（临床兽医学专业论文）黄曲霉毒素b1胶体金免疫层析试纸条的研制.pdf

摘要i i i摘要黄曲霉毒素b 1 ( a f l a t o x i n b ，a f b l ) 是寄生曲霉( a s p e r g i l l u sp a r a s i t i c u s ) 和黄曲霉( a f l a v u ) 的二次代谢产物，具有很强的致癌性。许多粮油食品、饲料等都容易被a f b l 污染，严重威胁人类健康和畜禽生产。几乎所有国家和地区都规定了农产品、食品和饲料中a f b l 的最大允许含量，并作为强制性检测标准进行检测。目前的检测方法大多需要专门的仪器设备并且操作繁琐，无法满足现场快速检测的要求，因此建立简单、快速、高效的a f b l 检测方法具有重要的意义。本研究以单克隆抗体( m c a b ) 和免疫胶体金标记技术( i l t ) 为基础，根据竞争抑制原理，成功研制了a f b l 胶体金免疫层析试纸条，其灵敏度、特异性、稳定性等基本能达到检测要求。( 1 ) 将稳定分泌抗a f b l 单克隆抗体的杂交瘤细胞株2 a 5 接种于b a l b c 小鼠腹腔，采用体内诱生腹水法制备抗a f b l 的腹水。腹水经辛酸硫酸铵法纯化并作质量鉴定，考马斯亮蓝法测定单抗蛋白质浓度为1 5 2 6m g m l ；酶联免疫吸附法( e l i s a ) 测定抗体效价为1 ：6 4 x 1 0 4 ，i c 5 0 为0 2 1 8n m l ；交叉反应结果表明单抗特异性良好。( 2 ) 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，以金标a f b l 单克隆抗体作为探针，将a f b l 一b s a ( 检测线) 和羊抗鼠i g g ( 质控线) 分别包被在硝酸纤维素膜上，构建了间接竞争胶体金免疫层析检测体系( g i c a ) 。标记探针中金溶胶最佳粒径为2 4 姗，最佳包被抗原浓度为0 3 酬，金标单抗量为o 5l x g m l ，金标液的最佳稀释度为4 倍稀释。g i c a 目测检出限为5n g m l ，检测时间为5 1 0m i n 。试纸条对a f b 2 、a f m l 、赭曲霉毒素b 、玉米赤霉烯酮等无交叉反应，与a f g l 、a f g 2 有明显的交叉反应。( 3 ) 在a f b l 加标回收实验中，将6 种不同浓度( 1 、2 、3 、5 、1 0 、2 0 n g m l )的a f b l 标准品添加到未污染a f b l 的玉米粉中，制备不同污染程度的样品。分析比较g i c a 法和e l i s a 法对a f b l 的检测情况。当添加的a f b l 浓度低于2 n g m l时，检测线和质控线均为红色；高于3n g m l 时，仅质控线为红色，同时以e l i s a法做验证实验，结果表明试纸条能够基本满足检测要求。试纸条检测的最大优点是无需借助仪器，所需试剂已固定在试纸条上，检测快速、简便，l o m i n 内可出检测结果，适用于对a f b l 进行现场检测。关键词：黄曲霉毒素b 1 ；胶体金；免疫层析试纸条a b s t r a c ：tva bs t r a c ta f l a t o x i nb1a r ec a r c i n o g e n i cs e c o n d a r ym e t a b o l i t e sp r o d u c e dp r i m a r i l yb ya s p e r g i l l u sf l a v u sa n da p a r a s i t i c u s t h e yc a l lb ep r e s e n ti ng r a i n s ，n u t s ，c o t t o n s e e da n do t h e rc o m m o d i t i e sa s s o c i a t e dw i t hh u m a nf o o do ra n i m a lf e e d s a f l a t o x i nb1h a sb e e ni m p l i c a t e di nh u m a nh e a l t ha n da n i m a lf e e d s s o ，m o s tc o n t r o l l i n gg o v e r n m e n ta g e n c i e sw o r l d w i d eh a v er e g u l a t i o n sr e g a r d i n gt h ea m o u n to fa f l a t o x i nb1a l l o w e di nh u m a na n da n i m a lf o o d s t u f f s ，a n dd e t e c t e di ta sc o m p e l l e n ts t a n d a r d t h ed e t e c t i o nm e t h o d so fa f b1n o wa r ec o m p l i c a t e dt oo p e r a t ea n dn e e ds p e c i a li n s t r u m e n t s ，w h i c hc a n n o tm e e tt h er e q u i r e m e n to fr a p i dd e t e c t i o no nt h es p o t t h e r e f o r e ，d e v e l o p m e n to fac o n v e n i e n ta n dr a p i dm e t h o df o ra f b1d e t e c t i o ni se x t r e m e l yi m p o r t a n ta n dn e c e s s a r y i nt h i ss t u d y , d o ti m m u n o g o l da s s a y ( d i g a ) b a s e do nm o n o c l o n a la n t i b o d y( m c a b ) a n di m m u n o g o l dl a b e l i n gt e c h n i q u e ( i l t ) w a sd e v e l o p e df o r t h ea f b id e t e c t i o na c c o r d i n gt oc o m p e t i t i v ei n h i b i t i o np r i n c i p l e a d o p t i n gv i v oc u l t u r em e t h o d , h y r i d o m ac e l l2 a 5c a p a b l eo fs e c r e t i n gm c a ba g a i n s ta f b1c o n t i n u a l l y , w e r ei n j e c t e di n t ob l a b cm i c et op r o d u c ea s c i t e s t h ea s c i t e so ft h em i c ew a sc o l l e c t e da n dp u r i f i c a t e db yc a p r y l i c a c i d a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ( c a a s ) t oo b t a i nt h em o n o c l o n a la n t i b o d y t h em c a bw a sd e t e r m i n e d、析t 1 1c o a t i n ga n t i g e na n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no ft h em c a bw a s4 m g m l ，t h et i t e ro ft h em c a bw a s1 ：6 4 x10 4a n dt h e5 0 i n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o nw a s0 218n g r n l t h es p e c i f i c i t yo ft h em c a bw a sw e l l t r i s o d i u mc i t r a t ew i t ha q u e o u sg o l dc h l o r i d ew e r ew a r m e du pa n dm i x e dt om a k ec o l l o i d a lg o l d c o l l o i d a lg o l di m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ca s s a y ( g i c a ) w a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e c t i o no fa f b1b a s e do nc o m p e t i t i v ei n h i b i t i o np r i n c i p l e i nt h i ss y s t e m ，m c a ba g a i n s ta f b1c o n j u g a t e dt oc o l l o i d a lg o l ds e r v e da st h ea n a l y s i sp r o b e ，c o m p l e t ea n t i g e na f b1 - b s aa c t e da st h ec o a t i n ga n t i g e n ( t e s tl i n e ) ，g o a ta n t i m o u s ei g gw a si m m o b i l i z e do nt h em e m b r a n ea c t i n ga st h ec o n t r o ld o t ( c o n t r o ll i n e ) t h eo p t i m a ld i a m e t e ro fc o l l o i d a lg o l dp a r t i c l e sw a sa b o u t2 4n l n t h eo p t i m a lc o a t i n ga n t i g e nw a s0 3m g m l ，t h ec o l l o i d a lg o l dl a b e l e da n t i b o d i e sw a s0 5p g i i l l t h eg i c as e n s i t i v i t yf o ra f b1d e t e c t i o nw a s3n g m lb yv i s u a lo b s e r v a t i o n t h ed e t e c t i o nt i m ew a sa b o u t5t o10m i n t h i sm e t h o dh a dg o o ds p e c i f i c i t yf o ra f b 2 、a f m1 、o c h r a t o x i nba n dz e a r a l e n o n e ，a n do b v i o u sc r o s s r e a c t i v i t yw i t ha f g1a n da f g 2 扬州大学硕士学位论文v ip o l l u t e ds a m p l e sw e r ep r e p a r e db ya d d i n gs i xd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fa f bi ( 1n g m l 、2 n g m l 、3n g m l 、5n g m l 、10n e d m l 、2 0n e d m l lt ou n c o n t a m i n a t e dc o r nf l o u r t h er e s u l t sw e r ea n a l y s e db yd i g aa n de l i s a ，r e s p e c t i v e l y n ec o n c e n t r a t i o no fa f b1l e s st h a n2n g m l t h e r ew e r et w or e dl i n e so nt h en i t r o c e l l u l o s em e m b r a n e 1 1 1 ec o n c e n t r a t i o no fa f b1m o r et h a n3n g m l o n l yc o n t r o ll i n ew a sr e d a n de l i s aa st h ep a r a l l e le x p e r i m e n t , t w or e s u l t sw e r ec o r r e s p o n d n l em a j o ra d v a n t a g e so ft h es t r i pw e r et h a tr e s u l t sc o u l db eo b t a i n e dw i t h i n10m i n u t e sa n dt h a ta l ln e e d e dr e a g e n t sw e r ei n c l u d e di nt h es t r i p t h es t r i pc o u l db eu s e dt od e t e c tt h ea f b1o fr a p i dd e t e c t i o n ，n o tn e e da n ys p e c i a li n s t r u m e n t s k e y w o r d s ：a f l a t o x i nb 1 ；c o l l o i d a lg o l d ；i m m u n o c h r o m a t o g r a p h i c符号说明v 符号说明扬州大学硕士学位论文扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，已在文中以明确方式标明本声明的法律结果f h 本人承担。学位论文作者签名：声寄矢签字日期：加少年期叼e l学位论文版权使用授权书本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，许论文被查阅和借阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，通过网络向社会公众提供信息服务。学位论文作者签名：卢窨美签字日期：咖年铲月1 日导师签名：签字日期：妒p 年厂月7 日卢守英：黄曲霉毒素b l 胶体金免疫层析试纸条的研制1 黄曲霉毒素b1 概述i 上j l月l j 舌人类第一次认识黄曲霉毒素危害是在2 0 世纪6 0 年代初，英国东南部地区一些农场的1 0 万只火鸡幼仔死于一种病因不明的疾病。病理分析为肝脏出血，肾脏肿胀，胆管上皮细胞异常增生。由于病因不明，被定为火鸡x 病。后经研究证实，此病是由于火鸡吃了含有霉变花生饼的饲料而引起，由此才发现了黄曲霉毒素( a f l a t o x i n s ，a f t ) t 1 1 。黄曲霉毒素是被公认的环境污染物，主要由产毒的黄曲霉菌( a s p e r g i l l u sf l a v u s ) 与寄生曲霉菌( a p a r a s i t i c u s ) 产生的一组自然发生的真菌代谢产物【z j 。a f t是目前化学致癌物中最强的一种致癌诱变剂，其毒性比氰化钾强1 0 倍，比砒霜强6 8 倍；其致癌性比二甲基亚硝胺强7 5 倍，比二甲基偶氮苯强9 0 0 倍。a f t 广泛存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农产品中，给人们的身体健康和消费安全带来了极大的危害【3 1 。1 1 黄曲霉毒素理化性质a f t 及其衍生物有2 0 多种，其中l o 余种的化学结构已明确，从化学结构上看，各种黄曲霉毒素彼此十分相似，都是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。根据其在紫外光照射下所发出荧光颜色的不同，可分为两大类：发蓝紫色荧光的为b 族毒素，如a f b l 、a f b 2 ；发绿色荧光的为g 族，如a f g l 、a f g 2 。m 1 和m 2 也是黄曲霉毒素家族中较为重要的成员，它们主要是由a f b l 通过肝微粒体酶作用羟化而成，主要存在于动物的代谢产物中，如乳汁、尿液和排泄物【4 】。此外还有b 2 a 、g 2 a 、p 1 ，q ，h 1 ，g m 和毒醇等。已知毒性大小的黄曲霉毒素排列顺序为：a fb 1 a fm 1 a fg 1 a f b 2 a fg 2 。其中a fb 1 的急性毒性最强，长期食入含有此类毒素的饲料可使动物发生肝癌等病变，也是目前发现的最强致癌物【5 】。各种a f t 的分子量为3 1 2 3 4 6 ，熔点为2 6 8 - 2 6 9 。a f t 难溶于水、己烷、石油醚，在水中的最大溶解度只有1 0 g l ，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、二甲基甲酰胺等有机溶剂。结晶的a f t 非常稳定，高温( 2 0 0 ) 、紫外线照射都不能使之破坏t 6 | 。a f t 在酸性、中性溶液中非常稳定。在p h9 1 0 的碱性溶液中，能迅速分解产生钠盐，荧光也随之消失。此反应是可逆的，在酸性条件下又能形成带荧光的扬州大学硕士学位论文2a f b l 。a f t 的水溶液对光较敏感，加入3 0 的甘油，可使其稳定性大为提高。1 2 黄曲霉毒素b 1 的毒性机理a f b l 在人类食物和动物饲料中非常常见，在非洲和东南亚等一些地区，饮食a f b l 污染是人类肝细胞癌( h e p a t o c e l l u l a rc a r c 泌o m a , h c c ) 最主要的危险因素之一。流行病学资料显示，凡是a f t 污染严重的地区，也是肝癌的高发地区【7 】。a f t 主要侵害人和动物的肝脏，属于肝毒类，同时又是细胞毒。a f t 对动物的危害主要表现在：降低采食量，影响生长速度和生产能力；损害组织器官，尤其是肝损伤；抑制免疫机能；致癌和致畸【8 】。动物个体对a f t 的敏感性主要和动物的种类、年龄、性别和营养条件有关。人如果食用a f b l 污染的食品后，可出现发热、腹痛、呕吐等临床症状，严重者在2 3 周内出现肝脾肿大、肝区疼痛、下肢浮肿及肝功能异常等中毒性肝病症状【9 】。a f t 进入胃肠被吸收后，主要分布于肝脏，血液中分布极少，肌肉中几乎检测不到【l 刚。a f b l 在没有经过代谢活化之前的母体化合物是无致癌性的，因此a f b l 被称为前致癌物，必须通过体内的生物转化，形成活性中间体才具有致癌性【1 。a f b l的代谢作用发生在肝脏。a f b l 经饮食摄入后，约有5 0 在十二指肠被吸收并主要分布在肝脏，未被吸收的a f b l 通过粪便排出体外而不对机体造成损害。a f b l 在体内的代谢主要是通过i 相酶细胞色素p 4 5 0 ( c y p 4 5 0 ) 超家族成员作用后形成几种亲电子的中间代谢物【】，其主要过程是：因为a f b l 在其末端呋喃( 8 , 9 位置) 有一对不饱和的双键，该双键环氧化作用是导致真菌毒素致癌性和诱发突变效应最关键的代谢反应i l2 。c y p 4 5 0 酶系活化a f b l 8 ，9 环氧化物产生两个异构体：a f b l e x o 8 ，9 环氧化物( a f b o ) 和a f b l - e n d o 8 ，9 一环氧化物，a f b o是迄今为止人类所知的唯一具有遗传毒性和致癌性的a f b l 代谢产物。在人体内，c y p l a 2 氧化a f b l 为a f m l 、a f q l 和a f b l e n d o 8 ，9 环氧化物( 这3 种代谢产物从尿液排出体外) ；c y p 3 a 4 氧化a f b l 为a f q l 和a f b o 。a f b o 是介导a f b l 诱发肝癌形成的最主要的亲电子化合物。a f b o 与d n a 结合，形成d n a 加合物，易致癌，人类小肠上皮细胞内的c y p 3 a 4 水平较高，因为肠细胞包含的d n a 加合物很容易脱落，a f b l 进入小肠后被c y p 3 a 4 代谢成a f q l 或a f b o后会被有效的排除，并不引起肿瘤! l 。a f b o 经机体i i 相酶如谷胱甘肽转硫酶( g l u t a t h i o n et r a n s s u l f u r a s e ，g s t ) 作用，可以和环氧化物的功能基团结合形成水溶性产物a f b l 谷胱甘肽( a f b l 卢守英：黄曲霉毒素b 1 胶体金免疫层析试纸条的研制g l u t a t h i o n ，a f b l g s h ) 共轭化合物【1 3 】，最终以a f b l 硫醇尿酸( a f b l m e r c a p m r i ca c i d ，a f b i - n a c ) 形式经尿排出体外；另一个i i 相酶是环氧化物水解酶( e p o x i d eh y d r o l a s e s ，e p h x ) ，在a f b l 解毒过程中将a f b o 的结构改变成8 ，9 双羟基a f b l ，最终变成二氢二醇，使之失去和d n a 结合的位点，被排泄出体外。然而没有被解毒的a f b o 有潜在的与细胞内大分子相作用的能力，可形成共价加合物【l 钔。a f b l d n a 加合物被认为是a f b l 诱导h c c 发生点突变的起源。a f b o 第8 位碳原子和d n a 鸟嘌呤上的第7 位氮原子共价结合形成a f b l - n 7 一鸟嘌呤( a f l a t o x i n - n 7 g u a n i n e ，a f b l - n 7 g u a ) 加合物 1 5 , 1 6 1 ，肝内形成的大部分a f b l - n 7 一g u a 加合物可经d n a 修复较快地从d n a 中清除，尿液成为清除这种致癌的d n a - 力口合物唯一途径；另有2 0 可转变为开环结构的a f b l 甲酰氨基嘧啶( a f b l f o r m a m i d o p y r i m d i n e ，a f b l f a p y ) 加合物【l 。另外，血清白蛋白加合物是烷基化物暴露于a f b l 后形成的主要白蛋白加合物，白蛋白中的a f b l 赖氨酸( a f b l 1 y s i n e ) 加合物不被修复而残留在血液中( 见图1 【l l 】) 。a f m i ：a n a t o x i nm 1 ；a v q l ：a f l a t o x i nq i ；c y p ：c y t o c h r o m ep 4 5 0图1a f b i 代谢过程f i g 1p r o p o s e dm e t a b o l i s mo fa f bia f t 对大分子物质有破坏作用，如影响组织细胞d n a 、r n a 的合成和降解，蛋白质、脂肪的合成和代谢，线粒体、溶酶体、内质网的结构功能【1 3 】。a f b l 随血液进入肝脏，在肝细胞中的n a d h 脱氢酶和其他酶的共同作用下，发生羟化、脱甲基和环氧化反应，转化成黄曲霉毒素醇和a v q l ，后者又转化成a f h l ，这些物质和蛋白质有很高的亲和力，从而导致细胞畸变或癌变。扬州大学硕士学位论文41 3 食品中黄曲霉毒素b 1 的限量标准1 9 9 6 年w h o f a o 首次规定了食品中黄曲霉毒素最高允许副1 6 】。1 9 9 6 年w h o f a o 明确规定，谷物中a f b l 的含量不得超过2 0i t g k g t l 8 j ；1 9 9 3 年英国规定，供人类消费的农产品中a f b l 的法定限量4l a g k g ，在人类消费前需要进一步加工的进口农产品中a f b l 限量是1 01 t g k g 。1 9 9 4 年美国重新规定：用于饲养家禽、幼牛和猪的花生制品中黄曲霉毒素的总量的法定标准限量为1 0 0p g ，饲养幼年动物，产奶动物等为2 0 t g k g t l 9 】。我国卫生部也颁发了各类食品中a f b l 的限量标准，见表1 2 0 1 。表1 我国对食品和饲料中a f b l 含量的限量标准t l b 1t h el i m i t e ds t a n d a r d so f a f b1i nf o o d sa n df e e d si nc h i n a1 9 9 6 年，美国联邦政府确立了相关黄曲霉毒素与食品安全法律，规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量( 指b i + b 2 + g i + g 2 的总量) 不能超过1 51 t g k g 。人类消费的牛奶中的含量不能超过0 5p , g k g ，其他动物饲料中的含量不能超过3 0 0b t g k g 1 4 】。而欧盟国家规定更加严格，要求人类生活消费品中的a f b l 的含量不能超过o 0 5l a g k g 2 。由此可见各国规定的a f b l 允许量虽然不同，但总体呈逐渐降低趋势【2 2 1 。1 4 黄曲霉毒素b 1 的检测方法目前已有的检测食品和饲料中a f t 含量的方法可概括为三类：生物鉴定法、仪器分析法和免疫分析法。生物鉴定法是通过生物体实验来验证样品的毒性部位和毒性机理，为判断a f b l 是否存在提供佐证【2 3 1 。但生物鉴定法的专一性不强，灵敏度较低，一般只能作为化学分析方法的证实试验。而且，此方法的费用较高，所需时间较长，也需卢守英：黄曲霉毒素b 1 胶体金免疫层析试纸条的研制要有特殊的操作技巧。因此该方法已经逐渐被其他方法所代替。荧光光度法( f l ) 是检测黄曲霉毒素被紫外线激发而产生的荧光强度，测定准确度较高，重复性好，但处理过程中干扰物质多，为了得到准确的结果，就需要较多的处理步骤，比较烦琐，同时需要配备昂贵的精密大型仪器设备，费用较高，对操作人员也要有较高的要求，一般适于在国家或地区级研究所或科研单位的大型实验室中应用【1 6 1 。薄层色谱法( t c l ) 是测定a f t 的经典方法，是我国测定食品及饲料中a f b l的国家标准方法之一。其原理是样品经过处理后，在波长3 6 5 n m 紫外光下a f b l 、a f b 2 产生蓝紫色荧光，a f g l 、a f g 2 产生黄绿色荧光，并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量，是一种半定量检测技术。高效液相色谱法( 1 1 i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g a p h y ，h p l c ) 是2 0 世纪7 0 年代发展起来的一种以液体为流动相的新型色谱技术，由于它具有稳定准确灵敏快速等优点，h p l c 法在黄曲霉毒素检测中的应用越来越广，已成为当前对a f t定量研究的首选方法。a f t 的h p l c 检测方法是：样品经提取、净化后，选择适宜的流动相通过高效液相色谱柱，使多种黄曲霉毒素同时分离，检测器检测。检测a f t 属于痕量分析，不管采用何种提取方法，提取物中干扰检测的化合物需通过一定的前处理方法将其除去，对样品中的黄曲霉毒素进行富集【2 引。h p l c 测定a f t 包括正相液相色谱法( n p 玎) l c ) 和反相液相色谱法( r p h p l c ) ，检测器主要有紫外检测器和荧光检测器，由于荧光检测器的灵敏度比紫外检测器高3 0 - - 4 0 倍，目前多使用荧光检测剁2 9 1 。检测时一般需对黄曲霉毒素进行柱前或柱后衍生化以提高它们的检测灵敏度【3 0 1 。柱前衍生法主要有三氟乙酸法和稀盐酸法，柱后衍生法主要有溴衍生法、碘衍生法及光化学衍生法等【3 l 】。免疫法以抗原抗体的免疫化学反应为基础，进行抗原抗体含量的检测，特异性强，其他荧光物质、色素、结构类似物干扰少，样品处理简单【2 4 1 。免疫法有酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) 、放射免疫测定法( r i a ) 、免疫层析法( i c ) 、免疫亲和柱法( i a c ) 、荧光偏振免疫检测法( f p i a ) 和流动注射免疫测定法( f i i a ) 等，其中最常用的是e l i s a 检测方法。e l i s a 是上世纪7 0 年代以来发展起来的免疫测定技术，可分为直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等，用于黄曲霉毒素检测的e l i s a 方法主要有直接和间接竞争e l i s a 。扬州大学硕士学位论文6直接竞争e l i s a 法将抗黄曲霉毒素的特异性抗体包被于固相载体上，加入酶标a f b l 与待测样品提取溶液，竞争性结合包被抗体，形成酶标抗原抗体复合物，加入酶底物显色，通过颜色的深浅来测定a f b l 含量，其含量与显色强度成反比。这种方法灵敏度高、特异性强、回收率高、提取方法简单，可以进行定性和定量测定，得到了比较广泛的应用1 2 引。间接竞争e l i s a 法先将黄曲霉毒素完全抗原包被于酶标板上，加入混匀的样品提取液和抗黄曲霉毒素特异性抗体，反应后加入酶标二抗，洗涤后加入酶底显色，通过颜色的深浅来测定a f b l 含量，a f b l 的含量与显色强度成反比。本方法实验步骤增加，但由于所使用酶标二抗相对目前合成的酶标黄曲霉毒素更为稳定，故实验结果更加可靠。e l i s a 法中酶的活性易受反应条件影响，测定结果重复性较差，且易出现假阳性结果。对食用油和含脂量、含盐量高的样品如花生、酒类、酱油等，在提取时要进行特殊处理【2 6 2 7 】。该方法对操作人员技能要求较低，操作简单快速，广泛用于黄曲霉毒素的快速筛检，总体来说，e l i s a 属于定性筛选方法。a f t 的极大危害性和广泛分布，给科研工作者带来巨大的挑战。将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用，是目前采用较多的一种方法。这些新方法、新手段的快速应用，为a f t 的检测提供了更广泛的选择余地，但高效液相色谱法和酶联免疫吸附法在应用中仍需不断改进和完善。寻求快速、准确且经济可行的检测方法已成为a f t 研究中亟需解决的任务之一。2 胶体金免疫技术及其应用胶体金免疫层析技术( c o l l o i d a lg o l di m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ca s s a y ，g i c a ) 是2 0世纪8 0 年代继三大标记技术( 荧光素、放射性同位素和酶) 后发展起来的第四大固相标记免疫测定技术【1 7 】。该方法具有与酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 相似的特异性和灵敏度，它是胶体金标记技术与快速免疫斑点结合技术相结合的产物【3 2 。该方法最大特点是快捷迅速、灵敏准确、安全简便、成本低廉且不需要专业人员和仪器设备，通常几分钟内就可用肉眼观察到颜色鲜明的检测结果。近年来，胶体金免疫层析技术己成为当今最快速的免疫学检测技术之一，并越来越受到相关研究领域的关注。卢守英：黄曲霉毒素b 1 胶体金免疫层析试纸条的研制72 1 胶体金的性质和特点2 1 1 快速检测法中标记物的选择早期的快速检测使用有色乳胶形成可视信号，目前某些检测仍用此方法。乳胶法一直是凝集反应的主要的标记方法，因为它在结合成分的存在下易于凝集，对于快速检测而言，交联物的稳定性是避免假阳性的关键，而易于凝集可能是产生假阳性的主要问题。2 0 世纪8 0 年代末，金标记被引入膜快速检测中。在适当条件下，任何大小的金颗粒都可以被重现性制备出来，粒径不同可用于不同的用途。因其具有优良的稳定性、敏感性、精确性和可重复生产性等特点使得金适合在快速检测中应用。金属惰性元素，被适当加工可形成完整的球形颗粒。当正确连接时，蛋白质能牢固地结合在金颗粒表面，在固态和液态中都能保持较久的稳定性。若在制造过程中蛋白被精确固定，则交联物的非特异性结合可被降至接近为零。标记抗原抗体的不同标记物优缺点的比较如表2 所示【3 3 1 。表2 快速检测中常用标记物的特征比较t a b 2c o m p a r i s o no ft h ec h a r a c t e r i s t i c so fl a b e l sc o m m o n l yu s e di nr a p i dt e s t s特征金银碳乳胶燃料酶可视性敏感性稳定性颜色重复性放大性一步重分析检测结果清晰易于制备使用简便适应性低成本注：木应用受限；料适于部分检测；料卑效果显著适用于大部分检测扬州大学硕士学位论文2 1 2 胶体金的性质氯金酸( h a u c h ) 在还原剂作用下，可还原聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金如同铁蛋白一样具有高电子密度，比铁蛋白颗粒更致密，易于辨认，定位比酶反应物精确，且易与多种大分子物质包括抗体、a 蛋白、凝集素等结合。每个胶体金颗粒周围都包绕着来源于溶液中残留阴离子的负电荷层，形成金颗粒悬液，如图2 i i “。这种被称为z e t a 电位的电子层使得金颗粒之间相互排斥并在悬浮液中任意分布。z e t a 电位可以通过改变周围溶液中离子的浓度而被压缩或扩张。胶体金颗粒具有很高的电子密度，在电子显微镜下可以很清楚地观察胶体金的颗粒形态。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性口町，而且正是由于静电作用而成为稳定的胶体。但电解质能够破坏其胶体的稳定状态，使胶体金颗粒发生聚沉，而某些蛋白质等大分子物质对胶体金有保护、加强稳定性的作用【3 53 “。2 1 3 胶体金的制备图2 胶体金颗粒f i g2c o l l o i d a lg o l dp a r t i e l e制各出直径一定且均一的单分散系胶体金，是免疫胶体金试纸条研制的关键步骤之一，因此获得高质量的胶体金，是实验能够顺利进行的有力保障。胶体金溶液是指分散相粒子直径在l 一1 5 0 h m 之间的金溶胶，属于多相不均匀体系，颜色由桔红色到紫红色。为了获得直径一定且均一的单分散系胶体金，生卢守英：黄曲霉毒紊b 1 腔体金免疫层析试纸条的研制产方法虽然都依赖于还原氯金酸来形成金原子，但制各过程中的物理条件还是有很大的差异，如反应物添加的顺序、还原剂剂量的多少以及最终生产出的胶体金的质量( 大小、形状、变异系数等) 。因此，在进行大规模制各胶体金时，在生产过程中的每一步都需要使用电镜检测对其进行质量监控。而少量制各时，电镜监测则不适用。胶体金是由氯金酸在还原剂如柠檬酸三钠、白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下p 7 弼】，聚合成为特定大小的金颗粒。目前应用最多的是采用柠檬酸钠还原氯金酸法。此方法通过加入柠檬酸三钠量不同，可获得1 6 0 9 7 5 n m 不同颜色和不同大小的金颗粒。加入柠檬酸三钠量较多时，胶体金溶液颜色鲜红；加入量较少时颜色暗红。白磷还原法所得的颗粒5 1 2 n m ；抗坏血酸还原法制各的金颗粒为8 1 3 n m ：乙醚超声波还原法得到的金颗粒为6 1 0 n m ；鞣酸柠檬酸钠还原法为1 5 r t m 的金颗粒：而硼氢化钠还原法得到的金颗粒最小，仅2 5 r l m 3 9 1 。2 1 4 金颗粒产生的原理图3 金离子还原形成金颗粒f i g3r e d u c t i o no f g o l di o n st of o r mg o l dp a r t i c l e s如图3 所示，在加入还原剂之前，溶液中均为金离子，纵坐标表示在加入还原剂时金离子转变为金原子的过程。在氯金酸溶液中加入还原剂后，金原子含量急剧上升直到饱和。紧接着在一个被称为核化的过程中发生凝集作用，在核化位点形成由十一个金原子构成的中央二十面体金核心。核化位点的形成是为了减扬州大学硕士学位论文少溶液中金原子过度饱和，其形成极其迅速。此过程一旦完成，溶液中剩余的金原子在递减的能量梯度下继续结合核化位点直到所有的离子从溶液中移除【4 0 】。溶液中最初形成的核数目决定了最终形成多少金颗粒，而这个数目又取决于加入还原剂的量。在一定的氯化金溶液中，加入的还原剂越多形成的核化位点数目越多，产生的金颗粒也越多，金颗粒的直径越小。若生产条件优良，所有的核化位点在瞬时同时发生，可获得金颗粒大小完全一致的胶体金( 即单分散型) 。但要做到这一点比较困难。2 2 胶体金免疫层析技术的检测原理组装后的试纸条如图4 所示，主要材料是玻璃纤维膜( 样品垫) 、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、塑料底板等。试纸条检测的原理是以条状纤维层析材料为固相，借助毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体( 如抗体或抗原) 发生高特异、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的特定区域( 检测带) ，出现肉眼可见的颜色，根据颜色可判断阴性或阳性】。一般5 1 0 m i n 内便可得到直观的实验结果。按照免疫层析中抗原与抗体结合方式的不同，分为两类：非竞争性免疫层析和竞争性免疫层析m q 。图4 侧向层析快速检测试纸条的结构图f 培4 c o n s t r u c t i o no f a l a t e r a l - f l o wr a p i d t e s t( 1 ) 非竞争性免疫层析原理即双抗体夹心法，常用于检测带有多个抗原位点的分析，常用于致病细菌、病毒、大分子蛋白质等的检测。胶体金与针对待测抗原的特异性抗体( a b ) 偶联，卢守英：黄曲霉毒素b l 胶体金免疫层析试纸条的研制l l并将其沉积在结合区上。当样品( 尿、血浆、饮料等) 加到样品区后，由于毛细作用，金a b l 被溶解，沿膜条向前移动。若样品中存在待测抗原，抗原就会和金a b l结合形成金a b l a g 。然后，样品通过固相化有捕获抗体( 一般是针对待测抗原另一表位的特异性抗体a b 2 ) 的检测线时，金a b l - a g 复合物被捕获，形成金- a b l a g a b 2 复合物。一部分未与a b 2 结合的样品继续前移，通过固相化有抗a b l 抗体( - -抗a b 3 ) 的质控线时，形成金a b l a b 3 复合物。( 2 ) 竞争性免疫层析原理竞争性免疫层析适用于检测带有单一抗原表位的小分子抗原，常用于农兽药残留、违禁药物的检测等。将胶体金与针对待测抗原的特异性抗体( a b l ) 偶联，沉积在结合区。而检测区固相化与待测抗原或其类似物相同的已知抗原。若样品中含有待测抗原，则和带有标记物的a b l 形成金a b i a g 复合物。随后在通过固相化有待测抗原或其类似物的检测区时，由于竞争抑制，不再发生反应，检测线不显色；样品继续前移，金a b l a g 复合物被固相化在质控线处的抗a b l 抗体( 二抗a b 2 ) 所结合，形成金a b l a g a b 2 复合物，质控线显色。2 3 胶体金蛋白复合物的制备胶体金蛋白复合物又称胶体金探针，用于免疫测定时多简称为免疫胶体金( i m m u n o g o l d ) 4 2 j 。标记过程中，体系的离子强度、p h 、抗体的量是决定标记是否成功的关键，其中影响最大的是标记体系p h 值和蛋白用量，标记前一定要确定胶体金与蛋白结合的最佳p h 值。由于p h 等于或稍大于蛋白质的等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态。如果p h小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，。胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物；如果p h 大于蛋白质的等电点时，蛋白质带负电荷，与胶体金颗粒的负电荷相互排斥而不能相互结合【4 3 】。标记前一般使用k 2 c 0 3 调节胶体金溶液的p h 至最适p h ，表3 给出了一些常用蛋白质的胶体金标记最适p h 值【l7 1 。扬州大学硕士学位论文1 2表3 几种常用蛋白质的胶体金标记最适p ht a b 3o p t i m a lp hf o rt h ec o n j u g a t i o nb e t w e e nc o l l o i d a lg o l da n ds e v e r a lc o m m o n l yu s e dp r o t e i n s蛋白质ph抗体( y 球蛋白)亲和层析的i g g单克隆抗体s p a ( 葡萄球菌蛋白)过氧化物酶牛血清白蛋白大豆凝集素破伤风毒素亲和素一旦蛋白结合上胶体金，必须使用b s a 、凝胶、聚乙二醇或酪蛋白等稳定金标溶液。这些稳定剂不仅能封闭胶体金表面未与蛋白结合的位点而且减少了非特异性反应，还能避免因外来电解质的影响而相互凝聚在一起，因此提供了一种更稳定的悬浮液。2 4 胶体金免疫层析技术的应用2 4 1 在医学方面的应用免疫胶体金快速诊断技术现已广泛应，用于人医的诊断附啪】，如绒毛尿囊膜促性腺激素( 妊娠诊断) 、乙型肝炎表面抗原、丙肝抗体、艾滋病、流行性出血热、梅毒、霍乱弧菌、旋毛虫、疟疾、血吸虫、隐血等。中华人民共和国国境卫生检疫法规定出入境卫生检疫机构应对出入境人员实施传染病监测，而检疫传染病和监测传染病的病原体和标志物的检出要依赖医学实验室的检验。目前应用比较广泛的金标试纸条包括h i v 抗体( a n t i h i v )的初筛快速检测，乙型肝炎( h b s a g ) 的快速检测，丙型肝炎抗体( a n t i h c v )的快速检测，梅毒抗体( a n t i t p ) 金标快速监测掣4 1 7 1 。062oo519上97868566k卢守英：黄曲霉毒素b l 胶体金免疫层析