（临床检验诊断学专业论文）人巨细胞病毒编码的il10剪接体的克隆及表达.pdf

温州医学院硕十学位论文 l i i iiiit i i iii i i ii iiil 17 4 5 3 6 5 目录 中文摘要2 英文摘要5 前言8 材料与方法1 0 实验材料1 0 实验方法1 4 结果2 9 讨论3 7 ，j 、结：3 9 参考文献4 0 附录4 3 致谢4 6 综述：人巨细胞病毒编码的i l - 1o 剪接体的研究进展4 7 温州医学院硕十学位论文 人巨细胞病毒编码的i i _ - 10 剪接体的克隆及表达 中文摘要 目的： 为了研究人巨细胞病毒( h c m v ) 编码的白细胞介素1 0 剪接体( c y t o m e g a l o v i r u s i n t e r l e u k i n 1 0 ，c m v l l 1 0 和l a t e n c ya s s o c i a t e dc m v l l - 1 0 ，l a c m v l l 1 0 ) 在h c m v 潜 伏及再激活感染中的作用，构建了c m v l l - 1 0 和l a c m v l l - 1 0 基因的原核表达体系， 并制备了其特异性抗血清。本研究将为更深入的研究c m v l l - 1 0 和l a c m v l l 1 0 的 功能及在h c m v 感染中的作用奠定基础，进而为阐明h c m v 潜伏感染及再激活的 机制提供新的思路。 方法： 1 、h c m v 基因组d n a 提取、c m v l l 1 0 基因的p c r 扩增、克隆载体的构建及序 列测定 收集h c m v 感染患儿尿液标本提取病毒基因组d n a ，利用重霍延伸p c r 的方 法，以提取的病毒d n a 为模板，扩增c m v l l - 1 0 完整的基因，将其克隆, n p m d l 8 t s i m p l ev e c t o r 中构建重组了p m d l 8 t c m v l l 一1 0 ，并用限制性内切酶酶切和测序鉴 定重组予。 2 、l a c m v l l 1 0 基因p c r 扩增、克隆载体的构建及序列测定 以重组予p m d l 8 t c m v l l - l o 为模板，扩增l a c m v l l 1 0 基因，将其克隆入 p m d l 8 一ts i m p l ev e c t o r 中构建重组子p m d l 8 - t l a c m v l l 一1 0 ，并用限制性内切酶酶 切和测序鉴定重组子。 3 、原核重组了p m a l c 2 x c m v l l 一1 0 并t l p m a l c 2 x l a c m v l l 1 0 表达载体的构建及鉴 定 分别以e c o ri 脚，z d i i i 双酶切p m d l 8 一t c m v l l 1 0 和p m d l 8 t l a c m v l l 1 0 ， 将5 2 8b p 和4 2 0b p 的酶切片段克隆至p m a l c 2 x 的e c o ri 脚以d i i i 位点，转化感受 态受体菌e c o l id h 5 a ，并酶切鉴定。 4 、c m v l l - l o 和l 气c m v l l 1 0 重组蛋白的诱导表达及纯化 将重组表达质粒p m a l c 2 x c m v l l 1 0 和p m a l c 2 x l a c m v l l - l o 转化到感受态 受体菌ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，经i p t g 诱导表达目的蛋白，目的蛋白利用 a m y l o s e r e s i n 亲和层析柱进行纯化，并经s d s p a g e 电泳分析。 2 温州医学院硕士学位论文 5 、c m v l l - 1 0 和l a c m v l l - 1 0 抗血清的制备及鉴定 将纯化后的p m a l c 2 x c m v l l - 1 0 和p m a l c 2 x - l a - c m v l l - 1 0 表达蛋白免疫家兔 制备多克隆抗血清，并用w e s t e r nb l o t 鉴定。 结果： 1 、h c m v 基因组d n a 提取、c m v l l - 1 0 基因的p c r 扩增、克隆载体的构建及序 列测定 应用重叠延伸p c r 扩增出5 2 8 b p 的c m v l l - 1 0 基因片段，重组子 p m d l 8 t c m v l l - 1 0 经e c o ri 所甩d i i i 双酶切鉴定及测序分析，结果显示与h c m v a d l 6 9 株c m v l l 1 0 序列一致。 2 、l a c m v l l 1 0 基因p c r 扩增、克隆载体的构建及序列测定 以p m d l 8 t c m v l l - 1 0 质粒为模板经p c r 扩增出4 2 0b p 的l a c m v l l 1 0 基因 片段，重组予p m d l 8 t l a c m v l l - 1 0 经e c d ri 用锄d i i i 双酶切鉴定及测序分析，结 果显示与h c m va d l 6 9 株l 气c m v l l 1 0 序列一致。 3 、原核重组- t p m a l c 2 x c m v l l 1 0 和p m a l c 2 x l 气一c m v l l 1 0 表达载体的构建及鉴 定 原核重组了p m a l c 2 x c m v l l 1 0 和p m a l c 2 x l a c m v l l 。1 0 分别经e c o ri h i n d i i i 双酶切，电泳显示约5 2 8 b p ，4 2 0 b p 处呈现明显条带，表明p m a l c 2 x c m v l l 1 0 和p m a l c 2 x l 气一c m v l l - 1 0 原核表达载体构建成功。 4 、c m v l l 1 0 和l a c m v l l - 1 0 重组菌的诱导表达及纯化 用i p t g 诱导重组蛋白表达，结果显示0 5m m o l li p t g 在3 7 诱导5h 能有效 地诱导重组蛋白的表达，利用a m y l o s e r e s i n 亲和层析柱纯化目的蛋白，s d s p a g e 电泳分析目的蛋白大小为6 2 5 k d a , u s 8 3 k d a ，结果与预期吻合。 5 、c m v l l - 1 0 和l a c m v l l - 1 0 抗血清的制备及鉴定 将纯化后的p m a l c 2 x c m v l l - 1 0 和p m a l c 2 x l a c m v l l - 1 0 重组蛋白免疫家兔， 制备多克隆抗血清，经w e s t e mb l o t 证实，所制备的多克隆抗血清能与重组蛋白发 牛特异性反应。 结论： 。 本实验成功建立了c m v l l - 1 0 和l a - c m v l l - 1 0 的原核表达体系，纯化表达产物， 将此产物免疫家兔，获得特异性抗血清。经w e s t e r nb l o t 鉴定所表达的融合蛋白具 有良好的抗原性和免疫反应性，为进一步深入研究h c m v 编码的i l 1 0 剪接体功能 3 温州医学院硕士学位论文 及作用打下了坚实的基础。 关键词： 人巨细胞病毒；白细胞介素1 0 ；克隆；原核表达；多克隆抗血清； 4 温州医学院硕七学位论文 c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fc e l l u l a ri n t e r l e u k i n - 1 0s p l i c i n g e n c o d e db yh u m a nc y t o m e g a l o v i r u s o b j g e c t i v e ： t op r o v i d e dd a t aa n dm a t e r i a lf o rt h ef u t u r es t u d yo nt h ep a t h o g e n i cm e c h a n i s mo f i n t e r l e u k i n - 1 0 s p l i c i n g ( c m v i l - 1 0 a n d l a - - c m v l l - 1 0 ) e n c o d e d b y h u m a n c y t o m e g a l o v i r u si nt h ev i r a ll a t e n ta n dr e a c t i v a t ei n f e c t i o n w ec o n s t r u c t e dp r o k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o r a b o u tc m v l l - 1 0a n dl a - c m v l l - l og e n e a n dw eh a v ep r e p a r e s p e c i f i c i t yp o l y c l o n a la n t i s e r u m t h e nl a yt h ef o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rr e s e a r c ha b o u t t h ef u n c t i o no ft h ec m v l l 1 0a n dl a - c m v i l - 1 0d u r i n gt h ev i r u si n f e c t i o n t op r o v i d e n e wi d e a sf o rt h ep a t h o g e n e s i si nt h ev i r a l l a t e n ta n dr e a c t i v a t ei n f e c t i o n m e t h o d s ： 1 e x t r a c t i n gt h eh c m vg e n o m i cd n a ，a m p l i f yt h ec m v l l 一1 0g e n e ，c o n s t r u c t e da n d i d e n t i f i e dt h ec l o n i n gv e c t o ra b o u tc m v l l 10 w ee x t r a c t e dv i r u sd n af r o mt h ep o s i t i v eu r i n es p e c i m e n so ft h ep a t i e n t s ，o v e r l a p e x t e n s i o np c rw a sa p p l i e dt oa m p l i f yt h ec m v l l - 1 0 p c rp r o d u c t sw e r ec l o n e di n t ot h e p m d l 8 - ts i m p l e v e c t o rt oc o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n tp l a s m i d p m d l 8 一t - c m v l l 一1 0 d o u b l e e n z y m ed i g e s t e db yt h er e s t r i c t i o ne n z y m e sa n ds e q u e n c e dt oc o n f i r mt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i d 2 a m p l i f ya n di d e n t i f i e dt h el a c m v l l - 1 0g e n e a m p l i f y t h el a c m v l l - 1 0 g e n eu s i n g t h er e c o m b i n a n t p l a s m i d p m d l 8 一t - c m v l l - 1 0 p c rp r o d u c t sw e r ec l o n e di n t ot h ep m d l 8 一ts i m p l ev e c t o rt o c o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n tp l a s m i dp m d l 8 一t i 。a - c m v l l - 1 0 d o u b l e e n z y m ed i g e s t e db y t h er e s t r i c t i o ne n z y m e sa n ds e q u e n c e dt oc o n f i r mt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d 3 c o n s t r u c t e dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ra n di d e n t i f i e dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p m a l - c 2 x c m v l l 1 0a n dp m a l c 2 x l a - c m v l l - 1 0 t h ep l a s m i dp m d l 8 一t - c m v l l - l oa n dp m d l 8 一t 1 a - c m v l l - 1 0w e r er e s p e c t i v e l y 5 温州医学院硕士学位论文 d i g e s t e dw i t ht w or e s t r i c t i o ne n z y m e se c o ria n dh i n d l i i ，t h er e s u l t a n tf r a g m e n tw e r e l i n k e dt h ep m a l c 2 xw h i c hd i g e s t e dw i t ht h es a m et w or e s t r i c t i o n e n z y m e s t h e r e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp m a l - c 2 x c m v l l - 1 0a n dp m a l c 2 x l a - c m v l l - 1 0w a s t r a n s f o r m e di n t oe c o l is t r a i nd h 5 a d o u b l e e n z y m ed i g e s t e db yt h er e s t r i c t i o ne n z y m e s t oc o n f i r mt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d 4 e x p r e s s i o n a n d p u r i f i c a t i o n o ft h er e c o m b i n a n t p r o t e i n a b o u tc m v l l 一1 0a n d l a c m v l l 1 0 t h er e c o m b i n a n t e x p r e s s i o n v e c t o r p m a l c 2 x - c m v l l - 1 0 a n d c 2 x - l a - c m v l l - 1 0w a st r a n s f o r m e di n t o e c o l is t r a i nb l 2 1 p m a l b y i s o p r o p y l p - d - t h i o g a l a g t o s i d e ( i p t g ) i n d u c t i o n ，o u rp r o t e i nw a se x p r e s s e di ne c o l i a n d u s i n gt h ea m y l o s e r e s i na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yc o l u m n t o p u r i f y t h e p r o t e i n s ，a n da n a l y s e db ys d s - p a g e 5 p r e p a r a t i o na n da n a l y s i st h ep o l y c l o n a la n t i s e r u ma b o u tc m v l l - 1 0a n dl a - c m v l l - 1 0 t h ep u r i f i e dr e c o m b i n a n tp r o t e i nw a su s e dt oi m m u n et h er a b b i tf o rp r e p a r i n g s p e c i f i c i t yp o l y c l o n a la n t i s e r u m t h ei m m u n i t yo ft h ep o l y c l o n a la n t i s e r u mw a s c o n f i r m e db yw e s t e r nb l o t r e s u l t s ： 1 e x t r a c t i n gt h eh c m vg e n o m i cd n a ，a m p l i f yt h ec m v l l 一1 0g e n e ，c o n s t r u c t e da n d i d e n t i f i e dt h ec l o n i n gv e c t o ra b o u tc m v l l 一1 0 t h ec m v l l - 1 0 ( 5 2 8 b p ) f r a g m e n tw e r es u c c e s s f u l l y a m p l i f i e df r o mt h eh c m v g e n o m i cd n ab yo v e r l a pe x t e n s i o np c r t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp m d 18 一t - c m v l l - 1 0 d i g e s t e db y t h er e s t r i c t i o n e n z y m e sa n ds e q u e n c e dc o n f i r mt h a tt h es e q u e n c e sw a s c o n s i s t e n tw i t ht h ea d l 6 9s t r a i np u b l i s h e di ng e n e b a n k 2 a m p l i f yt h el a - c m v l l - 1 0g e n e ，c o n s t r u c t e da n di d e n t i f i e dt h ec l o n i n gv e c t o ra b o u t l a c m v i l 1 0 t h el a - c m v l l - 1 0 f r a g m e n t ( 4 2 0 b p ) w e r es u c c e s s f u l l ya m p l i f i e d f r o m p m d l 8 - t - c m v l l - 1 0 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp m d l 8 一t i 。a c m v l l - 1 0d i g e s t e db yt h e r e s t r i c t i o ne n z y m e sa n ds e q u e n c e dc o n f i r mt h a tt h es e q u e n c e sw a sc o n s i s t e n tw i t ht h e 6 a d l6 9s t r a i np u b l i s h e di ng e n e b a n k 3 c o n s t r u c t e dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ra n di d e n t i f i e d t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p m a l c 2 x c m v l l 一1 0a n dp m a l c 2 x l a c m v l l - 1 0 t h er e s u i to fd o u b l e e n z y m ed i g e s t i o nb yt h er e s t r i c t i o ne n z y m e s e c o ria n dh nd i i i i n d i c a t e d t h a tt h er e c o m b i n a n t p l a s m i d p m a l - c 2 x c m v l l - 1 0 a n d p m a l c 2 x l a c m v l l - 1 0w a s c o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y 4 e x p r e s s i o n a n dp u r i f i c a t i o no ft h e r e c o m b i n a n tp r o t e i na b o u tc m v l l - 1 0 a n d l a c m v l l 1 0 t l l l er e c o m b i n a n tp r o t e i ni n d u c e db yi p t gs h o w nt h a t i tw a sa b l et oe f f i c i e n t l y e x p r e s st h er e c o m b i n a n tp r o t e i n a t3 7 c ，0 5m m o l li p t gf o r5h o u r si n e c o 厅 b l 2 1 ( d e 3 ) u s i n gt h ea m y l o s e r e s i n a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y c o l u m nt op u 1 f y 。h e p r o t e i n s ，s d s p a g ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h es i z eo f t h er e c o m b i n a n tp r o t e i n ( 6 2 5 k d a a n d5 8 3 k d a ) i sc o n s i s t e n tw i t ht h ea n t i c i p a t i o n 5 p r e p a r a t i o na n da n a l y s i st h ep o l y c l o n a la n t i s e r u ma b o u t c m v l l - 1 0a n dl a - c m v l l - 1 0 t h e p u r i f i e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n o f p m a l c 2 x c m v l l 一1 0 a n d p m a l c 2 x l a c m v i l - 1 0 w a su s e dt 。i m m u n et h er a b b i t f o r p r e p a r i n gs p e c i f i c i t y p 。l y c l 。n a la n t i s e r u m w e s t e l 1 1b l o tw a s s h o w nt h a tt h es p e c i f i ca n t i s e r u mc o u l dc 。m b i n e w i t hc m v i l 1 0a n dl a c m v l l 1 0r e c o m b i n a n tp r o t e i n c o n c l u s i o n ： w e s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n v e c t o ro ft h ec m v l l - 1 0a n dl a 。 c m v i l - 1 0g e n e t h ep u r i f i e dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o np r o t e i n w a su s e dt oi m m u n et h e r a b b i tf o rp r e p a r i n gs p e c i f i c i t yp o l y c l o n a la n t i s e r u m t h ee x p r e s s e df u s i o np r o t e i n h a v e s a t i s f a c t o r yi m m u n o r e a c t i v i t ya n da n t i g e n i c i t y t h a t w i l le s t a b l i s haf o u n d a t i o nf o rt h e f u n h e rr e s e a r c ha b o u tt h ei n t e r l e u k i n 1 0s p l i c i n ge n c o d e db yh u m a nc y t o m e g a l o v i r u s k e yw o r d s ： h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s ；i n t e r l e u k i n - 1 0 ；c l o n i n g ；p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n ； p o l y c l o n a la n t i s e r u m ； 7 温州医学院硕士学位论文 人巨细胞病毒编码的ik - 10 剪接体的克隆及表达 刖 百 人巨细胞病毒( h u m a nc y t o m e g a l o v i r u s ，h c m v ) 是疱疹病毒科b 亚科中基因组最 大的d n a 病毒，所编码的蛋白质超过2 2 7 种，具有种属特异性【1 1 。1 9 5 6 年，从死于巨 细胞包涵体病的婴儿唾液腺中首次分离到h c m v ，当时称之为唾液腺包涵体病毒或 巨细胞包涵体病毒。1 9 6 0 年，w e l l e r 等鉴于病毒感染细胞后所呈现细胞明显增大的 特征及该病毒在巨细胞包涵体病中的作用，将该病毒命名为巨细胞病毒。在1 9 7 3 年，国际病毒命名委员会( i c n v ) 疱疹病毒组将此病毒正式命名为人类疱疹病毒5 型 ( h u m a nh e r p e sv i r u s 5 ，h h v 5 ) t2 1 。在发达国家人群中，h c m v 感染率为4 0 6 0 ，而在发展中国家感染率更高【3 j 。我国资料表明，成人约有9 0 感染过h c m v ， 特殊地区和人群其感染率高达1 0 0 。 大多数h c m v 感染不出现明显的临床症状，表现为潜伏感染状态。当宿丰免疫 功能受损时则可引起病毒激活感染，临床表现明显，后果严重。在免疫功能不全或 低下的人群，如肾脏移植以及a i d s 患者，潜伏感染的病毒可再激活造成机体损伤。 此外，妇女妊娠时h c m v 病毒可以通过胎盘感染胎儿，是宫内感染中最常见、危害 最大的一种病毒，可导致流产、胎儿畸形、智力低下和听力丧失等，也是目前引起 婴幼儿异常的丰要原因之一【2 ，l 。 h c m v 几乎可感染人体所有组织和器官。机体多个器官，如造血系统，尤其是 骨髓造血祖细胞、外周血单核细胞、血锊内皮细胞、唾液腺、肺脏、肾脏和脑组织 等都是h c m v 的丰要感染部位1 4 】。根据h c m v 在宿丰体内的复制方式，感染类型 主要为潜伏感染和激活感染。病毒能通过在造血细胞特别是在髓系早期细胞中建立 潜伏感染而逃避宿丰免疫清刚5 。引。在h c m v 潜伏感染阶段，病毒停止牛长，病毒 基因组以低的拷贝数在染色体外所存在1 9 , 1 0 ，即无予代病毒产生，也不引起宿丰细 胞病变，仅仅只有少数病毒基因转录1 1 1 - 1 6 j 。从病毒潜伏到再激活是整个复制周期的 再起始，产牛新的感染病毒。在宿丰免疫力下降时，可导致病毒大量复制并有相应 临床症状的再现。激活感染时，病毒在宿主体内进行大量复制，产牛有感染性的了 代病毒，并扩散到其它细胞组织和器官，引起机体发牛病变，产生临床症状。 研究证实h c m v 基因组中含人细胞因子及细胞因子受体的类似基因，可表达人 细胞因予及细胞因子受体的类似物，干扰宿丰自身的细胞因子系统，从而逃避机体 8 温州医学院硕士学位论文 免疫系统的攻击。研究表明1 1 8 ，1 9 1 ，h c m v 病毒基因组中存在与人类白细胞介素一1 0 ( i n t e r l e u k i n 1 0 ，l l 广1 0 ) 序列同源性的区域，编码i l - i o 同源类似物，即巨细胞病 毒编码的i l - i o 同源类似物( c m v l l - 1 0 ) 。c m v l l - 1 0 与人i l - i o ( h l l 1 0 ) 有2 7 同源性，尽管c m v l l - 1 0 与h i l 1 0 的同源性低，但可与h l l - i o r 结合【2 0 , 2 1 】。h l l - l o 可 抑制抗原呈递细胞的抗原提呈和t h l 细胞免疫应答，促进b 细胞增殖及抗体的产 生， 而c m v i l 1 0 主要表现为抑制作用。重组c m v l l - 1 0 可抑制p b m c 增殖或下调 单核细胞表达m h ci i 2 2 , 2 3 1 ，并抑带i d c 细胞的成熟 2 5 , 2 6 】。c m v l l - l o 的信号通路类 似于h l l - 1 0 ，即i l 1 0 r j a k l s t a t 3 通删2 4 j ，主要表现为对单核一吞噬系统的抑制作 用。同时，c m v l l 1 0 的同源类似物存在另一个剪接体，即h c m v 潜伏相关白细胞 介素一1 0 ( 1 a t e n c ya s s o c i a t e dc m v l l - 1 0 ，l a c m v l l 1 0 ) 1 1 4 1 。l a c m v l l - 1 0 与c m v i l 1 0 n 端前1 2 7 个氨基酸高度同源，但缺少c 端的外显子3 ，在分子结构及功能上存在一 定差异。由于l c m v l l 1 0 不能与h l l - 1 0 r 结合，在免疫抑制功能上与c m v l l 1 0 有 所不同，如l a c m v l l 1 0 不能刺激b 细胞的增殖【2 7 】，也不能增加人单核细胞的f c y 受体介导的吞噬作用1 2 8 j 。因此，l a c m v l l - 1 0 只保留了c m v l l - 1 0 的部分生物学性 质。 h c m v 在与人类共进化的过程中，形成了许多免疫逃避机制逃避机体免疫系统 的攻击1 7 引，对于这些机制的研究将有利于对病毒致病机制的深入认识，有助于新的 治疗和预防策略的产牛。因此，研究c m v l l 1 0 和l 气c m v l l 1 0 剪接体的结构与功 能对于进一步了解h c m v 的致病机制是不可或缺的。为此，本文克隆并构建了 c m v l l - 1 0 和l c r n v l l - l o 剪接体的原核表达载体，并利用构建的原核表达载体转 化大肠杆菌，经诱导表达和亲和层析纯化，获得目的蛋白，并制备了其效价较高的 多克隆抗血清，经w e s t e r nb l o t 鉴定表明所表达的融合蛋白具有良好的抗原性和免 疫反应性，为进一步深入研究h c m v 编码的i l 一1 0 剪接体功能及作用打下了坚实的 基础。 9 温州睡学院硕十学位论文 材料与方法 一、实验材料 ( 一) 菌株、质粒与实验动物 克隆宿丰菌ec o l id h5 a 、表达宿主菌ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 由本实验室保存。 p m d l 8 - ts i m p l e 载体购于宝生物工程( 大连) 有限公司，原核表达载体p m a l c 2 x ， 为本室保存。 实验动物日本大耳兔由本校实验动物中心提供。 ( 二) 主要试剂及材料 限制性核酸内切酶e c o ri 、h i n d i i i 、e x t a q 高保真d n a 聚合酶、t 4 d n a 连接 酶、p c r 试剂( d n t p l o x b u f f e r 、m g c l 2 、d n t p 、6 xl o a d i n gb u f f e r ) 、1 0 0 b pd n a m a r k e r 、l k bd n am a r k e r 、质粒小量抽提试剂盒、d n a 胶回收试剂盒，蛋白质分 了量标准( 低) 均购于日本宝牛物工程( 大连) 有限公司。抗兔h r p i g g 抗体、 d a b 显色试剂盒购于碧云天牛物公司。蛋白质预染m a r k e r 购于f e r m e n t a s 公司。 硝酸纤维素膜购自b i o r a d 公司。m b p t r a ph p 购于通用医疗集团牛命科学部。p c r 引物由上海牛工牛物丁程有限公司合成。其余试剂均为国产分析纯由本实验室提供。 ( 三) 主要溶液及培养基的配制 1 、l b 培养液及培养基： 酵母提取物( o x o i d ) 5 9 胰蛋白胨 1 0 9 n a c l 1 0 9 加双蒸水至9 5 0m l ，用1 0 mn a o h 调p h 值至7 0 7 2 ，加双蒸水定容至10 0 0m l ， 1 5 磅高压灭菌2 0 3 0m i n ，置4 储存备用。在每升l b 液体中加入1 5g 琼脂粉即 为固体l b 培养摹。 2 、质粒提取试剂： 溶液i ：5 0m m 葡萄糖，2 5m mt r i s h c i ( p h 8 0 ) ，1 0m me d t a ( p h 8 0 ) 溶液i i ：0 2mn a o h ，1 s d s ( 临用前配制) 溶液i i i ：6 0m l5m 乙酸钾，1 1 5m l 冰乙酸，2 8 5m l 蒸馏水 3 、t e 缓冲液( p h 8 0 ) ：1 0m m t r i s h c i ，1m me d t a ( p h 8 。0 1 4 、s t e 缓冲液( p h 8 0 ) ：0 1mn a c l ，1 0m m t r i s h c l ，1m m e d t a ( p h 8 0 ) l o 温州氏学院硕士学位论文 5 、琼脂糖凝胶电泳缓冲液( 5 0 x t a e ) ： i r i s 2 4 2 9 冰乙酸5 7 1 m l 0 5 me d t a ( p h 8 0 )1 0 0 m l 加双蒸水定容至10 0 0m l ，工作液稀释5 0 倍。 6 、1 0mt r i s h c l ( p h8 0 11 0 0m h 称取t r i s1 2 1 1 4g ，加蒸馏水8 0m l 充分溶解，用 h c i 调p h 至8 0 ，定容至1 0 0m l ，4 储存备用。 7 、s d s p a g e 电泳的主要溶液： ( 1 ) 3 0 a c r 0 8 b i s ：取丙烯酰胺2 9g ，加去离子水6 0m l ，充分搅拌溶解，加甲 叉丙烯酰胺1g ，充分搅拌溶解，加去离子水定容至1 0 0m l ，滤纸过滤玄除杂 质，4 避光保存。 ( 2 ) 1 0 s d s ( m v ) ：取s d s1 0g ，加约8 0m l 去离子水，6 8 加热助溶，用h c l 调p h 至7 2 ，定容至1 0 0m l ，室温保存。 ( 3 ) 1 0 a p ( m v ) ：取0 1g 过硫酸胺，7 ) 1 1m l 去离了水充分溶解，一2 0 保存备 用。 ( 4 ) 1 5mt r i s h c l ( p h8 8 11 0 0m h 称取t r i s1 8 1 7g ，加蒸馏水8 0m l 充分溶解， 用h c i 调p h 至8 8 ，定容至1 0 0m l ，4 储存备用。 ( 5 ) 1 0m t r i s h c i ( p h6 8 、1 0 0m h 称取t r i s1 2 1 1 4g ，加蒸馏水8 0m l 充分溶解， 用h c i 调p h 至6 8 ，定容至1 0 0m l ，4 储存备用。 ( 6 ) t e m e d ( 四甲基乙二胺) ：从原瓶分装，4 储存备用。 ( 7 ) 1 2 分离胶1 0m l ( 临用前配制) ： d d h ，o 3 0 a c r b i s 1 5 mt r i s ( p h 8 8 ) 1 0 s d s 1 0 a p t e m e d ( 8 ) 5 聚合胶7 5m l ( 临用前配制) ： d d h 2 0 3 0 a c r b i s 1 1 3 2 m l 4 m l 2 7 m l 1 0 0 9 l 5 0 i ，t l 5 3 r t l 4 5 5 m l 1 0 m l 温州医学院硕十学位论文 1 0 mt r i s ( p h 6 8 ) 1 0 s d s 1 0 a p t e m e d ( 9 ) 5 x 蛋白上样缓冲液5m l ： 0 5 b p b ( m v ) 1 0 s d s ( m v ) ( 2 5 0m m ) t r i s h c i ( p h6 8 ) g l y c e r o l ( 5 0 ) 2 一m e ( 5 ) 加双蒸水至5m l 。窒温保存，2 - m e 临用前加。 ( 1 0 ) t r i s 甘氨酸电泳缓冲液： 2 5 0 m m 甘氨酸( p h 8 3 ) 2 5 m mt r i s 0 1 s d s ( m v ) 溶于双蒸水并定容至1 0 0 0m l 。 ( 1 1 ) 考马斯亮蓝染色液1 0 0 甲醇 蒸馏水 冰乙酸 称取考马斯亮蓝r 2 5 00 2 5g ， ( 1 2 ) 凝胶脱色液1 0 0m 1 甲醇 1 9 m l 7 5 山 7 5 1 1 1 7 5 山 0 0 2 5g 0 5g 1 2 5m l 2 5m l 2 5 l 1 4 4 9 3 o g 1 9 m l ： 4 5 m l 4 5 m l 1 0 m l 溶解，过滤除发杂质。 蒸馏水 冰乙酸 8 、m b p t r a p h p 柱蛋白纯化相关缓冲液： ( 1 ) c o l u m nb u f f e r 结合缓冲液： 1 o m t r i s - h c lb u f f e r p h7 4 n a c i ( 5 8 5g m 0 1 ) 0 5 me d t a ，p h8 0 1md t t 1 2 4 5 m l 4 5 m l 1 0 m l 2 0 m l 1 1 7 9 2m l 1m l 温州医学院硕士学位论文 加双蒸水定容至1 0 0 0m l 用0 2 2g m 滤膜滤去杂质，4 c 保存。 ( 2 ) e l u t i o nb u f f e r 洗脱缓冲液： 1 0 m t f i s - h c lb u f f e r ，p h7 42 0 m l n a c l ( 5 8 5g m 0 1 ) 11 7 9 0 5 me d t a ，p h8 02m l 1 md t r1m l 麦芽糖( 3 4 2 3g m 0 1 ) 3 4 2 3 9 加双蒸水定容至1 0 0