（免疫学专业论文）p62调节dribbles中hbsag含量的初步探讨.pdf

东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学化论文是我个人在导师指导下进行的研究丁作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同忐对本研究所做的仟何贡献均已在沦文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名： 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生 院办理。 研究! e 签导师签名： 中文摘嘤 p 6 2 调节d r i b b l e s 中h b s a g 含量的初步探讨 中文摘要 细胞自噬是高度保守的绌胞牛物学行为，其分子机制从酵母细胞到哺乳动物细胞十 分相似。在自噬过程中，待降解的胞浆组分及细胞器被包裹在具有双层膜结构自噬小体 ( a u t o p h a g y ) 中，最终与溶酶体融合形成白噬溶酶体，实现胞内物质的降解，从而维持细 胞自稳。阻断蛋门酶体降解途径后，提取肿痛细胞培养上清中含有双层膜结构的自噬小 体，冈其中含有残留的废蛋i 兰t ( d e f e c t i v er i b o s o m ep r o d u c t s ，d r i p s ) ，称之为d r i b b l e s ( d r i p s i n b t e b s ) 。我们前期实验证明，d r i b b l e s 作为肿瘤抗原载体能被d c 摄取并通过交叉提 呈途径诱导t 细胞应答，d r i b b l e s 是具有潜在价值的肿瘤疫卣载体。 近来研究发现，p 6 2 作为多种信1 了7 1 传导途径中的支架蛋白，能通过c 末端泛素相关 结构域( u b i q u i t i n a s s o c i a t e dd o m a i n s ，u b a ) 与泛素化靶蛋白结合，并通过l r s ( l c 3 r e c o g n i t i o ns e q u e n c e ，l r s ) 结构域与l c 3 结合，然后由l c 3 介导将泛素化靶蛋白包裹入 自噬小体，最后自噬小体与溶酶体融合完成蛋白的降解。因此，p 6 2 在两种蛋白降解途 径( 蛋白酶体降解途径和自噬降解途径) 之间发挥着重要的桥梁作用。 本研究拟构建h b s a g 、泛素一h b s a g 以及p 6 2 真核表达质粒，并转染h e p g 2 细胞， 提取转染细胞的d r i b b l e s 并检测其中h b s a g 含量，探讨过表达p 6 2 蛋白能否提高自噬 小体中泛素化蛋t 兰t ( h b s a g ) 的含量，为优化d r i b b l e s 肿瘤疫苗提供新的思路。 目的： 探讨过表达p 6 2 能甭提高自噬小体中泛素化蛋白的水平 方法： 1 构建p 6 a o ”p b u f i p w s h b s a g 重组质粒和p 6 a o ”p b u f i p w s u b h b s a g 重 组质粒； 2 采用脂质体法转染h e p g 2 细胞，分3 组：o p 6 a o ”p b u f i p w s h b s a g 重组质 粒转染组；卯6 a o ”p b u f 一1 p w s u b h b s a g 重组质粒转染组； p 6 a o ”p b - u f i p w s - u b h b s a g 与p l r e s 2 一e g f p p 6 2 重组质粒共转染组。万珂、 雷帕霉素和氯化铵处理转染细胞并制备细胞裂解液和d r i b b l e s ： 3 e l i s a 法检测各组细胞裂解液和d r i b b l e s 的h b s a g 含量。 东南人学硕。i ：学位论文 结果： 1 成功构建了p 6 a o ”p b - u f - i p w s - h b s a g 和p 6 a o ”p b - u f i p w s - u b - h b s a g 重组质 粒；用以转染h e p g 2 细胞，并获得稳定表达株； 2 采用) i t - j 、雷帕霉素和氯化铵处理p 6 a o ”p b u f - i p w s u b h b s a g 重组质粒转染 细胞，裂解液和d r i b b l e s 中h b s a g 含量均增高； 3 力i 王可、雷帕霉素和氯化铵处理u b - h b s a g 和p 6 2 重组质粒共转染h e p g 2 细胞，榆 测发现d r i b b l e s 中h b s a g 的含量明显提高，且高于药物处理的u b - h b s a g 重组质 粒单独转染组。 结论： 1 成功构建h b s a g 的真核表达载体，转染h e p g 2 细胞后能有效表达h b s a g 蛋白； 2 成功构建u b h b s a g 的真核表达载体，转染h e p g 2 细胞后仍然能检测到h b s a g ； 抑制转染细胞的蛋白酶体降解途径，h b s a g 有所增高；w e s t e mb l o t 检测显示： u b h b s a g 融合蛋白大部分被裂解为h b s a g ，这可能是u b h b s a g 融合蛋白未能 成为“短寿蛋白”的主要原因，为下一步完善实验设计提供了依据； 3 当蛋白酶体降解途径被抑制时，过表达p 6 2 蛋白在一定程度上促进泛素化蛋白进入 自噬小体，有利于将更多的泛素化蛋白募集到d r i b b l e s 中。 关键词：h e p g 2 细胞；d r i b b l e s ；p 6 2 蛋白；h b s a g ；泛素 i i 英文摘要 o v e 卜e x p r e s s i n gp 6 2r e g u l a t e sh b s a g l e v e li nt h ed r i b b l e se x t r a c t e d a b s t r a c t - f r o mh b s a g e x p r e s s i n gh e p g 2 c e l l s a u t o p h a g yi sap r o c e s sw i t he v o l u t i o n a lc o n s e r v a t i o n ，t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mi ss i m i l a r f r o my e a s tt om a m m a l i a n s i ti sac e l l u l a r s e l f - c o n s u m p t i o np r o c e s sc h a r a c t e r i z e db y s e q u e s t r a t i o n o fb u l k c y t o p l a s m ，l o n g l i v e dp r o t e i n s a n dc e l l u l a r o r g a n e l l e s i n d o u b l e m e m b r a n ev e s i c l e sc a l l e da u t o p h a g o s o m e s ，w h i c ha r ed e l i v e r e dt oa n dd e g r a d e di n l y s o s o m e s ，a n dp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nc e l l u l a rh o m e o s t a s i s t h e r ea r ed e f e c t i v er i b o s o m e p r o d u c t s ( d r i p s ) i nd r i b b l e s ( d r i p si nb l e b s ) w i t hd o u b l e m e m b r a n ev e s i c l e s ，w h i c ha r e e x t r a c t e df r o mt h em e d i u mf o rt u m o rc e l l c u l t u r i n g ，a st h ep r o t e a s o m ep a t h w a yh a sb e e n b l o c k e d p r e v i o u ss t u d i e sd e m o n s t r a t et h a td e n d r i t i cc e l l sc o u l dp h a g o c y t o s ed r i b b l e sa sa k i n do ft u m o ra n t i g e n sa n di n d u c et h e r e s p o n s eo ft - c e l lv i ac r o s s p r e s e n t a t i o n t h u s ， d r i b b l e sc o u l db ea c o m p o s i t i o no ft u m o rv a c c i n et oo p t i m i z et h ea n t i t u m o rt h e r a p y p o t e n t i a l l y r e c e n td a t ar e v e a lt h a tp 6 2 ，as c a f f o l dp r o t e i ni n v o l v e di nm u l t i p l es i g n a l i n gp a t h w a y s ， b i n d st op o l y u b i q u i t i n a t e dp r o t e i n st h eu b i q u i t i n a s s o c i a t e d ( u b a ) d o m a i na n da g g r e g a t e sb y o l i g o m e r i z a t i o nt h r o u g ht h ep b 1d o m a i n ，a n db i n d st o a t 9 8 l c 3o nt h ea u t o p h a g o s o m e m e m b r a n et h r o u g ht h el c 3 一i n t e r a c t i n gr e g i o n ( l i r ) t ot a r g e ta g g r e g a t e st oa u t o p h a g o s o m e s f o rd e g r a d a t i o n t h u s ，p 6 2r e l a t e st ob o t hd e g r a d a t i o np a t h w a y so fl o n g l i v e dp r o t e i na n d s h o r t l i v e dp r o t i e n t oa p p r o a c hw h e t h e ro v e r - e x p r e s s e dp 6 2c o u l da g g r e g a t em o r eu b i q u i t i n a t e dp r o t e i n si n d r i b b l e s ，r e c o m b i n a n tp 6 a o ”p b - u f i p w sv e c t o rc o n t a i n i n gt h eh b s a go ru b h b s a g g e n ew a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f e c t e di n t oh e p g 2c e l ll i n er e s p e c t i v e l ya n dd r i b b l e sw e r e e x t r a c t e df r o mt h em e d i u ma n dt e s t e dt oo b s e r v et h el e v e lo fh b s a g b ye l i s a a n dt h i s s t u d y , w h i c hi s b a s e do nt h er e s u l t sm e n t i o n e da b o v e ，m a yc o n t r i b u t et o o p t i m i z et h e a n t i - t u m o rt h e r a p y o b j e c t i v e ： t oa p p r o a c hw h e t h e ro v e r - e x p r e s s e dp 6 2c o u l da g g r e g a t em o r eu b i q u i t i n a t e dp r o t e i n si n i i i d r i b b l e s m e t h o d s ： 东南人学倒il j 学付论文 r e c o m b i n a n tv e c t o rp 6 a - o ”p b u f i p w sc o n t a i n i n gt h eh b s a go ru b h b s a g g e n ew a s c o n s t r u c t e da n dt r a n s f e c t e di n t o h e p g 2c e l l l i n er e s p e c t i v e l y ( g r o u ph e p g 2 一h b s a ga n d g r o u ph e p g 2 一u b h b s a g ) s e l e c t i v em e d i u mw a su s e df o rg e t t i n gs t a b l ec e l ll i n e s t h e n p i r e s 2 e g f p 。p 6 2w e r e t r a n s f e c t e di n t o h e p g 2 - u b h b s a g s t a b l ec e l l l i n e ( g r o u p u b h b s a g + p 6 2 ) t h et h r e eg r o u p so ft r a n s f e c t e dc e l l sw e r ec u l t u r e di nt h em e d i u m i n c l u d i n gv e l c a d e ，r a p a m y c i na n da m m o n i u mc h l o r i d e a f t e r16h o u r s ，d r i b b l e sf r o mt h e m e d i u mw e r ee x t r a c t e da n d l y s e d ，a n dh b s a g w a sd e t e c t e db ye l i s a r e s u l t s ： r e c o m b i n a n tv e c t o rp 6 a - o p b u f i p w s - h b s a ga n dp 6 a - o p b u f i p w s - u b h b s a g w e r ec o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y i n c r e a s e dh b s a gw a st e s t e di nl y s a t ea f t e rh e p g 2 u b h b s a g c e l l sw e r ec u l t u r e di nt h em e d i u mi n c l u d i n gv e l c a d e b o t ho fh b s a gl e v e l si n g r o u p u b h b s a ga n dg r o u pu b h b s a g + p 6 2i n c r e a s e dw h e nt h ec e l l sw e r ec u l t u r e dw i t hv e l c a d e ， r a p a m y c i na n da m m o n i u mc h l o r i d e ，a n dt h el a t t e rw a sh i g h e rt h a nt h ef o r m e r c o n c l u s i o n s ： o v e r - e x p r e s s i n go fp 6 2a g g r e g a t e dm o r eu b i q u i t i n a t e dp r o t e i n si nt h ed r i b b l e se x t r a c t e d f r o mh e p g 2c e l l sa st h ep r o t e a s o m ep a t h w a yw a s b l o c k i n gb yt h ed r u g s k e yw o r d s ：h e p g 2c e l ll i n e ；d r i b b l e s ；p 6 2 ；h b s a g ；u b i q u i t i n i v 目录 巾文摘要。i a b s t r a c t 】 i 目录1 0 7 符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表 综j ! ! 1 前言15日u 吾l5 第一部分h b s a g 、u b h b s a g 真核载体的构建与真核表达1 7 材料和方法1 7 结果2 7 讨 仑3 3 第二部分对转染的h e p g 2 细胞d r i b b l e s 中h b s a g 含量的检测3 5 材料和方法3 5 结果4 0 讨论4 3 结论4 6 致谢4 7 参考文献4 8 作者简介5 0 v 东南入学硕t ：学位论文 符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表 v i 综述 综述 p 6 2 、自噬在肿瘤发生发展中作用的研究进展 自噬性程序性细胞夕e 亡广泛存在于真核细胞中，是不同于凋亡( i 型程序性死亡) 和 坏死的另外一条细胞死亡途径一1 l 型程序性夕e 亡途径。根据细胞内底物运送到溶酶体腔 方式的不同，哺乳动物细胞的自噬可分为三种主要方式：( 1 ) 人自噬( m a c r o a u t o p h a g y ) ， ( 2 ) 小a 噬( m i c r o a u t o p h a g y ) ，( 3 ) 分子伴侣介导的a 噬( c h a p e r o n e m e d i a t e da u t o p h a g y ) 。大 白噬，即通常所说的自噬，是细胞的自我消耗过程，以细胞质中m 现小泡为特征。这个 具有双层膜结构、包含长寿蛋白和细胞器的小泡被称为自噬小体。白噬小体最终被转运 到溶酶体并在其中降解1 。过度表达的、受损的和或衰老的蛋白和细胞器通过自噬被清 除，保持胞浆成分的稳定2 3 ，囚此自噬在维持细胞稳态方面起重要作用。已发现在多种 不同疾病中存在自噬缺陷，如肌病4 、神经元变性5 、微生物感染6 、炎性肠病7 ，一、衰老 9 以及肿瘤m 。除了前面提剑的自噬的基本功能外，营养缺乏、代谢应激、内质网应激、 辐射、抗肿瘤药等都能引起自噬。自噬参与细胞内物质与能量的循环，并因此在应激 环境下使细胞得以生存1 2 , 1 3 。 1 自噬与肿瘤 自噬缺陷引起肿瘤发生发展的机制正在受到广泛的关注。凋亡的失控导致的细胞无 法死亡在肿瘤细胞中时常可见，提示非j 下常的细胞存活促进肿瘤的进展。像自噬这样的 维持细胞生1 竽的机制的缺陷应该会破坏肿瘤的发生发展，但实际情况并非如此。 自噍相关基因( a t 曲在自噬的各个阶段都发挥着重要作用，包括自噬的诱导、小囊泡 的形成和自噬小体的降解，这些都首先在酵母菌中发现的1 40 自噬是进化保守的，并且 酵母菌中许多的a t g 蛋白都具有高度的同源性1 5 。b e c l i n l 是在哺乳动物中与酵母菌属 a t 9 6 v p s 3 0 基因同源的基因1 6 。自噬缺陷可能有促癌作用就是首先在对b e c l i n l 研究时 发现的 。在7 5 的卵巢癌、5 0 的乳腺癌、4 0 的前列腺癌巾均发现b e c l i n l 基因缺失 1 8 - 2 2 ob e c l i n l 可能是一种抑癌基因，这一假设在基因敲除的动物模型中被证实。b e c l i n l 仆 小鼠成年后易发生淋巴瘤、肝癌、肺癌，以及乳腺过增生、癌前病变2 3 刀。b e c l i n l 等位 基冈的缺欠也加速h b v 诱导的肝脏癌前损伤2 5 。此外，b e c l i n 俨幼鼠肾细胞和小鼠乳腺 上皮细胞可以永生，这些细胞表现出在代谢应激时缺乏白噬，在接种裸鼠后表现出肿瘤 特征2 6 - 2 8 。在一少部分的人乳腺痛中已发现比周围正常乳腺组织表达史低的b e c l i n l 2 9 ， 但b e c l i n l 等位基凶的缺失并因此导致自噬缺陷同乳腺癌之间的天系还需要进一步研 1 东南人学硕l j 学位论文 究。在多形性胶质母细胞瘸和其他高度恶性脑瘤中也发现b e c l i n l 的m r n a 和蛋白表达 水平降低3 0 。与之相反，大多数结直肠( 9 5 ) 、胃癌( 8 3 ) 巾榆测到的b e c l i n l 比j 下常胃、 结肠粘膜表达水半高引。凶此，町以认为b e c l i n l 抑制肿瘤的作用具自组织特异性，有 待进一步研究。b e c l i n l 表达一个亲b h 3 结构的仪螺旋，一般情况下b e c l i n l 与b c l 2 或 b c l x l 等处于结合状态，自噬受剑抑制3 2 。在营养匮乏的情况下，只有b h 3 结构域的 蛋白( 如b i d ，b a d ，b a k ，b i m 等) 通过竞争性干扰b e c l i n i 与b c l 一2 或b c l x l 问的作用来 诱导自噬3 3 - 3 5 。通过对与b e c l i n 1 相互作用蛋白的研究对自噬抑制肿瘤作用有了进一步 认识。免疫共沉淀法表明p 1 3 k i i i v p s 3 4 作为b e c l i n i 一种丰要的结合伴侣在自噬的发起 和肿瘤的抑制中发挥作用3 6 , 3 7 。紫外线辐射抵抗相关基冈蛋白u v r a g ，同b e c l i n l 和 p 1 3 k i i i 作用以促进自噬、抑制结肠癌的生长和恶性变3 8 。之后发现，b i f - 1 ，亦称s h 3 g l b i 或e n d o p h i l i nb 1 ，可以与u v r a g 和b e c l i n 1 相互作用，激活p 1 3 k i i i ，调节白噬，有 抑制肿瘤的作用，因为b i f - 1 十小鼠在1 2 周龄时均发生淋巴瘤和实体瘤”。 b e c l i n l + 小鼠在胚胎期就死亡了2 3 , 2 5 ，a t 9 5 十或a t 9 7 - - d 、鼠在出生后不久就死亡了 4 0 , 4 1 。成熟的b e c l i n l 廿小鼠有易发肿瘤的倾向，而a t 9 5 州一或a t 9 7 仆小鼠却不发生恶性肿 瘤，在a t 9 7 缺陷的肝组纵中未发现肿瘤形成或是异常增生。这些研究表明b e c l i n l 在胚 胎发育和肿瘤抑制方面比a t 9 5 和a t 9 7 更重要，或者只有b e c l i n l 在这方面起作用。在 接种到裸鼠的细胞中，a t 9 5 十i b m k 细胞比a t 9 5 卅一i b m k 或a t 9 5 卅+ i b m k 细胞更易转化 成肿瘤4 2 ，提示自噬缺陷在促肿瘤中确实发挥作用。缺乏a t 9 4 c a u t o p h a g i n - 3 ( 在l c 3 产 生过程中发挥作用的一种酶 ) 的小鼠对化学致癌剂引起的纤维肉瘤的易感性明显增加 更进一步证实了这点4 3 。 无论在肿瘤还是一常组织中，自噬使处于代谢应激下的细胞得以继续生存下去。但 前文介绍的诸多实验结果表明自噬可以抑制肿瘤的发生发展，自噬缺陷非但不会使肿瘤 死亡反而会促进肿瘤的发展，这就形成了一个悖论。对于这个现象，可以通过细胞外和 细胞自身两方面因素加以讨论。当细胞有凋亡或自噬缺陷时，受到损伤后无法经由这两 个途径死亡，只有通过另一种死亡方式坏死来结束生命。而坏死又与炎症细胞的招 募、细胞因子的产生和n f k b 的活化有关，这些已确定与促进肿瘤生长有关4 4 。因此， 自噬与凋亡一道通过消缓代谢应激，阻止肿瘤通过坏死死亡，从而抑制肿瘤。自噬抑制 肿瘤的作用还体现在它保持细胞的适应性及基因完整性上。自噬可以及时清除细胞质中 有缺陷的细胞器和错误折叠的蛋白，这些物质的聚集会引起氧化应激，造成d n a 损伤 和基冈组不稳定性，从而使细胞恶变。 2 综述 酾两 k ii ；* 妒 _ 圜 ，”一i 啼 l 主 a u t o p h a g y 。 图1 自噬途径的分子凋1 y 机制 p 1 3 k 通路下游激酶r o t o r ( m a m m a l i a nt a r g e to fr a p a m y c i n ) ，是自噬的主要调节者。 在营养充足、生长因子作用下，p 1 3 u a k t m t o r 通路( i 型p 1 3 k 通路) 处于激活状态， 蛋白质翻译、细胞生长、增殖，m t o r 抑制自噬。反之，饥饿抑制p 1 3 k 通路，使对自 噬的抑制解除，细胞通过自噬来临时性的维持能量代谢，避免死亡。自噬在肿瘤中的调 节遵循类似的规则，只足方式更复杂些，已经发现在肿瘤细胞中p 1 3 k 异常的频繁的活 化、p 1 3 k a k t m t o r 通路中多途径的相互作用还有其他细胞信号的级联都存在着失控 的现象。作为一种基本的，七存机制，p 1 3 刚a k t m t o r 的活化在人肿瘤中普遍存在4 5 ， 诸多因素都可导致该通路的异常活化，从而抑制了自噬，如磷酸酶的缺失、p e t n 的缺 失、i 型p 1 3 k 的增多或突变、a k t 的过表达、酪氨酸激酶生长因子受体的活化、暴露 于致癌物中等( 图1 ) 。这又产生了矛盾：i 型p 1 3 k 通路持续激活一方面促进肿瘤的不 断增值，这需要更多的能量供应，而当生长过快时就会出现能量供应不足，但自噬是处 于抑制状态的，无法为肿瘤细胞提供能量缺乏时的替代方案，肿瘤何以继续生长呢? 可 能是凋亡和或细胞代谢的失控这样的代偿机制发挥了作用。在凋亡自噬双缺陷肿瘤细 胞中，坏死和炎症l i jp l 匕是突出特征，d n a 更易受到损伤2 7 , 2 8 。而最近发现在凋亡自噬 双缺陷肿瘤细胞中p 6 2 蛋门的聚集会造成d n a 的损伤和基凶组不稳定性。促进肿瘤进 3 麟；闽；圈 缀芝 刍0 咨刍0 掺 东南人学顾i ：学位论文 展4 6 。i 型p 1 3 k 通路抑制剂锂、卡马西平，a k t 抑制剂p e r i f o s t i n e 、a p i 2 ，m t o r 抑 制剂如雷帕霉素、r a d 一0 0 1 和c c i 7 7 9 都i j j 以诱导白噬。而另一种通路i i i 犁p 1 3 k 则 是通过与b c c l i n l 形成复合物来诱导自噬( 图1 ) ，凶此，i l l 型p 1 3 k 抑制剂如甲基腺嘌呤 ( 3 - m a ) ，渥曼青霉素，l y 2 9 4 0 0 2 和p x 8 6 6 可以抑制白噬。 p 5 3 与自噬的关系比较复杂，冈为p 5 3 在自噬调节中起双重作用4 7 。肿瘤抑制因子 p 5 3 在基因毒性应激条件下( 如d n a 损伤、缺氧和癌基因的活化) 被激活并发起抑制肿瘤 的应答机制，如细胞周期停滞、衰老和凋1 l = 。在这些情况下，p 5 3 能激活自噬诱导基冈 并且通过抑制m t o r 来刺激自噬4 8 op 5 3 还叮以通过d r a m ( d a m a g e r e g u l a t e da u t o p h a g y m o d u l a t o r ) i 直接诱导自噬4 9 ( 图1 ) 。另一方面，遗传冈素或约理作用导致细胞质中p 5 3 的 失活同样能够触发自噬5 0 ，提示非核中的p 5 3 能有效抑制自噬。p 5 3 缺失致自噬的诱导 或对自噬抑制的负向调节，可能是肿瘤对活化的p 1 3 k a k t m t o r 通路抑制自噬的一种 代偿。另外，l k b l 、t s c 2 、p t e n 等抑癌皋因的突变，都激活m t o r 并抑制自噬，导致 错构瘤”。 c a 2 + 钙调蛋白依赖性激酶激酶p ( c a m k k l 3 ) 可以通过激活a m p k 最终抑制m t o r 而 实现激活自噬5 2 ( 图1 ) 。细胞质中升高的游离钙离子也刺激死亡相关蛋白激酶( d a p k s ) 和钙蛋白酶( 图1 ) ，这些酶与自噬5 3 。5 5 和癌症5 6 , 5 7 调节都有关系。近来发现，细胞受到 损伤引发e r 应激，导致错误折叠蛋白或未折叠蛋白的聚集，这些聚集体( a g g r e g a t e s ) 通 过蛋白激酶样内质网激酶( p e r k ) 、i r e l 和升高的游离钙离子依赖机制上调自噬。内质 网应激和u p r ( u n f o l d e dp r o t e i nr e s p o n s e ) 如缺氧和缺乏糖类等，经常在快速生长的肿瘤中 出现。e r 应激和u p r 的激活一般被认为在肿瘤演进中是把双刃剑：它们可以引起凋 亡并促进肿瘤的死亡，但是也可上调肿瘤细胞的适应性反应，通过使肿瘤细胞对代谢应 激的抵抗而使它们更具有侵袭性，对化疗药产生耐受，并且有助于它们的转移。r a s 通 过两条途径调节自噬：1 通过激活l 型p 1 3 k 和a k t m t o r 通路抑制白噬5 8 ，2 通过 r a f l m e k l 2 e r k l 2 通路激活自噬6 1 。但自噬与r a s 在肿瘤发生发展中的作用关系还 不甚明了，白噬抑制可能会通过前述的细胞自发机制和或细胞外机制引发r a s 肿瘤，也 可能在肿瘤迅速生长或药物治疗诱导的代谢应激情况下自噬使r a s 肿瘤得以生存。 凋亡是一种受到严格调控的细胞死亡机$ 1 j ( i 型细胞死亡) ，活化后清除不需要的或不 可逆损伤的细胞，而自噬包含了细胞的“自我消化”，作为一4 种对应激的适应性反应使 细胞得以生存。与凋亡类似，在应激持续存在时，自噬也可引起细胞死亡( 冈此被称为 i i 型细胞死i 、：) 。前义已谈到凋亡调节因子如b c l 2 b c l x l 和只有b h 3 结构域蛋白同 4 b e c l i n l 作用并可调节自噬( 图1 ) 。正性调肖凋产也町以诱导白噬，因为在相同的应激条 件下两个通路都是被激活的。自噬与凋亡功能上的联系是：在这两个应激应答通路r t l 活 化和执行是有明确等级之分的。有凋亡活性的细胞在严重应激时趋向丁遭受快速清除式 的凋亡死亡，而不会激活任何自噬信号，向凋f ：缺陷细胞则可通过上调自噬来延长对应 激的耐受2 6 - 2 8 , 6 2 。另一方面，当白噬被阻断时，促进了凋亡6 3 , 6 4 或凋亡缺陷细胞在经受 致命性打击后通过坏死死亡2 6 , 6 5 。凶此，细胞住对代谓j 应激广：生应答时的命运是由其功 能状态和凋亡与自噬问相互作用所决定的6 6 。 在凋亡功能完整的细胞中经常观察不剑自噬，因为这些细胞在遭受强烈的应激后通 过凋亡而死亡。而在凋亡缺陷背景f 自噬作为生存手段而很容易观察到2 6 , 2 7 , 6 2 ，因此在 有凋亡缺陷的肿瘤细胞中会出标志性的治疗诱导的白噬。在这种情况下，细胞可能通过 其他非凋亡通路死亡，包括坏死2 6 , 2 7 和j 叮能的自噬6 7白噬在细胞死亡机制中所起到的 积极作用可以通过记录下调自噬后细胞的存活时间加以研究。已经有成功的报道。但是 这些研究所面临的挑战是，大多数情况下，在细胞应激状态下抑制自噬的同时也降低细 胞的活性2 7 , 6 2 , 6 8 , 并且改变细胞死亡模式：要么凋亡要么坏死。 2 自噬与p 6 2 近来研究发现，p 6 2 在多种信号传导途径中发挥重要作用。研究表明，人和小鼠p 6 2 蛋白分别含有4 4 0 和4 4 2 个氨基酸，二者具有高度同源性。p 6 2 蛋白包含五个结构域。n 端的p h o x 和b e m l 结构域( p b l ) ，通过p b l 结构域p 6 2 能发生自我聚集( s e l f - l i g o m e r i z a t i o n ) 或介导p 6 2 与其他含p b l 结构域蛋白发生聚集；c 端的泛素相关结构域 ( u b i q u i t i n a s s o c i a t e dd o m a i n s ，u b a ) ，泛素化的靶蛋白能通过u b a 结构域与p 6 2 发生结 合6 9 ，7 0 ；中间段含有锌指结构域( z i n cf i n g e r , z i n c ) ，t b s 结构域( t r a f 6b i n d i n gs i t e ) 矛t il i r 结构域( l c 3 一i n t e r a c t i n gr e g i o n ，l i r ) 。错误翻译、错误折叠、突变变性的蛋白等可泛素化 后通过蛋白酶体途径降解，也可通过p 6 2 蛋白c 末端的u b a 结构域与p 6 2 发生结合， 而p 6 2 通过n 端的p b l 结构域发生自我聚集或与其他含有p b i 结构域的蛋白发生聚集； 聚集的p 6 2 和泛素呈刚性的聚集体在萨常条件下能通过p 6 2 上的l r s l i r 与a t 9 8 l c 3 结合并形成复合物、并由l c 3 介导形成自噬小体；最后自噬小体与溶酶体融合完成蛋白 的降解( 图2 ) 。p 6 2 通过“泛素p 6 2 - l c 3 白噬小体途径”参与了泛素化蛋白的细胞自噬降 解，肿瘤细胞( 作为抗原供者细胞) l a “泛素p 6 2 l c 3 自噬小体途径”是否影n 向自噬小体内 泛素化蛋白的含量尚不清楚。p 6 2 可以通过t b ( t r a f 6 b i n d i n g d o m a i n ) 或u b a 结构域与 n f k b 相关信号通路中的t r a f 6 或泛素化的t r a f 6 作用活化n f k b ，同时促进p 6 2 5 东南人学帧i ：学位论文 通过p b i 进一。步聚集和活化6 9 , 7 2 。在p a g e t 病动物模型巾，缺乏t r a f 6 的小鼠同缺乏 p 6 2 小鼠的小鼠表现出的症状类似6 9 0 另一方面，p 6 2 还参与到t r a i l c a s p a s e 8 凋亡信 号通路中7 3 因此可以说p 6 2 j 细胞生死相关( 图3 a ) 7 4 。 a 图2 p 6 2 调：仃泛素化靶蛋白的自噬降解 t r a l l if a d d d i s c c a s p a s e 8 l c u l 3 u b l c a s p a s e - u b l e x e c u t l o n e r c a s p a s e s i 一，酗2i s p e c k l e s e r k j d i p o 口e n e s i 0 u b - t r a f 6 l n f k b l c e l ls u r v i v a l b m e t a b o l i c j l 蜘哗 黜t u m o r i g e n e s j s c r a s ! 竖 p 1 3 k t r a n 3 | o r m a h o nr o sh 一n f - 8 i c e l ld e a l h 图3 p 6 2 的功能示意图 6 ，虬f i b州；觚，r r t l 练 銮 p 6 2 通过l i r ( l c 3 一i n t e r a c t i n gr e g i o n ) 与a 噬调节因子a t 9 8 l c 3 结合，与在自噬缺陷小 鼠中发现p 6 2 的聚集梢符4 6 ，提示p 6 2 与白噬相关。p 6 2 通过自噬途径结合和转运泛素 化、错误折卺的蛋白和功能失调的细胞器的功能对细胞的生存具有重要意义，凶为在病 理情况下对毒性聚集体的处理足细胞避免死亡的基本方式。缺少a t 9 7 的小鼠在自噬中 受伤，导致在脑和肝组织中出现山p 6 2 聚集的泛素化蛋白；而住i 础对缺乏p 6 2 和a t 9 7 的小鼠中，这种聚集则完全消失，提示p 6 2 在聚集体形成过程中扮演重要角色并且可能 主要通过自噬进行降解4 6 。所以，p 6 2 不仅在信号转导中起重要作用，在对毒性聚集体 的清除机制中也起到重要作用。 近期研究显示，在自噬匮乏缺陷细胞巾，p 6 2 的聚集会抑制蛋门酶体，降低泛素化 蛋白的降解。其原因足损伤的蛋白酶体活性，而不是p 6 2 的结构和功能引起的。而当自 噬缺陷细胞中过表达的p 6 2 被除去时，蛋白酶体不冉被抑制，聚集的泛素化蛋白能被有 效的清除，聚集体就不会形成。7 5 。这就可以解释了在同时缺乏a t 酊和p 6 2 的小鼠中因 为没有p 6 2 的聚合作用而导致没有聚集体4 6 o p 6 2 作为毒性聚集体的清除者，是这些聚 集体形成的根本原因。p 6 2 聚集这些具有细胞毒性的错误折叠蛋白，使其不冉游离于细 胞质中，从而降低它们的毒性，之后再将这些聚集体带上降解之路。因此，如果p 6 2 的 作用是清除这些“毒性产品”，a t 9 7 和p 6 2 双缺陷小鼠将因为毒性物质无法被清除导致肝 损伤比只有a t 9 7 缺陷小鼠更严重。令人惊讶的足，在敲除a t 9 7 和p 6 2 基因小鼠中p 6 2 的缺乏减轻了自噬缺陷导致的肝脏损伤。其可能与p 6 2 激活c a s p a s e 通路的作用有关7 3 。 肝毒性与自噬缺陷可以活化c a s p a s e 引发凋亡，而a t 9 7 缺陷肝细胞中p 6 2 的缺失将减少 c a s p a s e 活化引起的凋亡。这就可以解释为什么a t 9 7 和p 6 2 缺陷的小鼠比只敲除a t 9 7 的小鼠更健康。认识聚集体的本质和构成以及它们同i l 1 或t r a i l 活化的p 6 2 信号通 路的关系将有助于了解聚集体足如何引起病理反应的。 3 p 6 2 与肿瘤 前文已经提到，代谢应激时，自噬可以阻止基因的不稳定性从而抑制肿瘤的发生。 m a t h e w 等的研究表明自噬缺陷导致p 6 2 的聚集促进肿瘤发生发展。在自噬缺陷和丧失 凋亡能力的肿瘤细胞中，代谢应激导致p 6 2 的聚集，提高了内质网蛋白陪伴分子 ( e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ( e r ) c h a p e r o n e s ) 的表达，损伤线粒体、降低活性氧蔟( r o s ) 水平。 在动物模型中观察到接种了过表达p 6 2 的肿瘤生长更迅速4 6 ( 图3 b ) 。在早先的实验中， n f k b 活性的下调阻止了r a s 诱导p 6 2 缺陷小鼠的永生胚胎成纤维细胞的癌变阳( 图3 c ) 。 这蝗都提示p 6 2 表达水平的升高与肿瘤的发生发展密切相关。有趣的是，在由r a s 诱导