（作物学专业论文）酿酒酵母rad52基因转化拟南芥及转化体筛选技术研究.pdf

摘要 基因打靶是反向遗传学基因功能研究的重要工具，但在植物转基因过程中， 外源基因绝大多数随机插入基因组中，通过同源重组定向插入的概率极低。近年 来虽采用了多种方法提高基因打靶的效率，目前仍没有达到实用水平。酿酒酵母 转基因主要通过同源重组的方式整合到基因组中，因而具有很高的打靶效率。把 酵母等生物的同源重组机制引入植物可能是提高植物基因打靶效率的有效的途 径。r a d 5 2 蛋白是酵母与同源重组有关的关键酶，而绝大多数植物缺乏r a d 5 2 蛋 白。本研究的主要目的就是从酵母中克隆i 主j r a d 5 2 基因，并把它导入到模式植物 拟南芥中，以便进一步研究r a d 5 2 基因对植物同源重组及基因打靶效率的影响。 目前植物基因打靶的效率非常低，研究基因打靶需要建立非常有效的植物转 基因体系。拟南芥转基因可以采用活体( 原位) 转化法，在转化阶段可以完全不 依赖组织培养技术，转化步骤简单、高效。但转基因种子的筛选基本上还依赖于 无菌培养，工作量比较大，而且容易污染，造成实验材料的损失。本研究在前人 技术的基础上，着重对种子筛选技术做了改进，提出了三种不依赖于无菌培养的 简单、可靠和高效的转基因种子筛选方法。 本研究的主要结果如下： 1 从酵母基因组中克隆出同源重组关键基因r a d 5 2 ，构建出农杆菌双元载 体，并用农杆菌介导的浸花法( f l o r a ld i p ) 导入拟南芥野生生态型c o l u m b i a 。获 得的转基因植株经p c r 鉴定证实，r a d 5 2 基因已整合到基因组中。 2 提出了三种不依赖无菌培养的拟南芥转基因种子筛选方法。其一是滤纸 发芽筛选法，转基因种子在含有筛选剂的1 4 m s 大量元素液体的滤纸上进行发芽 筛选。其二是水琼脂发芽筛选法，用含筛选剂的1 4 m s 大量元素b o o 8 的琼脂固 化，由于水琼脂不含蔗糖和其他有机物质，加上抗菌素的作用，细菌不会在短期 内繁殖，真菌的繁殖也很有限，从而实现非无菌操作筛选。其三是筛选剂浸种筛 选法，让转基因种子在低温处理和萌发阶段在含筛选剂的i 4 m s 大量元素的液体 中进行，刚萌发的种子转移到营养土中。三种方法与已有的方法相比都有简单、 可靠、高效的特点，解决了拟南芥转化技术中的一个瓶颈问题。 关键词：基因打靶；r a d 5 2 基冈；拟南芥转基冈；转化体筛选 a b s t r a c t g e n et a r g e t i n gh a sb e c o m ea ni n d i s p e n s a b l er e v e r s eg e n e t i c st o o lf o rs t u d y i n g g e n ef u n c t i o n ，b u ti np l a n t st r a n s f o r m i n gd n a i n t e g r a t e sm a i n l yi nar a n d o mm a n n e r i n t ot h eg e n o m e t r e m e n d o u se f f o r t sh a v eb e e nm a d et oi m p r o v et h ee f f i c i e n c yo f g e n et a r g e t i n g ，b u ti th a sn o tb e c o m eap r a c t i c a lt e c h n i q u e t r a n s f o r m i n gd n aa l m o s t e x c l u s i v e l yi n t e g r a t e si n t og e n o m ev i ah o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni ny e a s t ，w h i c h r e s u l t si nh i g he f f i c i e n tg e n et a r g e t i n g i ti ss u p p o s e dt ob ea ni m p o r t a n ta p p r o a c ht o i m p r o v ep l a n tg e n et a r g e t i n ge f f i c i e n c yb yi n t r o d u c i n gt h eh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n m a c h i n e r yo fy e a s t i n t o p l a n t s r a d 5 2 p i sac r u c i a l e n z y m et oh o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o ni ny e a s t ，a n dm o s tp l a n t sl a c ki t i no r d e rt os t u d yt h ee f f e c t so fr a d 5 2 g e n eo nh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o na n dg e n et a r g e t i n gi np l a n t s ，r a d 5 2g e n ew a s i s o l a t e df r o my e a s tb yp c ra n dt r a n s f o r m e di n t oa r a b i d o p s i s b e c a u s eg e n et a r g e t i n ge f f i c i e n c yi sv e r yl o wi np l a n t sa tt h em o m e n t ，i ti s n e c e s s a r yt oe s t a b l i s ha ne f f i c i e n tt r a n s f o r m a t i o ns y s t e mt os t u d yg e n et a r g e t i n g a g r o b a c t e r i u mm e d i a t e di np l a n t at r a n s f o r m a t i o no fa r a b i d o p s i sw a sw e l le s t a b l i s h e d ， a n di st i s s u ec u l t u r ef r e ef o rt r a n s f o r m a t i o n b u tt h et r a n s f o r m a n ts c r e e n i n gp r o c e s s s t i l lr e q u i r e st i s s u ec u l t u r e ，w h i c hi sl a b o r - i n t e n s i v e ，a n dm a t e r i a ll o s eo f t e no c c u r b e c a u s eo fc o n t a m i n a t i o n h e r ew ee s t a b l i s h e dt h r e es i m p l eb u te f f i c i e n ts c r e e n m e t h o d sf r e ef r o ma s e p t i cc u l t u r e t h em a i nr e s u l t e sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 r a d 5 2g e n ew e r ei s o l a t e df r o my e a s ta n da g r o b a c t e r i u mb i n a r yv e c t o rw e r e c o n s t r u c t e d r a d 5 2g e n ew e r et r a n s f o r m e di n t oc o l u m b i ae c o t y p eo fa r a b i d o p s i sb y a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e df l o r a ld i pm e t h o d t r a n s g e n i cp l a n t sw e r eo b t a i n e da n d s c r e e n e db y p c r t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h et r a n s f o r m e dg e n ew a si n t e g r a t e di n t h ea r a b i d o p s i sg e n o m e 2t h r e ed i f f e r e n tm e t h o d sf o rs c r e e n i n ga r a b i d o p s i st r a n s f o r m a n t sf r e ef r o m s t e r i l i z e dc u l t u r eh a v eb e e nd e v e l o p e d t h ef i r s to n ei st os c r e e ns e e d so nf i l t e rp a p e r m o i s t e n e db y l i q u i d1 4 m sm a c r o n u t r i e n t sw i t hs e l e c t i o na g e n ta n d5 0g g m l a m p i c i l i n t h es e c o n dm e t h o di st os c r e e no nw a t e ra g a r , w h i c hi sb a s e do nt h e t r a d i t i o n a lt i s s u ec u l t u r em e t h o d ，b u tt h em e d i u mo n l yc o n t a i n1 4m sm a c r o n u t r i e n t s w i t hs e l e c t i o na g e n ta n dp r o p e ra n t i b i o t i c ss o l i d i f i e db y0 8 a g a r t h el o wn u t r i e n t a n da n t i b i o t i c sm a k es t e r i l i z a t i o n u n n e c e s s a r y i nt h et h i r dm e t h o d ，s e e d sa r e g e r m i n a t e df o r1 5 - 2d a yi nl i q u i d1 4 m sm a c r o n u t r i e n t sw i t hs e l e c t i o na g e n tb e f o r e b e i n gt r a n s f e r r e dt ot h es o i l s e e d l i n g ss u r v i v e ds c r e e n i n gg r o wt h eb e s ta n da r ee a s i e r t ob et r a n s p l a n t e d 。t h et h r e em e t h o d sa r ea l ls i m p l ea n dr e l i a b l e ，w h i c hr e s o l v e sa b o t t l e n e c kp r o b l e mi na r a b i d o p s i si np l a n t at r a n s f o r m a t i o n k e yw o r d s ：g e n et a r g e t i n g ；r a d 5 2g e n e ；a r a b i d o p s i st r a n s f o r m a t i o n ；t r a n s f o r m a n ts e l e c t i o n 缩略词表 缩写英文名中文名 a m p a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 b a p 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e 6 苄基腺嘌呤 b s b i s p y r i b a c 双草醚 d s bd o u b l es t r a n db r e a k 双链断裂 e d t a d i d o d i u m e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e 乙二胺四乙酸 g u s p g l u c u r o n i d a s e葡( 萄) 糖苷酸酶 h y gh y g r o m y c i n 潮霉素 h r h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n 同源重组 i p t g i s o p r o p y l b d t h i o g a l a c t o s i d e 异丙基一p - d 一硫代半乳糖苷 i r i l l e g i t i m a t er e c o m b i n a t i o n 非同源重组 k a n k a n a m y c i n 卡那霉素 l bl u f i a b r o t hl b 培养基 m s m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m m s 培养基 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e c t i o n 聚合酶链式反应 r i f r i f a m p i c i n 利福平 r p m r e v o l u t i o np e rm i n u t e每分钟转数 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠 s s b p s i n g l es t r a n db i n d i n gp r o t e i n 单链结合蛋白 t - d n at r a n s f e r r e dd n a转移d n a x g a l5 - b r o m o 4 c h t o r o 3 i n d o l y l d 5 - 溴- 4 一氯一3 一吲哚一d 一半乳糖苷 t h i o g a l a c t o s i d e 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝江盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：张好富签字日期：2 0 0 8 年6月 8 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝望盘堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝望盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：张好富导师签名：张宪银 签字日期：2 0 0 8 年6 月8 同签字同期：2 0 0 8 年6 月8 日 致谢 本论文是在导师张宪银副教授的悉心指导下完成的。导师为论文倾注了大量 精力，没有导师的帮助与指点就没有论文的完成，值此论文完成之际，谨向他表 示由衷的感谢! 两年来导师活跃创新的思维、灵活的分析解决问题的方式、敏锐 的洞察力和高超的实验技术，以及严谨的治学态度和开阔的胸襟使我受益匪浅。 与两年前相比，现在我在分析解决问题的能力和思维方式方面都得到了巨大改 观，这一切都是得益于导师的教育和引导，再次向导师表示感谢和敬意! 特别感谢薛庆中教授。在我两年的学习和科研中薛老师从各方面给予了大力 支持，保证了各项工作的顺利进行。同时薛老师在学习和为人处事方面给予了大 量指点，对我的学习和成长大有裨益。 各位师兄师姐在我两年的学习和生活中给予的热心关怀和帮助。感谢朱惠琴 博士、周元飞博士、金亮博士、刘庆坡博士、赵心爱博士、燕树峰博士、孙晓杰 硕士在生活、学习、实验及论文写作过程中给予的帮助与支持，感谢阮松林老师 在实验中给予的指导与帮助。 同时感谢石云博士、李云侠硕士、倪密硕士、韦克苏硕士以及其他在生活和 实验中给予我的无私帮助的人。 感谢我的家人为我创造良好的学习环境。多年来，他们在我漫长的求学生涯 中给予了最大的理解、支持和鼓励，使我能够顺利完成学业。 最后，向参加本论文评阅、答辩和对论文提出宝贵意见和建议的所有专家、 同行表示最诚挚的谢意。 张好富 2 0 0 8 年5 月于杭州 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 植物基因打靶研究进展 自2 0 世_ 垂6 8 0 年代转基因在烟草和矮牵牛获得成功后( d r a p e re ta l ，1 9 8 2 ；e c k e s 铹a l ，1 9 8 2 ) ，转基因技术飞速发展，并在植物上得到了广泛应用，要表现在： 转基因技术用于植物遗传改良和应用于植物基因功能研究。在遗传改良方面， 植物转基因技术具有许多传统育种技术所无法具有的优势：它不仅可以缩短育 种年限，加快育种进程；而且可以打破种间基因交流的界限，广泛利用不同生 物的基因使植物获得抗病性、抗虫性，抗逆性、提高产量和改善品质等( 程件 毅，2 0 0 2 ) 。越来越多的植物获得了转基因植株，一些重要的农作物已经实现了 商品生产( s o n g s t de ta l ，1 9 9 5 ；t o e n n i e s s e ne ta l ，2 0 0 3 ) 。植物基因功能研究方 面，可利用转基因实现插入突变，创造突变体进而进行深入的基因功能研究等( 方 萍等，2 0 0 7 ；p a u le la l ，2 0 0 3 ) 。 植物转基因技术自建立以来有了巨大进步，并且日益成熟。但在实际应用 中发现，植物转基因存在位置效应和与此相关的沉默现象( b r u e n i n ge la l ，1 9 9 8 ) ， 导致外源基因在转基因植株中的表达水平不高、不稳定，植株上表达差异很大， 严重地影响了转基因的效果，制约了转基因技术的应用。在高等植物中大约3 0 的转基因实验都发现了基因沉默，而且研究还发现这种现象广泛地存在于植物、 真菌和动物中( 王红梅等，2 0 0 3 ；g r a n te ta l ，19 9 9 ) 。位置效应被广泛认为是产 生转基因沉默的主要原因之一( c h r i s t o ue ta l ，1 9 9 7 ；g a l l i ee la l ，1 9 9 8 ) 。 目前常用的转基因方法转基因后外源基因在受体基因组中随机整合 ( k u m p a t l ae ta l ，1 9 9 8 ) ，其表达往往与整合位点有密切的关系。如果外源基因 整合到甲基化程度高、转录活性低的异染色质和重复序列区域，很容易引起目 的基因的沉默，不能表达( k e r t b u n d i te ta l ，1 9 9 1 ) ；如果整合到甲基化程度低、 转录活性高的常染色质上，其表达受两侧d n a 序列的影响( b h a t t a c h a r y y ae la l ， 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述 1 9 9 4 ) 。因此，不同的独立转化体可能由于在染色体上插入的位置不同而有不同 的表达强度。 另一方面，进行基因功能研究时，外源基因的随机整合，难以实现对目的 基因的定向突变，并可能破坏基因组中的其他基因，对基因功能研究造成干扰。 为了控制外源基因的随机整合，实现精确导入，更好的提高转基因效果和 进行基因功能研究，2 0 世纪8 0 年代末期一种新的转基因技术一基因打靶发展起 来。相对于传统转基因技术，基因打靶技术具有定向、精确的特点，成为研究 的热点。 1 1 基因打靶的概念及优势 基因打靶( g e n et a r g e t i n g ) 是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一项技术，它是将外 源d n a 导入受体细胞，通过与受体细胞染色体d n a 目标序列间的同源重组 ( h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ，h r ) ，定点整合到基因组的某一确定位点( 杨瑞仪等， 2 0 0 3 ) 。 与传统的基因转移技术相比基因打靶具有不可比拟的优势：( 1 ) 稳定外源 基因的表达。利用传统转基因方法转基因在植物体内的整合具有位置效应，直 接影响植物转基因的有效表达，造成转基因在植物体内表达的不稳定( s t a me t a l ， 1 9 9 7 ；g a l l i ee ta l ，1 9 9 8 ) 。而利用基因打靶可将外源基因准确地整合到植物基因 组的某一特定位点，减少随机插入造成的转基因在植物体内表达的不稳定性。 ( 2 ) 敲除基因进行基因功能分析。通过基因敲除研究基因功能是最直接、直观 的方法，利用常规的转基因方法虽然也可以实现基因敲除，但整合到基因组中 的外源基因具有随机性，进行敲除的目的性差，效率低，必须通过大量转化和 大规模筛选才能实现；同时外源基因插入的随机性不可避免地对其它基因产生 突变，影响后代遗传表现，造成对目的基因功能研究的困难。基因打靶可以实 现对基因精确的敲除，高效、准确，更重要是的减少了随机插入造成的突变， 降低对目的基因功能研究的影响( p a u le l a l ，2 0 0 5 ) 。对于未知功能的基因，通过 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 基因打靶研究其功能无疑是最理想、有效的方法。( 3 ) 定向改造植物内源基因。 虽然常规转基因技术可以通过外源基因的表达改变植物的遗传性状，也可以通 过随机插入使某些基因突变，但对于定向的改造内源基因则难以实现。基因打 靶能够通过染色体同源重组把外源基因引入染色体d n a 的特定片段，修饰、修 复或敲除某些基因，实现对目标基因的定向精细改造。 总之，植物基因打靶作为反向遗传学研究工具，在研究植物基因功能、精 确改造遗传性状方面展现了无可比拟的优势，通过基因打靶可以高效、精确的 研究基因的功能和改变生物体的遗传性状。 1 2 基因打靶的原理 基因打靶的机理还不清楚，目前主要有以下三种模型用于解释基因打靶中 目的基因的整合方式( 图1 1 ) ( p a q u e se la l ，1 9 9 9 ) 。第一种模型认为，打靶载体 d n a 片段两侧同源序列与靶d n a 序列之间发生双交换而完成重组( 图1 1 a ) 。第二 种模型为单链同化模型，外源d n a 的一个单链与靶d n a 序列退火形成一种异源 双链的中间体( 图1 1 b ) 。该异源双链结构往往会被细胞内的修复体系删除或纠 正，错配修复体系更倾向于原来的d n a 链，使用外源的d n a 链的几率仅有5 。 当锚配修复使用外源d n a 链时，就会形成外源d n a 的同源整合。第三种模型为 断裂诱导的复制模型( b r e a ki n d u c e dr e p l i c a t i o n ，b i r ) ，认为外源d n a源序列 经外切酶作用产生37 粘性末端。3 端作为引物侵入染色体的同源部分，引起新链 的合成。这种d n a 合成可以一直延伸垄 d n a 的末端( 图1 1 0 。 对基因打靶原理的深入研究，特别是对各个步骤所参与的酶的研究，有利 于针对性地采取有效措施，提高基因打靶的频率。 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述 a b 仁= 三& v r a 3 = = = ：= = = = = = e = = = = = = = = = = = - + 图1 1 基因打靶模型 f i g 1 1m o d e l sf o rg e n et a r g e t i n g 1 3 植物基因打靶研究的主要进展 目前，基因打靶技术在一些原核生物、低等真核生物甚至动物中已经成熟 ( b r i t te ta l ，2 0 0 3 ) ，成为常规技术。然而在高等植物体内，d n a 重组和修复主 要是以非同源重组( i l l e g i t i m a t er e c o m b i n a t i o n ，i r ) 的方式进行，非同源重组率 远高于同源重组率( b r i t te ta l ，2 0 0 3 ；t z f i r ae ta l ，2 0 0 5 ) 。外源基因主要以非同源 重组的方式整合到植物基因组中，导致基因打靶的频率很低( p u c h t ae ta l ，2 0 0 7 ) ， 远远没有达到实用水平，极大限制了这一重要技术在高等植物中的应用。一些 在细菌、酵母中行之有效的提高基因打靶频率的措施，如酵母中提高同源序列 的长度可以提高基因打靶频率( k o y a m ae la l , 2 0 0 7 ) 在高等植物上没有明显的效 果。动物中同源序列长度在2 9 5 1 8 0 0 b p 时同源重组率与同源序列的长度呈正比， 当同源序列长度在2 0 0 b p 以下时，重组效率明显降低( 汪得凯等，2 0 0 4 ) 。植物 中，只有剑叶藓的基因打靶频率对同源序列长度具有明显的依赖性( t e r a d ae t a l ，2 0 0 5 ) ，但在更高等的植物中并未获得相似的结果。m i a o 等( 1 9 9 5 ) 在拟南芥 中使用了7 k b 的同源序列，打靶频率只有3 9 1o 4 ，t h y k j a e r 等( 1 9 9 7 ) 将同源 序列延长至2 2 9 k b ，但打靶频率仍低于5 3 1 0 5 。 提高基因打靶频率是植物基因打靶的当务之急，当前主要通过以下三种途 径提高植物基因打靶的频率。 浙江大学硕士学位论义第一章文献综述 1 3 。1 正负选择系统的应用 正负选择系统最初应用于小鼠胚胎干细胞系统，其基本原理是，在普通打 靶载体的同源序列两外侧增加负向选择基因，该基因的存在在选择培养基上会 产生毒素，使细胞死亡。转基因后，如果t - d n a 以同源重组方式整合到基因组 中，则负向选择基因丢失，不产生毒性；若以非同源重组方式插入，负向选择 基因将整合到靶细胞基因组内，表达后使靶细胞死亡。t e r a d a 等( 2 0 0 2 ) 采用正 负选择系统对水稻w a x y 基因进行打靶，在打靶载体的内部插入切f 基因作为正向 选择标记基因，将两个白喉毒素a ( d t - a ) 基因作为负向选择标记置于载体两同 源序列的两侧，有效富集了中靶细胞，并避免了异位重组事件的干扰，使打靶 频率达到1 。最近这一技术得到了进一步的应用，t e r a d a 等( 2 0 0 7 ) 借助正负 系统对水稻a d h 2 基因通过基因打靶进行修饰，获得了2 的打靶频率。e n d o 等 ( 2 0 0 7 ) 利用基因打靶技术对水稻乙酰乳酸合成酶( a l s ) 基因进行了突变，使突 变体产生对除草剂双草醚( b i s p y r i b a c ，b s ) 的抗性，并用b s 直接筛选，从1 5 0 0 个愈伤组织中获得了6 6 个独立打靶转化体。这个实验中虽然没有应用负选基因， 但未中靶转化体没有抗性，具体效果与正负选择相同。 1 3 2 利用锌指核酸酶辅助基因打靶 研究显示在靶位点产生d n a 双链断裂可能提高基因打靶频率。j w p u c h t a 等 f 1 9 9 9 ) 对烟草基因进行修饰使其带有稀有位点限制性核酸内切酶i s c e l 的酶切位 点。再将编码i s c e l 酶的基因导入烟草，产生的i s c e l 酶作用于酶切位点产生d n a 双链断裂，极大地提高了该位点的同源重组频率。基于这一原理有研究者设计 了锌指核酸酶( z i n i c f i n g e rn u e l e a s e s ，z f n s ) 用于基因打靶。其基本原理为( 图 1 2 ) ，将具有核酸序列特异性识别功能的锌指结构与非特异性核酸内切酶连接， 核酸内切酶一般选用f o k l ( k i me t a l ，1 9 9 6 ) 。在进行基因打靶时，锌指结构识别 特定的核苷酸序列，核酸内切酶切开d n a 链在靶位点形成d s b s ，刺激目标序列 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 和供体d n a 分子之间进行重组( k u m a rse ta l , 2 0 0 1 o ， 浮窄 1 【 ；j 口圜匮翟匿噩旺噩旺噩囝受母墨圈；? 囱敷盔盔蕾盈囝匪蕾童菹立互匮赶立茳丑蜀互匡正卫互蜀蔓囹s 图1 2 锌指核酸酶作用原理 f i g 1 2m e c h a n i s mo fz i n i c f i n g e rn u c l e a s e sa c t i o n l l o y d 等( 2 0 0 5 ) 利用z f n 在拟南芥中实现了定点突变。分析获得的1 0 6 个突 变体发现：大部分突变被删除了1 - 5 2 b p ，小部分则被插入了1 - 4 b p ，获得了高达 2 0 的定向突变。w r i g h t 等( 2 0 0 5 ) 利用z f n 对烟草进行基因打靶，检测到了高 达2 0 基因打靶频率，比没有利用z f n s 的基因打靶频率提高了1 0 4 1 0 6 倍。 利用z f n s 辅助基因打靶取得了良好的效果，并且通过设计识别不同序列的 z f n s 在理论上可以实现对所有基因的辅助打靶。但z f n s 的设计技术要求高且需 要巨大的劳动量，目前已有的z f n s 仅能精确识别非常有限的一些序列。虽然 z f n s 的设计方法不断得到改进，一些新方法也不断得到发明与应用( w r i g h te ta l ， 2 0 0 6 ；d h a n a s e k a r a ne la l ，2 0 0 6 ) ，但大规模设计精确性高、识别广泛靶位点的z f n s 短时间内还难以实现。另外，z f n s 在生物体内表达带来一些副作用，会造成受 体细胞的大量死- 亡( u m o ve ta l ，2 0 0 5 ) 。虽然采用增加锌指数目等措施可以降低这 种副作用( b i b i k o v ae ta l ，2 0 0 3 ；u m o ve ta l ，2 0 0 5 ) ，但很难去除这种副作用。 1 3 3 改变重组机制 植物基因打靶频率低下的根本原因是其d n a i 钓重组修复主要采用的是非同 源重组方式。提高植物基因打靶频率的首要问题是提高植物体内的同源重组率。 对于d n a 的重组机制已有大量的研究，已发现很多与重组密切相关的基因，这 些基因编码的蛋白质和酶参与d n a 的重组过程并起关键作用。理论上调节这些 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 基因的表达可以改变生物体内d n a 的重组方式。目前植物上主要采用引入促进 同源同源重组的基因和抑制非同源重组相关的基因表达两种途径提高基因打靶 频率。 ( 1 ) 引入同源重组基因。高等植物d n a 的重组与修复主要采用非同源重组 方式，而细菌、酵母等生物主要采用同源重组的方式。一些研究者剩用细菌或 酵母中与同源重组相关的基因提高植物同源重组的频率。r e c a 和r u v c 基因是大 肠杆菌中同源重组的重要基因，它们在圊源重组过程中分剐负责d n a 链的配对 和分解重组中间体( k o w a l c z y k o w s k ie ta l ，1 9 9 4 ) ，r e c a 和r u v c 在烟草中表达大 大提高了烟草的同源重组率( s h a l e ve ta l ，1 9 9 9 ；r e i s se ta l ，2 0 0 0 ) ，但基因打靶 的频率并没有提高。r e c q 是大肠杆菌中另一与同源重组相关的重要基因，r e c q 酶在同源重组的起始阶段解旋d n a 双螺旋，产生单链d n a ，并与r e c a 蛋白、s s b 蛋白一起引发同源重组( h a r m o ne ta l ，1 9 9 8 ) 。l i 等( 2 0 0 4 ) 研究发现r e c q 基因在 水稻胚性细胞的瞬间表达使同源重组提高了4 倍，而在叶细胞中的稳定表达可使 同源重组提高2 0 4 0 倍，但对基因打靶的效果还未见报道。酵母的重组机制已有 深入研究，酵母中参与同源重组的主要基因是r a d 5 2 上位簇基因，包括r a d 5 1 ， r a d 5 2 ，r a d 5 4 ，r a d 5 5 ，r a d 5 7 ，r a d 5 9 ，m r e l l 和x r s 2 等，对同源重组起重要作用 ( 曲e ta l ，2 0 0 4 ；b r a ye ta l ，2 0 0 5 ) 。在植物中引入酵母的同源重组基因也己取 得一定的成效，如s h a l ( e d 等( 2 0 0 5 ) 在拟南芥体内过量表达酵母r a d 5 4 基因，并对 拟南芥种子贮藏蛋白c r u c i f e r i n 基因实施打靶，将基因打靶的频率由1 0 - 41 0 弓提高 到了l o 之1 0 一，平均打靶频率提高了2 7 倍。 ( 2 ) 抑制非同源重组相关基因。一些研究者认为，生物体内的两种染色体 重组方式存在竞争关系，因此阻断非同源重组途径可以促进同源重组途径，进 而能够提高基因打靶频率。在拟南芥中已经发现了一些参与非同源重组途径的 重要基因：l i 9 4 ，x r c c 4 , k u 7 0 和k u 8 0 等( w e s te ta l ，2 0 0 0 ；t a k a h a s h ie ta l ，2 0 0 6 ) 。 g a l l e g o 等( 2 0 0 3 ) 研究发现，k u 8 0 缺失的拟南芥的非同源重组下降，但是同源 重组并未受影响。在动物中研究也发现，在k u 7 0 ，k u 8 0 基因功能缺陷的鼠干细 胞中，虽然非同源重组降低，但基因打靶频率并未提高( d o m i n g u e ze ta l , 2 0 0 6 ) 。 浙江人学硕士学位论文第一章文献综述 由此看来，仅抑制这些基因的表达并不能够提高基因打靶的频率，染色体两种 重组方式之间的关系还需要进一步研究。 1 4 现有方法在植物上应用存在问题及发展方向 现有的四种主要的提高基因打靶频率的方法在高等植物的应用上都存在一 定的问题。延长同源片段的长度能显著提高细菌、酵母、动物和剑叶藓基因打 靶频率，但对高等植物基因打靶无明显促进，说明高等植物的体细胞由于缺乏 同源重组的遗传机制，单纯提高同源片段的长度不能奏效。正负选择系统依赖 非常高效的转化系统、大规模的转化实验和特定的容易鉴定的目标基因，目前 此方法只有一个研究小组在水稻上取得成功；而此方法虽可有效去除非中靶细 胞，使基因打靶频率相对提高，但绝对的打靶频率并没有提高，没有从根本上 改变植物非同源重组占绝对优势的局面，因此，很难成为具有广泛应用价值的 基因打靶方法。锌指核酸酶引入双链断裂可以极大提高植物基因打靶频率。目 前由于技术限制只能设计极少量的锌指核酸酶用于基因打靶，此方法的普遍应 用价值也还有待进一步研究。 植物的重组机制是植物基因打靶的根本限制因素，因此调节重组机制可能 是从根本上提高植物基因打靶频率，发展出具有普遍应用价值的基因打靶方法 的唯一途径。利用细菌和酵母同源重组相关基因来提高植物基因打靶频率已取 得了一定程度的共识。但目前引入的细菌的同源重组基因可以提高同源重组效 率，但不能提高基因打靶的频率。对基因打靶频率有作用的例子只有酵母的 r a d 5 4 基因，目前还缺乏后续的报道，其对提高基因打靶效率的机制仍然不是十 分清楚。酵母与同源重组有关的r a d 5 2 上位簇基因包括r a d 5 1 ，r a d 5 2 , r a d 5 4 , r a d 5 5 ，r a d 5 7 , r a d 5 9 , m r e l l 和x r s 2 等多个基因。这些基因在同源重组中的作用 也有广泛的研究结果，如在同源重组过程中r a d 5 1 蛋白促进链的配对和链的交换 ( g a f fe ta l ，2 0 0 5 ) ；r a d 5 1 蛋白低聚化结合在d n a 单链的末端并形成蛋白细丝催 化链的交换和重组( n e we la l ，1 9 9 7 ) ；r a d 5 1 和r a d 5 4 相互作用，并且在功能上相 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述 互促进( k w o n ae ta l ，2 0 0 7 ) 。r a d 5 2 蛋白是酵母的d s b 修复和同源重组是必需蛋 白( b a o y u a ne ta l ，2 0 0 4 ) ；r a d 5 2 与r a d 5 1 及r a d 5 9 等相互作用共同参与源重组的 引发过程( s h i n o h a r ae la l ，1 9 9 8 ；n e we ta l ，1 9 9 8 ；d a v i se la l ，2 0 0 1 ) 。r a d 5 4 作为一种染色质重构因子，能够改变染色质的结构( e i s e ne ta l ，1 9 9 5 ) ，在d n a 同源重组中能促使d n a 双链的解旋及刺激d n a 链的侵入，在同源重组的多个阶 段起作用( v a ne t a l ，2 0 0 0 ) 。但从目前的认识水平仍然不清楚哪些基因可能提高植 物的基因打靶效率。植物可能是缺乏个别基因而使基因打靶频率低下，也可能 是不同基因必须相互协调才能形成高的基因打靶效率。今后工作中应选用更多 相关基因研究其对基因打靶的作用。鉴于同源重组过程中许多基因协同作用， 研究同时改变两个甚至多个基因，乃至引入具有高效打靶机制生物的一整套同 源重组途径，可能是植物基因打靶今后的发展方向。 2 农杆菌介导的植物活体转化技术 自植物转基因技术建立以来，各种转基因方法发展迅速。目前主要应用的 转基因方法主要有：农杆菌介导转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射 法、电穿孔法等( 高俊山等，2 0 0 3 ) 。其中农杆菌介导转化法转基因多以单拷贝 或低拷贝插入受体细胞，转移的d n a 片段比较确定( h i e ie ta l ，1 9 9 4 ) ，能够转 移相对较大的d n a 片段，更有效地产生单位点整合，不易引起重排，遗传稳定； 具有操作简单，成本低，转化频率高，重复性好等特点，比其他转基因方法具 有明显的优势( 王启燕等，2 0 0 3 ) 。目前约有8 0 的转基因植物通过此法得到( 孟 成民等，2 0 0 4 ) ，农杆菌介导法成为应用最为广泛的转基因方法。 2 1 农杆菌介导的活体转基因技术的发展 植物活体( i n p l a n t a ) 转化是不依赖于离体培养的一类转基因技术。1 9 8 7 年 f e l d m a n n 等( 1 9 8 7 ) 利用农杆菌液侵染萌发的拟南芥种子，筛选后代种子获得 了转基因植株，奠定了活体转化的基础。b e c h t o l d 等( 1 9 9 3 ) 利用真空渗透法处 浙江大学硕士学位论文第一章文献综述 理拟南芥植株得到了较高的转化率，是拟南芥活体转化技术成熟的标志，这种 方法不断得以改进和优化，并得到广泛应用。c h u n g 等( 1 9 9 4 ) 将拟南芥花序切 除，在伤口处点染转化菌液也获得了转化植株。随后研究者发现向转化菌液中 加入一定量的表面活性剂能促进转化，并且可以代替真空渗透转化的抽真空操 作( c l o u g he ta l ，1 9 9 8 ) ，转化时仅通过浸染开花期的花序就可以实现较高频率 的转化。在此之后，c h u n g 等( 2 0 0 0 ) 直接用转化菌液向花序喷雾就能够获得与 浸泡法转化相当的效果。 活体转化不依赖组织培养技术，技术要求低，大大缩短了实验周期；消除 了转化材料在组织培养过程中产生的嵌合体和体细胞变异；克服了一些植物外 植体对农杆菌敏感而造成的转化部位的褐化和坏死( 王关林等，2 0 0 2 ) ，迅速成 为拟南芥转化的首选方法。随着对其不断的改进与优化，其应用范围不断拓宽， 现在一些其他植物也利用活体转化法成功地实现了转基因。活体转化由于具有 比较稳定和高效的转化效率，技术篙单可靠，适应于大规模的转基因实验，是 植物基因打靶研究比较理想的转基因技术。 2 2 影响活体转化的因素 2 2 1 植株生长状态 植株的生长发育阶段对转化频率有重大影响。c l o u g h 等( 1 9 9 8 ) 研究不同发 育阶段的拟南芥真空转化频率发现，主花序枝切除后次级花序枝长至约2 1 0 c m 高，并有少数花开放时进行转化频率最高，而已有许多果荚时转化频率最低。 宋正旭等( 2 0 0 3 ) 研究小白菜活体转化发现，未经过花芽分化的植株转化效果 最差，花芽分化后到开花前的植株转化率逐渐升高。曹传增等人( 2 0 0 3 ) 研究 不结实白菜也表明：开花初期转化效果最好。虽然不同植物最理想的转化时期 不尽一致，但植物花序形成至初花期，具有大量处于不同发育阶段的花是获得 高频率转化的关键。 浙江大学硕上学位论文第一章文献综述 2 2 2 转化渗透液 c l o u g h ( 1 9 9 8 ) 等研究了转化渗透液对拟南芥转化频率的影响，发现