 3 3 细胞静止因子( c y t o a t a tjcf a c t o r c s f ) m p f 阻滞卵母细胞停留在m l i 期的作用不能独立完成，还需要细胞静止因子( c s f ) 的 参与。c s f 是一族作用相似的活性物质，包括原癌基因c m o s 的产物m o s 、丝裂原蛋白激酶 ( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i l l a s e ，m a p k ) 和c d c 2 等【1 9 删。由于c y c l i n b 的蛋白质水解作用 足以引起自中期向后期的转变，而c y c l i n b 在m l i 期卵母细胞提取物中保持相对稳定。c s f 作用是使c y c l i n b 磷酸化和p 3 4 c d c 2 去磷酸化，使c y c l i n b 的合成与降解处于一种动态平衡中， 从而使m p f 维持在高活性状态，使卵母细胞停滞在m i l 期。在卵母细胞受精后，细胞内c a 2 + 浓度迅速增加，使c s f 活性消失，c v c l i n b 被降解，m p f 活性消失，卵母细胞离开m i l 期【2 l 】。 2 3 4 丝裂原蛋白激酶( m i t o g e n a c ti v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，m a p k ) 1 9 8 8 年r a y 和s t u 唱i l l 最先在3 t 3 l 1 脂肪母细胞中纯化出2 种分子量分别为4 2 l 【d a 和 4 4 k d a 的蛋白，当该细胞受到胰岛素刺激时，这2 种蛋白质的酪氨酸苏氨酸残基发生磷酸化1 2 2 1 。 这一结果很快在其它细胞中得到证实。随后又发现这2 种蛋白质就是多年前通过双向电泳技 术观察到的在生长因子诱导下而发生酪氨酸残基磷酸化的蛋白( r o s s o m a n d oe ta 1 ，1 9 8 9 ) 【2 3 1 。 鉴于许多胞外激动剂都能激活这类蛋白而引起细胞分化和分裂，1 9 9 0 年后该蛋白被统一命名 为丝裂原激活蛋白激酶( m a p k ) 。又叫作细胞外调节酶( e r k ) 。m a p k 是一类广泛存在 于真核细胞的s e r 门哺r 蛋白激酶，其活性依赖于t y f 和t 1 l r 两个位点同时的磷酸化【2 4 1 。 在细胞中，胞外信号向胞内靶目标的传递涉及许多胞内信使的介导和调节，而这些胞内 信使又通过蛋白质的磷酸化去磷酸化方式相互作用，这个过程是通过一个高度保守的蛋白激 酶级联系统，即丝裂原激活蛋白激酶级联系统。该级联系统把膜受体结合的胞外刺激物与细 胞质和核中的效应分子连接起来。m a p k 是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，它可以被其上游具有丝 氨酸苏氨酸酪氨酸激酶活性的m a