（临床兽医学专业论文）鳗池水体和生物膜中微生物的dgge分子指纹分析.pdf

上渔渔滢太堂博硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名工作单位职称备注 臼仫乞谚：加严砑红彳一姗铬履 主席 呦物乃是舅勘秭扔详稚 、 衍乙砑援 委员 i 、 晓云编尺缘徼撬 委员 杰侧l 赫就锄复所矾次 委员 v 寸忌0 骇舯嘉移彳 i 刁a 镪 委员 7 ， 委员 委员 - 、 知撵易塘i 小产石氛钪多彳咖乃a 秘书 答辩地点 亨去小耘褫勿彳易絮声辩日期 劢p 罗彦舢 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名蔼皇芙 日期：如够年多月l ie l 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密日，在年解密后适用本版权书 ， 躲葛苏。弘钐学位论文作者签名：携萤天指导教师签名。磊落疋缈、 眺防年l ，月，f 日 日期月日 上海海洋大学硕士学位论文 鳗池水体和生物膜中微生物的d g g e 分子指纹分析 摘要 鳗鲡作为名贵的水产养殖品种，素有水中软黄金之称，是我国出口创汇的主 要水产品之一。但随着养殖面积和密度的不断增加以及养殖环境老化，造成病害 时常发生。同时在病害防治过程中药物的不规范使用，使得鳗鲡药物残留问题变 得日益严重，已成为限制鳗鲡养殖发展的瓶颈。因此迫切需要在鳗鲡养殖生产过 程中引进绿色、健康、无公害的病害防控机制。本文通过在鳗池中引入人工生物 基载体，研究了鳗鲡养殖池塘水体与载体生物膜微生物的d g g e 指纹特征及水环境 因子对生物膜微生物多样性的影响。在此基础上初步探讨了人工载体生物膜在鳗 池中的应用。旨在为日后生物膜技术在鳗鲡养殖过程中的应用充分发挥微生物的 生态效益提供理论依据。 1 鳗池水体和生物膜微生物指纹分析 2 0 0 7 年8 月至1 2 月间，在广东清远银珠鳗鲡养殖场选取5 个鳗鲡土池，引入人 工生物基载体，利用p c r d g g e 技术分析了水体与生物膜上微生物指纹特征以及 二者之间的关系。结果表明养殖前期水体和生物膜微生物多样性呈上升趋势，养 殖后期逐渐下降，但生物膜微生物多样性下降趋势比水体慢，水体和生物膜微生 物图谱平均相似性为6 5 4 。通过比较载体生物膜与水体之间具有差异性的优势条 带，结果表明各池塘中出现的差异性优势条带约为3 一ll 条。回收部分差异性条带 测序，经过g c n e b a n k 比对结果表明生物膜上特征性条带为假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a sl u b r i c a n s ) ( 9 5 ) 以及其他两种未经过命名的菌类。水体中优势种 群为y 蛋白菌属( g a m m ap r o t e o b a c t e r i u m ) ( 9 7 ) 、爱德华菌属( e d w a r d s i e l l a i c t a l u r i ) ( 9 4 ) 与弧菌属( h b r i o ) ( 8 7 ) ，序列比对结果粗略指示了环境中的 优势种群。分析表明生物膜可以形成其特定的生态体系，载体上的微生物通过相 互作用形成生物膜在一定程度上可以减缓由于环境恶化而造成的微生物多样性丢 失。条带差异性以及回收结果均表明载体生物膜与水体之间微生物优势种群出现 了分化，表明引入人工生物基载体可以从整体上提高养殖环境中微生物多样性。 上海海洋大学硕上学位论文 2 鳗池微生物多样性与水质关系初步研究 综合5 次采样共2 5 组水化指标和微生物多样性数据，分析了微生物多样性 指数与各水化因子之间的关系，结果表明微生物多样性指数与p h 值、温度关系较 为明显，其关系式分别为y = 6 6 6 4 8 l n ( x ) + 1 6 1 5 9 ( r 2 = 0 4 6 1 2 ) 、y = 0 0 3 0 7 x + 2 2 4 9 7 ( r 2 = 0 4 0 8 1 ) 。利用p h 值、亚硝酸盐、硝酸盐构建出水质综合评价指数 p i ，探讨了水体、生物膜微生物多样性指数同水质综合指数之间的关系，结果表明 水质综合指数随着养殖过程的推进逐渐升高，水质综合指数与水体微生物多样性 指数呈显著相关性y = 0 7 7 3 7 l n ( x ) + 3 1 0 3 6r = o 4 1 8 ( p 0 0 5 ) ，与生物膜上微生 物多样性指数有极显著相关性y = 0 8 2 8 l n ( x ) + 3 0 6 9 4 r - - - o 4 8 9 ”( p o 0 1 ) 。 3 人工载体生物膜对鳗鲡养殖水环境的影响 2 0 0 8 年1 月至4 月在广东清远银珠鳗鲡养殖场选取鳗鲡养殖池塘，按照l ：5 的 比例投入1 2 0 0 m z 的人工生物基载体，初步探讨了人工载体生物膜在养殖过程中的 应用。实验期间水化因子结果显示实验池氨氮保持在o 2m g 1 水平以下，而对照 池同期在o 2m g 1 以上，尤其在4 月3 日后上升到1 2m g 1 ；水质综合指数实验 池在养殖过程中维持在1 左右，对照池逐渐增加至1 7 且仍然有上升的趋势。综 合分析表明实验池的水化因子变化较缓和，池塘水环境较稳定。而对照池的水化 因子变化较剧烈，水质综合指数随着养殖过程的继续持续上升，水环境不断恶化。 综合实验过程中鳗鲡的投饵率发现，表明了人工载体生物膜在减缓池塘环境中有 机物的累积、维持和稳定池塘环境方面起到了一定的作用，为养殖动物健康生长 提供了良好的水域环境。 关键词鳗池，p c r - d g g e 技术，生物膜，微生物多样性，水质 n j ：海海洋人学硕：t ：学位论文 0 a n a l y s i so ft h em i c r o b i a ld i v e r s i t ya s s o c i a t e dw i t hw a t e ra n d b i o f i l mi ne e lc u l t u r ep o n db a s e do np c r - d g g ef i n g e r p r i n t a b s t r a c t a sav a l u a b l ea q u a c u l t u r es p e c i e s ，e e li sn a m e da s “s o f tg o l d i nt h ew a t e ra n d b e c o m et h em a j o rf o r e i g nt r a d ea q u a c u l t u r es p e c i e si nc h i n a h o w e v e r , w i t ht h e e x p a n s i o no fc u l t u r ea r e aa n dt h ei n c r e a s i n go fs t o c k i n gd e n s i t ya n dt h ed e g r a d a t i o no f c u l t u r a le n v i r o n m e n t , as e r i e so fp r o b l e m sa lea r o u s e ds u c ha sd i s e a s es p r e a da n d e n v i r o n m e n tp o l l u t i o n a n dt h ed r u gr e s i d u ei ne e lb e c o m em o r ea n dm o r es e r i o u s a l l o ft h i sb e c a m et h e b o t t l e n e c k o ft h ec u l t u r eo fe e l s on e wh e a l t h ya n dh a r m l e s s t e c h n i q u e sa l en e e d e dt ob ee m p l o y e di na q u a c u l t u r ef o rd i s e a s ep r e v e n t i o na n d t r e a t m e n t t h i sp a p e ri n v e s t i g a t e st h em i c r o b i a ld i v e r s i t yo fp o n dw a t e ra n db i o f i l m a n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nw a t e rq u a l i t ya n dm i c r o b i a ld i v e r s i t yi n d e xi ne e lc u l t u r a l p o n d s t h ed a t ap r o v i d et h e o r e t i c a lb a s i so fa p p l y i n gt h et e c h n i q u e so fb i o f i l mt ot h e c u l t u r eo fe e la n dm a k ef u l lu s eo ft h em i c r o o r g a n i s mi n t h ec u l t u r ee n v i r o n m e n t 1a n a l y s i so f t h em i c r o b i a ld i v e r s i t yb e t w e e nw a t e ra n db i o f i l mi nt h ee e lp o n d s t h ee x p e r i m e n tw a sc o n d u c t e df r o ma u g u s tt od e c e m b e ri n2 0 0 7a tq i n g y u a n , o u a n g d o n gp r o v i n c e b i o - c a l t i e rw a si n t r o d u c e di n t o5s e m i - c l o s e dp o n d s ，a n dt h e m i c r o b i a ld i v e r s i t yb e t w e e nw a t e ra n db i o f i l mi nt h ep o n dw a sa n a l y z e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ea v c r a g cs i m i l a r i t yb e t w e e nw a t e ra n db i o f i l mi s6 5 4 ，t h em i c r o b i a l d i v e r s i t yo f w a t e ra n db i o f i l mw a si n c r e a s i n gi nt h ee a r l yp h r a s e , a n dt h e nt h em i c r o b i a l d i v e r s i t yd e g r a d e da c c o r d i n gt ot h ec u l t u r ep r o c e s s ，b u tt h ed e g r a d a t i o no fb i o f i l m m i c r o b i a ld i v e r s i t yw a ss l o w l yt h a nt h ew a t e rm i c r o b i a ld i v e r s i t y b ye o m p a l e dt h e d i f f e r e n c eb a n do fw a t e ra n db i o f i l m ，w ef o m l dt h es p e c i f i cb a n do fe a c hp o n dw a s6 ，3 ， 1 1 ，8 ，8 b yr e c l a i m i n ga n ds e q u e n c i n gs o m es p e c i f i cb a n d s ，6b a n d sw a sd e t e r m i n e db y i ! i 上海海洋大学硕二l j 学位论文 c o m p a r e dw i t ht h eg e n eb a n k ，a n dr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r e d o m i n a n ts p e c i e so nt h e b i o f i l mw a s ( a e u d o m o n a sl u b r i c a n s9 5 ) a n do t h e rt w ou n c u l t u r e ds p e c i e s ，a n d ( g a m m ap r o t e o b a c t e r i u m9 7 ) 。( e d w a r d s i e l l ai c t a l u r i9 4 ) ( h b h o8 7 ) i nt h e w a t e r a l t h o u g ht h es i m i l a r i t yi n d e xw a sc o m p a r a t i v e l yl o w ，i t t e l lt h ek i n d so f e n v i r o n m e n t a lm i c r o b e sa p p r o x i m a t e l y a n dt h eb i o d i v e r s i t yc h a n g i n gi nw a t e ra n d b i o f i l mw a st h er e s u l t so fc o - e f f e c tb e t w e e no n e - w a ya n dt w o w a yc h a n g e s t h eb i o f i l m c a nf o r m e di t ss p e c i f i ce c o s y s t e mt os l o wd o w nt h el o s i n go fm i c r o b i a ld i v e r s i t y c a u s e db ye n v i r o n m e n t a ld e g r a d a t i o n c o m b i n e dw i t ht h er e s u l t so fs e q u e n c i n gw ec a n c o m et ot h ec o n c l u s i o nt h a tt h eb i o f i l ma n dw a t e rh a st h e i rs p e c i f i cm i c r o b i a ls p e c i e s ， a n di ts h o w e dt h a tt h eb i o f i l mc a ni n c r e a s et h eg e n e r a lm i c r o b i a ld i v e r s i 哆i nt h ep o n d 2a n a l y s i so ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nw a t e rq u a l i t ya n db i o f i l mm i c r o b i a ld i v e r s i t yi n t h ee e lp o n d s t h ew a t e rq u a l i t yi n d e xw a sc o n s t r u c t e db yc o m b i n i n gp h ，n i t r i t ew i t hn i t r a t e t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nm i c r o b i a ld i v e r s i t yi n d e xa n dw a t e rc h e m i c a lf a c t o r s ；t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nw a t e rq u a l i t yi n d e xa n dm i c r o b i a ld i v e r s i t yi n d e xo fw a t e ra n d b i o f i l m ；a n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nw a t e rq u a l i t yi n d e xc o e f f i c i e n t so fv a r i a t i o no f b a n d sw e r ea n a l y z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tw a t e rq u a l i t yi n d e xw a si n c r e a s e d a c c o r d i n g t ot h ec u l t u r ep r o c e s s t h e r ew a sas i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o nb e t w e e nm i c r o b i a l d i v e r s i t yi n d e xa n dt h ep h ，w a t e rt e m p e r a t u r e ，t h e i r r e l a t i o n e q u a t i o n w a sy - - 6 6 6 4 8 l n ( x ) + 1 6 1 5 9 ( r 2 = 0 4 6 1 2 ) ，a n dy = 0 0 3 0 7 x + 2 2 4 9 7 ( 1 r = o 4 0 8 1 ) w a t e rq u a l i t yi n d e xa n dm i c r o b i a ld i v e r s i t yi n d e xo fw a t e rw a ss i g n i f i c a n t l y c o r r e l a t i o ny = 0 7 7 3 7 l n ( x ) + 3 1 0 3 6r = 0 4 1 8 ( p o 0 s ) a n dt h em i c r o b i a l d i v e r s i t yo f b i o f i l mi n d e xh a v eas i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o nw i t hw a t e rq u a l i t yi n d e x y = 0 8 2 8 l n ( x ) + 3 0 6 9 4r = 0 4 8 9 ( p o o o ，w h i l et h er e l a t i o n s h i p w a sn o t s i g n i f i c a n t l yb e t w e e nt h ec o e f f i c i e n to fv a r i a t i o no fw a t e ra n db a n d a n a l y s i ss h o w e dt h a ta q u a c u l t u r ee n v i r o n m e n tt e m p e r a t u r ea n dp hh a sag r e a ti m p a c t o nt h ee n v i r o n m e n t a lm i c r o o r g a n i s m ，t h ed e g r a d a t i o no fw a t e rq u a l i t yw i l ls t i m u l a t e t h eg r o w t ho fs o m eb a c t e r i a , a n dt h i st y p eo fg r o w t hw i l ll a go ft h ed e g r a d a t i o no f w a t e rq u a l i t y 3t h ee f f e c to fb i o f i l mo nt h ee n v i r o n m e n to fe e lc u l t u r ep o n d t h i sp a p e rs m d i e dt h ea p p l i c a t i o no fb i o f i l mi nt h ee e lp o n d ，b ye m p l o y e d12 0 0 m z b i o c a r r i e rt ot h ep o n da c c o r d i n gt ot h er a t i oo fl ：6 t h er e s u l t ss h o w st h a tt h ec h a n g eo f w a t e rf 撕。璐i nt h ee x p e r i m e n tp o n dw a sc o m p a r a t i v e l ys l o w ，a n dt h ew h o l ew a t e r i v 上海海洋大学硕士学位论文 e n v i r o n m e n tw a ss t a b l e b yc o n t r a r i e s ，t h ec h a n g eo fw a t e rf a c t o r si nt h ec o n t r o lp o n d w a sv i g o r o u s ，t h ew a t e rq u a l i t yi n d e xo ft h ec o n t r o lp o n dw a si n c r e a s e dp e r s i s t e n t l y a l o n gw i t ht h eb r e e d i n gp r o c e s s ，a n df i n a l l yt h ew a t e re n v i r o n m e n tw a sd e g r a d e d o n t h eo t h e rh a n d ，t h er e s u l t so ff e e d i n gr a t es h o w e dt h a tt h eb i o f i l mc a np r o m o t et h e g r o w t ho f e e lb ys t a b l i n gt h ew a t e re n v i r o n m e n t k e yw o r d s ：e e lc u l t u r ep o n d , p c r - d g g e ，b i o f i l m ，m i c r o b i a ld i v e r s i t y ，w a t e rq u a l i t y v 上海海洋大学硕士学位论文 目录 鳗池水体和生物膜中微生物的d g g e 分子指纹分析i 摘要i a b s t r a c t i i i 第一章引言l 1 鳗鲡的养殖现状1 1 1 鳗鲡养殖概况1 1 2 病害防治过程中存在的问题2 1 3 鳗鲡病害防治研究进展3 2 微生物多样性同水产养殖的关系3 2 1 微生物多样性3 2 1 1 微生物物种的多样性4 2 1 2 微生物遗传多样性4 2 1 3 微生物代谢类型多样性4 2 1 4 微生物生态类型多样性4 2 2 养殖池塘环境的特点4 2 3 微生物在养殖环境中的作用5 3 生物膜的研究进展6 3 1 生物膜的形成6 3 2 生物膜的形态和结构8 3 3 生物膜中微生物的种群分布特征8 3 4 环境因子对生物膜形成的影响9 3 5 生物膜的功能研究9 4p c r - d g g e 技术的研究进展1 0 4 1d g g e 技术的基本原理1 1 4 2d g g e 技术在养殖环境微生物多样性检测中的应用1 l 4 2 1 鱼体细菌多样性分析1 2 4 2 2 水体中细菌多样性分析1 3 4 3d g g e 技术自身存在的不足1 4 5 研究思路1 6 第二章鳗鲡养殖过程中生物膜和水体微生物多样性关系分析1 7 l 材料与方法1 7 1 1 材料1 7 1 1 1 实验池塘基本情况1 7 1 1 2 生物基载体1 8 上海海洋大学硕士学位论文 1 1 3 仪器1 8 仪器1 8 1 1 4 试剂1 8 1 2 方法2 0 1 2 1 样品采集2 0 1 2 2 样品前处理及d n a 提取2 0 1 2 3p c r 扩增2 1 1 2 4p c r 产物的纯化2 1 1 2 5 变性梯度凝胶电泳2 1 1 2 6 银染2 l 1 2 7 目的条带的回收2 2 1 2 8 测序及序列分析2 2 2 结果与分析2 2 2 1 样品d n a 的提取2 2 2 2 目的片段的扩增2 3 2 3 变性梯度凝胶电泳分析2 3 2 3 1 水体与生物膜微生物多样性关系分析2 6 2 3 2 水体与生物膜微生物多样性在养殖过程中的变化2 8 2 3 3 水体与生物膜微生物优势条带差异分析2 9 2 3 4 生物基上微生物的立体分布3 0 2 4 差异性条带回收及测序3 l 3 讨论3 2 3 1d n a 提取及p c r 扩增3 2 3 2 样品微生物多样性分析3 3 4 小结3 4 第三章鳗池微生物多样性与水质关系的初步研究3 5 l 材料和方法3 5 1 1 实验池塘基本情况3 5 1 2 载体材料3 5 1 3 微生物样品的采集3 5 1 4 水质理化因子的测定3 6 1 5 微生物多样性指数的计算3 6 1 6 水质综合评价指数3 6 1 6 数据分析3 6 2 结果与分析3 6 2 1 微生物多样性指数3 6 2 2 水质理化因子3 7 2 3 微生物多样性与水质关系分析3 8 2 3 1 微生物多样性与各水质理化因子关系3 9 2 3 2 微生物多样性与水质综合指数的关系4 0 h 上海海洋大学硕士学位论文 2 4 水质综合指数与样品电泳条带特性平均值的关系4 1 2 5 水质综合指数变异系数与样品电泳条带特性数变异系数的关系4 2 3 讨论4 4 3 1 鳗鲡池塘水环境的特征4 4 3 2 鳗鲡池塘微生物多样性与水化因子关系4 5 第四章人工载体生物膜对鳗鲡养殖水环境的影响4 7 l 材料和方法4 7 1 1 池塘背景4 7 1 2 人工生物基载体4 8 1 3理化因子测定4 8 1 4 水质综合指数的建立4 8 1 5 数据分析4 8 2 结果与分析4 8 2 1 水质理化因子4 8 2 2 鳗鲡养殖情况5 0 3 分析与讨论5 1 全文总结5 3 参考文献5 5 致谢5 8 i i i 上海海洋人学硕：i ：学位论文 心 1 鳗鲡的养殖现状 第一章引言 鳗鲡，属鳗鲡目( a n g u i l l i f o r m e s ) ，鳗鲡科( a n g u i l l i d a e ) ，鳗鲡属( a n g u i l l a ) 。 其肉味鲜美，在我国各海区均有分布，是名贵的海产食用鱼类素有水中软黄金之 称。自从八十年代开始，中国逐渐成为世界上最大的鳗鲡生产国家，养殖面积近1 万公顷，年实际产量约1 2 - 1 3 万吨，占世界产量的2 3 左右，成为单项出口创汇最 高的水产品之一l 别。 1 1 鳗鲡养殖概况 我国是世界上最早进行人工养殖鳗鲡的国家之一，早在上世纪7 0 年代初即已 开始养殖，到目前为止已有3 0 多年的历史。1 9 7 2 年前后在广东、福建等南部省份 通过开展补偿贸易与外商合作开始我国的鳗鲡养殖生产。主要经营鳗苗出口，此 时养殖业发展速度缓慢。1 9 7 4 年全国共捕捞鳗苗4 0 余吨，总投苗1 0 0 0 万尾左右， 当年出口成鳗1 0 0 吨左右，而其中养殖鳗鲡只有1 0 多吨。直到1 9 8 4 年底，全国养 殖鳗鲡的产量仅为3 0 0 吨左右，此阶段为起步阶段。1 9 8 5 年水产品划为三类产品， 实行市场调节，我国的鳗鲡养殖业进入调整发展阶段。1 9 8 5 年底全国鳗鲡养殖面 积1 5 4 5 公顷、温室面积1 3 万m 2 ，1 9 8 6 年增加到1 3 6 6 公顷、温室面积1 4 万m 2 。逐 步实现了从鳗苗出口向成鳗、以及烤鳗等加工品出口的转变。随后中国鳗鲡的养 殖进入了蓬勃发展的阶段，大陆养鳗业从1 9 9 0 年的总产量不到1 5 万t ，发展到 2 0 0 1 年1 7 万t ，约占世界总产量的7 0 ，出口1 2 万t ，创汇8 亿美元，占世界鳗鱼 贸易额的8 0 以上，其中1 9 9 6 年度出口量达6 6 万t 占日本市鳗鲡供应量的 5 7 9 ，实际出口数占日本进口鳗鱼数量的9 0 左右。此外国内鳗鲡消费量近4 万吨，1 9 9 6 年的产量已达到1 1 1 5 万吨。1 9 9 7 年养殖规模仍在不断扩大，随着非 日本鳗鲡的开发成功，各地大量投放非日本鳗进行养殖，总投苗量超过1 0 亿尾门1 。 但随着消费者对于食品安全的关注程度不断提高，对中国鳗鲡提出了更高的要 求。由于药物残留问题使得2 0 0 3 年出口到日本的烤鳗只有4 0 2 9 9 吨，比2 0 0 2 年的 5 5 7 0 5 吨减少2 7 7 。 早期鳗鲡养殖模式为水泥精养池为主。在鳗鲡养殖快速发展期，鳗鲡养殖工 作者开始探索不同的养殖模式，如土池养殖欧洲鳗鲡，水库网箱、海水网箱养殖 鳗鲡，半咸水土池单、混养鳗鲡。现发展良好的模式为欧洲鳗鲡的土池养殖，于 上海海洋大学硕士学位论文 福建、广东均取得了良好效果，养殖规模不断扩大，并在向江西、安徽等省份延 伸。 1 2 病害防治过程中存在的问题 养殖过程中疾病的发生是由环境因素、病原体、养殖动物三方面因素共同作 用的结果，其中养殖环境成为最基本、最主要的因素。目前，随着鳗鲡的养殖模 式集约化程度的提高和养殖密度的增加，养殖过程中出现的病害等问题日益严 重。常见的疾病可以分为细菌性疾病、寄生虫病、病毒性疾病以及由于环境、营 养及药物引起的疾病。细菌病为限制鳗鲡养殖发展最为严重的疾病，表现为发病 率高、传染性强，呈区域性传染经常导致较高的死亡率，从而引起重大经济损失。 比较常见的有爱德华氏菌病、弧菌病、赤鳍病、赤点病、烂鳃病。近几年在欧洲 鳗鲡、美洲鳗鲡中新发现红头病、脱粘病、败血症。如红头病的病原体为鲁氏不 动杆菌。其中部分病害的病原菌已经得到确定如脱粘病的病原体为非0 1 群霍乱弧 菌：败血症的病原体为温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌引起；爱德华氏菌病由迟钝 爱德华氏菌引起等。此外常见的寄生虫病也显得日益严重，如车轮虫、小瓜虫、 孢子虫、杯体虫、指环虫、三代虫等，寄生虫的流行季节性明显，危害程度各异。 统计表明养殖过程中车轮虫感染率达2 3 2 4 ，粘孢子虫达2 2 0 4 ，小瓜虫达 1 7 3 9 。关于病毒性疾病的病原体研究，有报道表明鳗冠状病毒或鳗冠状病毒 样病毒引起欧洲鳗鲡的狂游性死亡症，弹状病毒于狂游性死亡症鳗鲡的脑部亦有 发现等。鳗鲡病毒性疾病报道较少，但也是养殖过程中潜在的危害。 由于渔药研发能力相对较弱，尤其是渔用化学药物主要为仿制、改进，大部 分渔药直接或间接地来源于人药、兽药或农药。专用渔药种类少，对禁用渔药替 代品的研究未能及时跟上，导致禁用渔药继续使用的现象仍然存在，如孔雀石绿。 随着耐药菌的大量出现，抗生素的研制速度已无法解决日趋复杂的耐药性问题。 在较长的一段时间里病害的防治过分依赖孔雀石绿等药效好但残留问题严 重而且对人体危害较大的药物，使得水产品品质大为下降。随着人们对食品安全 问题的关注程度越高，近年来我国的鳗鲡出口在短时间内连续遭遇食品安全卫生 壁垒，其中药物残留是最突出、最根本的问题。2 0 0 2 年日本多次从我国出口烤鳗 中检测出汞、磺胺类等抗生素药残超标。2 0 0 3 年7 月，受恩诺沙星药残事件的影 响，日本对我输同鳗鲡实行“命令检查 ，我国鳗鲡对同出口几乎陷人停顿。2 0 0 5 年8 月，厚生省公布了大阪检疫所、神户检疫所分别检出中国烤鳗含有孔雀石绿。 2 0 0 6 年5 月起日本将正式实施食品中残留农药、兽药及饲料添加剂“肯定列表” 制度。日本制定暂定最大残留限量标准的化合物草案涉及到农业化学品达7 3 4 种， 2 上海海洋人学硕士学位论文 其中与养殖鳗鲡有关的有7 3 种，使得我国鳗鲡行业处于艰难的求生存处境。 1 3 鳗鲡病害防治研究进展 如何尽快提高我国的水产品质量安全管理水平，应对入世挑战，更好地满足 消费者对食品质量安全的需要，适应我国渔业持续快速增长和市场竞争的要求， 是当前和今后相当长时期内迫切要解决的一个重大课题。针对以上问题从2 0 0 2 年开始，我国病害研究开始注重无公害病害控制技术的发展。在免疫学研究方面， 创伤弧菌的灭活疫苗和亚单位疫苗，温和气单胞菌的抗独特型抗体疫苗现已有相 关研究。许斌福等通过制备创伤弧菌i s c o m 疫苗免疫鳗鲡证明可以产生较好的 免疫保护力忙3 。嗜水气单胞菌已有批准文号的疫苗，爱德华氏菌、鳗弧菌的抗独 特型抗体疫苗已取得中试批文。小瓜虫的免疫学研究取得有效进展。在生物控制 技术方面，益生菌在鳗鲡养殖中已得到广泛应用，如光合细菌、芽孢杆菌控制养 殖水质。蛭弧菌于养殖水体和水蚯蚓应用，乳酸杆菌、芽孢杆菌、粪链球菌作为 饲料添加剂的应用。由养殖鳗鲡肠道分离原寄益生菌在控制肠道菌群失调、提高 投饵量和饲料转换率方面均取得了良好效果。在药物代谢动力学方面，土霉素、 磺胺甲嚯唑、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氟苯尼考在鳗鲡体内的代谢和残 留研究均已完成。 鳗鲡病害的防治的研究传统上均以病原微生物的角度着手，进而研究控制这 些病原的药物以便进行防治，很大程度上忽略了环境本身的制约因素。面对 肯 定列表，传统的药物防治显然已经满足不了新形势的要求。在鳗鲡养殖环境的 生态体系中，环境微生物生态是整个生态的基础。因此，从环境角度入手，为鳗 鲡养殖提供一个安全、健康、不生病、少生病的养殖环境，是鳗鲡健康养殖的根 本出路。 2 微生物多样性同水产养殖的关系 2 1 微生物多样性 由于微生物多样性自身的特点以及当前研究的手段，决定了当前微生物多样 性的研究通常集中在以下的几个水平，即分类多样性( t a x o n o m i cd i v 盯s i t y ) 、功能 多样性( f u n c t i o n a ld i v e r s i t y ) 、遗传多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 和系统发育多样性 ( p h y l o g e n e t i cd i v e r s i t y ) 上海海洋大学硕士学位论文 2 1 1 微生物物种的多样性 微生物不仅种数多，且个体数量也非常之大。由于微生物鉴定的困难，仅就 目前发现并被初步开发的微生物资源从种数上讲不超过1 ，如土壤中目前约有 9 0 的微生物还无法在实验室中加以培养鉴定。目前已知种数大约为1 0 万种，随 着分离、培养方法的改进和研究工作的深入，微生物多样性将会进一步得到拓展。 2 1 2 微生物遗传多样性 生物多样性，本质上是由于遗传物质的碱基排列顺序和组成核酸分子的碱基 数量所决定。d n a 碱基排列顺序的不同，导致了物种之间的差异。其次构成微生 物的主要遗传物质除d n a 分子双链结构外，还存在单链d n a 、双链r n a 、和单链 r n a 等形式。此外微生物特有的基因重组方式，对加强微生物之间的基因交流， 对于微生物遗传多样性的扩展具有重要作用 2 1 3 微生物代谢类型多样性 从营养代谢类型看，主要由光能自养型、光能异养型、化能自养性和化能异 养型4 种类型组成。如光能自养型包括不产氧型光合作用、产氧型光合作用、嗜 盐紫膜菌型光合作用。化能异养型中，包括发酵、无氧呼吸、有氧呼吸等不同生 物氧化形式及诸多代谢途径产能。 2 1 4 微生物生态类型多样性 微生物是自然界中分布最广的一个类群，其种类多、数量大，甚至在极端环境 下也可找到微生物的踪迹。微生物对温度、p h 值、渗透压和大气压等的适应范 围极广，如极嗜热菌可在高温1l o c 的水域中生存，极嗜碱菌可在p h 值大于1 1 的 环境中生存。微生物与生物环境之间的关系也有其多样性，如互生、共生、共栖、 寄生、捕食和拮抗等。 讳 2 2 养殖池塘环境的特点 我国水产养殖生产特别是池塘环境基本上是静水、不排污，以投饵为主的养 殖模式。残饵、粪便、水生动植物尸体等富营养因子共存于一个水体，使池塘环 境中有机物得到迅速积累。且大部分养殖地区养殖品种过于单一、养殖密度的不 断增加，致使养殖区域的水体不断恶化池塘自净与调节能力不断降低，逐渐形成 4 上海海洋大学硕士学位论文 连作障碍。病原微生物种类和数量上升，养殖环境恶化导致鱼虾病害频频发生， 严重影响着水产养殖业的发展。 养殖水体生态系统是人工控制的小生态系统，包括非生物环境、生产者、消 费者、分解者4 种基本成分。但在人类控制和影响下，其结构和功能又有其独特 性。养殖水体中有机物来源可分为外部来源和内部来源。外部来源主要是施肥、 投饵带入的有机物，有研究发现即使在管理良好的池中，投喂的饲料也只有7 5 一8 0 为对虾所食用，而在这些提供给对虾食用的饲料中，则仅有一半或少于 一半的营养物质供给对虾的生长，一半以上的物质则变成各种有机废物排入养殖 池中。内部来源主要包括溶解有机物和颗粒有机物，浮游植物分泌作用产生的有 机物、生物残骸和分解产生的有机物，养殖动物的排泄物和絮凝作用形成的颗粒 有机物。实验显示，随着养殖时间的延长，自身污染程度越来越严重，还发现旧 虾池的有机物自污速度明显高于新虾池。 养殖过程中疫苗、激素、色素、麻醉剂和水质调节产品等药物的应用，使药 物直接或通过代谢排入水中，或通过未食饲料散失。c