（作物遗传育种专业论文）小麦成熟胚脱分化的组织定位及细胞壁相关基因表达研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺 学位论 小麦成熟胚脱分化的组织定位及细胞壁相关 学位 文题目硕士 基因表达研究 级别 学生学科导师 姓名 沈向磊作物遗传育种陈军营 专业姓名 学位论文 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：i 也内磊导师签名：7 i j 息衫衫 日期：胁月2 凋 日期：腓月让日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签名：1 吹确锄导师签名：鼬卜簪磊 学院领导签名： 日期：弘孵 月谓日期：纠年6 月2 2 日 日期：年月日 致谢 本论文是在导师陈军营的悉心指导下完成的，从论文的选题、实验方案的设 计、实施到论文的构思、语言的完善，都包含着恩师的辛勤劳动。三年来，恩师 严谨的治学态度，渊博的专业知识，忘我的敬业精神，求实的作风，对科学工作 的执著追求，为我今后的学习和工作树立了典范。师恩难忘，在此，谨向我的导 师陈军营副教授表示最诚挚的敬意和最衷心的感谢! 特别感谢陈新建教授在论文的选题、实验的设计和实施过程中给予的精心指 导、全面的支持! 同时，实验过程中也得到了崔党群教授、詹克慧副教授、许海 霞老师、程西永老师的帮助，在试验实施过程中，提出许多宝贵意见和建议，他 们严谨的治学态度和对科学孜孜以求的精神，将使我终生受益，在此表示诚挚的 感谢! 感谢师兄文付喜、阮祥经、舒文涛，师姐岳润清、王沙沙、朱雪萍、白桦举、 孙佩，同窗丁明丽、耿华春、郑磊、李伟以及师弟师妹们在试验实施过程中给予 的建议和帮助。 另外，感谢武汉大学生命科学院陈进明博士和刘帆博士在实验过程中提供帮 助。 衷心感谢我的父母及家人在生活、学业和精神上给予的理解、支持和帮助， 是他们激励我永远向上，保持良好心态，不断战胜困难。父母勤劳善良、为人忠 厚的品格深植在我的心中，使我拥有面对生活的信心、勇气和动力。在此，向他 们致以最诚挚的感谢! 沈向磊 2 0 0 8 年6 月于郑州 摘要 本研究以豫麦1 8 为材料，从外部形态、细胞结构及基因表达等不同层面对小麦成熟胚 脱分化进行了研究，以期揭示小麦成熟胚脱分化的组织定位和分子机理。主要研究结果如下： 本文应用显微技术，观察了小麦成熟胚脱分化过程中细胞的形态变化，并对脱分化的起 始部位进行初步定位。结果表明，小麦成熟胚脱分化首先发生于胚根鞘细胞，这些细胞在2 ， 4 d 诱导条件下，培养6 h 启动脱分化，逐步回复变化为薄壁细胞，至2 4 h 便有愈伤组织形 成，培养7 2 小时，小麦成熟胚已经脱分化形成体积较大的愈伤组织团，这些愈伤组织主要 由胚根鞘细胞脱分化而来的薄壁细胞组成。其主要表现为，细胞间隙增大，体积逐渐变大， 细胞中液泡明显，细胞核变大，被大液泡排挤到细胞边缘。经透射电镜观察表明，小麦成熟 胚脱分化过程中细胞壁变薄，细胞器种类增多，线粒体、内质网等细胞器数量增加，淀粉粒、 脂体等物质密度减小至消失，随着原有物质的消失和新物质出现，细胞质重新组合。 为研究小麦成熟胚脱分化分子机理，本研究利用a f f y m e t r i xw h e a tg e n e c h i p 固基因芯 片技术在转录水平研究了细胞壁相关基因在小麦成熟胚脱分化过程中的表达变化。以小麦成 熟胚脱分化起始o 点为对照，分别研究o 、2 、6 、1 2 、2 4 和7 2 h 时这些基因的表达变化，将 那些与0 点比值大于2 或小于0 5 ，即表达变化两倍以上的基因视为有意义的基因，分析了 这些发生有意义变化的细胞壁相关基因在小麦成熟胚脱分化中的表达情况。结果表明，在含 有6 11 2 7 个探针组，代表了5 5 0 8 5 个基因的小麦基因组表达谱上，发生有意义表达变化的基 因共约有1 5 0 0 0 个。其中，有1 3 8 个细胞壁相关基因在小麦成熟胚细胞脱分化过程中至少在 一个时间点中发生了有意变化，它们的表达产物按功能分为8 类：分别是伸展蛋白、扩张蛋 白、纤维素合成酶、纤维素酶、甘露糖磷酸变位酶、半乳糖激酶、肉桂酰c o a 还原酶、尿 苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶。分析表明，伸展蛋白基因4 5 个，扩张蛋白基因4 8 个，它们大 多表达上调，推测这些基因对小麦成熟胚细胞脱分化过程中细胞壁的伸展起重要作用。其中， a y 5 4 3 5 4 2 1 、c d 4 9 0 9 1 7 、a y 5 4 3 5 4 4 1 、b j 2 4 9 7 6 2 等扩张蛋白基因在0 7 2 h 主要为上调，且 在2 4 h 或7 2 1 1 时上调倍数为2 0 0 以上。c a 6 4 0 2 3 2 、c a 6 0 4 1 5 9 、c a 6 4 1 4 4 6 等伸展蛋白基因 在2 4 h 或7 2 1 1 也达到最大值，上调倍数3 0 以上。细胞壁扩张蛋白和伸展蛋白基因在小麦成 熟胚脱分化过程中的表达，与我们观察到的细胞壁变化是相对应的，也说明了细胞结构与功 能的统一。与细胞壁物质代谢相关的基因4 5 个，包括纤维素合成酶基因1 3 个，纤维素酶基 因2 个，甘露糖磷酸变位酶基因3 个，半乳糖激酶基因8 个，肉桂酰c o a 还原酶基因1 6 个，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因3 个。这些基因在小麦成熟胚培养的整个过程或某些 时间点表现为上调表达，它们对小麦成熟胚细胞脱分化过程中细胞壁物质的合成和分解起到 重要作用。 关键词：小麦成熟胚；脱分化；差异表达；基因芯片；细胞壁 1 文献综述 1 1 细胞脱分化研究概况 1 1 1 植物组织培养概述 植物组织培养( p l a n tt i s s u ec u l t u r e ) ，是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、 细胞以及原生质体等，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的 植株。关于组织培养的原始概念，可以追溯至u 1 8 3 9 年s c h w a n 发表的细胞学说。他说：“每一 个细胞应该可以独立生活和发展，假如具有的条件正如它存在于有机体内一样”n 1 。 1 9 0 2 年，德国著名植物学家h a b e r l a n d t 在细胞学说的启发下，提出了高等植物的组织和器官可以 不断分割直到单个细胞的观点。他认为如果每个细胞都有植物个体一样的性质和能力，那么 可以通过植物细胞培养，把单个细胞培养成为一个新个体口1 。这便是植物组织培养的经典依 据植物细胞全能性思想出现。为了论证这一观点，一些学者对高等植物的叶肉细胞、髓 细胞、气孔保卫细胞和表皮细胞等材料进行了离体无菌培养，但由于取材不当及培养基中不 含诱导激素，试验均未获得成功，植物组织培养技术几乎没有什么进展。直到1 9 3 4 年w h i t e 以番茄根为外植体建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养首次获得成功口1 ；同时 他于1 9 3 7 年发现了b 族维生素在离体培养中的作用，并指出了i 从对控制植物生长的意义，且 首次建立了组织培养的综合培养基h 1 。1 9 3 9 年，g a u t h e r e t 在添加b 族维生素和i a a 的培养基 上连续培养胡萝卜根的形成层获得成功。n o b e c o u r t 于1 9 3 8 年以胡萝卜根为外植体，在固体 培养基上诱导形成了愈伤组织。因此，w h i t e 、g a u t h e r e t 、n o b e c o u r t - - 起被誉为植物组织 培养的奠基人，主要在于他们建立了植物组织培养的综合培养基，基本上建立了植物组织培 养技术。 4 0 年代末，植物组织培养的研究工作开始从细胞的脱分化研究进入到探讨调控细胞培养 物器官分化和形态建成的研究中。早在1 9 3 8 年，f w w e n t 就曾提出器官的形成受特殊物质 作用的假说，即成根素、成茎素和成叶素。1 9 4 1 年，o v e r b e e k 等在培养基中附加椰乳，获得 了蔓陀螺离体胚培养的成功。后来的研究发现，椰乳在组织培养中起主要作用的成分是腺嘌 呤类激素或类似物。1 9 4 4 年，s k o o g 报道d i n a 的降解产物腺嘌呤和腺苷可以促进愈伤组织的 生长，诱导芽的形成。1 9 4 8 年，c a p l i n 等用实验证明椰乳与2 ，4 d 配合，对培养的胡萝卜和 马铃薯组织的增殖起到明显的促进作用。近代关于器官形成的概念，主要是由s k o o g 和崔澄 在1 9 4 8 年培养烟草茎切段和髓的过程中建立起来的。他们在研究中发现腺嘌呤或腺苷可以解 除培养基中生长素i a a 对芽的抑制作用，并诱导烟草茎切段形成芽，由此发现腺嘌呤与生长 素的比例是控制芽和根分化的决定性因素之一。这一比例高时，有利于形成芽，而这一比例 低时，有利于形成根。这惊人的发现成为植物组织培养中控制器官分化和形态建成的重要 激素模式，打破了离体培养中组织只能增殖不能产生器官分化的看法，为植物组织培养的发 展作出了巨大贡献。1 9 5 7 年，s k o o g 和m i l l e r 啼1 提出有关植物激素控制器官形成的理论，他们 2 发现调节生长素和细胞分裂素比例，可以控制愈伤组织的分化，使植物组织培养的工作迅速 取得突破。1 9 5 6 年m i l l e r 和s t r o n g r 等人发现了激动素，它和吲哚乙酸的比例对器官发生的作 用比腺嘌呤和生长素的比例对器官发生的作用更敏感，同时可使作用效果增加约三万倍。从 这以后，在器官分化时一般都采用激动素或其类似物代替腺嘌呤。在上述这些工作的基础上， 导致了s t e w a r d 等人在1 9 5 8 年诱导培养的体细胞分化形成完整植株获得成功，他们用胡萝卜 的体细胞进行培养，经过“胚状体阶段形成个体植株，经移栽后开花结实。1 9 6 5 年由v a s i l 等用分离的单个细胞培养获得完整植株。继之，g u h a 等( 1 9 6 6 ，1 9 6 7 ) ，r o u r g i n 等( 1 9 6 7 ) 先后利用烟草和胡萝卜的小孢子培养获得单倍体植株，成功地实现了染色体的加倍，并在5 个月内收获到种子。c o c k i n g 等用纯化的纤维素酶和果胶酶处理烟草细胞，获得原生质体， 通过调节渗透压的方法控制原生质体膨胀，使培养获得成功，得到了再生植株。他们的这些 研究使得植物细胞“全能性”学说得到了科学的证实。 2 0 世纪6 0 年代以后，随着组织培养技术日趋完善和成熟，对组织培养中细胞生长和分化 规律的认识也不断深入，植物组织与细胞培养得到广泛的发展和应用。1 9 5 2 年，m o r e l 和m a r t i n 首次证实，通过茎尖分生组织的离体培养，由已受病毒浸染的大丽花中获得无毒植株。1 9 6 0 年，m o r e l 提出并建立了第一个离体繁殖兰花种苗的方法，很快在兰花生产中广泛应用。1 9 6 4 年，g u h a 和m a h e s h w a r i 采用曼陀罗花药培养首次获得成功。此后l o 多年中，数十种植物通 过花药培养获得成功。g a u t h e r e t 哺1 用胡萝卜根组织离体培养，经脱分化形成愈伤组织并分化 形成植株。1 9 7 1 年，t a k e b e 等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，从而促进了体细胞 融合技术的发展。1 9 7 2 年，c a r l s o n 等通过两个烟草种间原生质体的融合，获得了第一个体细 胞杂种。这为克服远缘杂交不亲和找到了新的途径。目前，胚培养、茎尖培养、细胞悬浮培 养、原生质体培养、花药培养、体细胞杂交、人工种子技术等在杂交育种、脱毒快繁、次生 代谢产物生产、有用突变体的筛选、植物种质保存及基因工程等方面得到广泛应用1 。此外 植物组织培养技术己渗透到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学等各个 研究领域，成为生物学科中的重要研究技术和手段之一，在农业、林业、工业、医药业等多 个行业，产生了巨大的经济和社会效益，成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。 1 1 2 植物细胞脱分化过程中的生理活动与细胞结构变化 近几十年来，随着植物组织和细胞培养工作的蓬勃发展，有关的学者，特别是英国的学 者对外植体脱分化时形成愈伤组织过程中的细胞结构变化做了许多工作，发现其主要的变化 发生于细胞质。他们看到当静止细胞分化过渡到细胞分裂时，细胞质生长很快，细胞质中多 聚核糖体数量明显增加，线粒体增加，高尔基体和内质网也不断增加，并不断产生囊泡哺1 。 在烟草叶片外植体细胞的脱分化中，原质体是通过叶绿体出芽产生的，原有的叶绿体变成造 粉体，并在脱分化分裂之前，液泡中首先出现一种蛋白质陋删。当水稻等植物的愈伤组织分 化根和芽时，细胞中的质体、线粒体和核糖蛋白体的数量增多，而贮藏的淀粉和脂类物质消 失。在番茄子叶外植体细胞的脱分化及其愈伤组织再分化过程中，不仅观察到类似以上的各 3 种超微结构的变化，还观察到细胞核膜与质体的连络现象。许多研究者曾企图找出细胞脱分 化所特有的亚显微水平上的形态特征，但未得到理想的结果。朱至清在研究烟草细胞脱分化 的过程中观察到，从培养2 0h 开始至3 _ 4d ，脱分化细胞的液泡出现电子密度很高的圆球体， 同时还可观察到液泡中有一些新形成的细胞质团可能是在蛋白体的基础上形成的，其结果是 实现细胞脱分化过程中的细胞质改组。c i o n n i 等在1 9 8 7 年也报道了类似的研究结果。在大多 数情况下，蛋白体的出现和细胞质密度增加是同步的，这一现象被认为是细胞开始脱分化的 标志。2 0 0 1 年，z h a o 等人以烟草叶肉细胞原生质体为材料，采用流式细胞仪和微球核分析技 术，首次成功地观察到了烟草叶肉细胞脱分化过程中染色体的二次解凝聚过程。第一次解 凝聚发生在细胞壁酶解过程中，第二次发生在激素诱导3 6h 后，根据它们的实验结果显示， 第二次解凝聚对于细胞进入s 期很重要，而在没有激素的培养基中的细胞，染色体不发生第 二次解凝聚，细胞迅速死亡。可见，细胞的第二次解凝聚过程是与细胞有丝分裂周期联系在 一起的，而第一次解凝聚是和细胞进入脱分化有关的，可能是为细胞进入脱分化作准备。可 见细胞脱分化涉及到很多基因的表达，染色体的解凝聚只是有利于细胞脱分化相关基因的转 录。细胞脱分化是一个复杂的过程，在此过程中，有关基因的表达调控及其基因的协同作用 还不清楚。d u d i t s 等n 2 1 3 1 认为，胚生能力的获得主要取决于脱分化过程。因为在脱分化 中必须删除或改变原有的发育信息才能使细胞对新信号做出相应的响应。从已分化、静止的 细胞到脱分化、分裂和胚生状态的细胞的启动很可能涉及到基因表达的“重新编程”，说明 细胞在脱分化中通过某种方式已经获得了能否再生的相关信息，从而决定了脱分化的质量， 最终决定了愈伤组织的再生能力。 1 1 3 细胞脱分化调控机理 1 1 3 1 细胞周期调控 正常情况下，细胞周期是一个连续的不可逆过程，一旦d n a 发生复制，随后即进入分离 状态开始形成2 个子细胞。因此，细胞通常在g - 时期通过某些机制来决定是否进入s 期。 2 0 世纪7 0 年代，研究者发现g 。细胞中存在特定的调控点，称为“限制点”( rp o i n t ) 。这 个点之前，如果缺少外界生长信号( 通常是肽生长因子) 或某些必需的营养成分，细胞会终 止其g ，期的进程，进入静止状态称为g 0 期，一旦补充了所缺少的因子之后，细胞即会从g 口 期回到g 。期继续分裂周期。2 0 0 1 年度的诺贝尔生理学及医学奖获得者、美国科学家h a r t w e l l 与英国科学家h u n t 和n u r s e 的工作揭开了这一过程的调控机制。他们发现，真核生物细胞 中存在有复杂的调节细胞周期的关键因子，它们通过相互制约或偶联形成复杂而精确的细胞 周期调控网络。在这些关键因子中，c y c l i n ( 细胞周期蛋白) 和c d k ( c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e ，周期蛋白依赖激酶) 是两类主要的调控分子。细胞周期运行的动力主要来自c d k ， 其活性则主要通过c y c l i n 调节。目前已发现细胞内存在有不同类型的c y c l i n 和c d k ，c d k 在相应的细胞周期时与其相对应的周期蛋白结合而被活化。同时，为了保证细胞在分裂时各 环节的正确性，c d k 的活性还受另外一类蛋白质的负向调节，这类蛋白质称为c k i 4 ( c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o r ，周期蛋白依赖激酶抑制因子) 。这为理解细胞脱分 化进而启动分裂和再生器官或个体奠定了基础。 现有的研究资料表明，植物细胞周期的调控主要有两类c d k ( c d k a 、c d k 咱) 和两类细 胞周期蛋白( c y c b 、c y c d ) 。在环境或激素等外界条件作用下，c y c d 基因首先表达生成c y c d ， 在相关调节因子的帮助下，c y c d 与c d k - a 结合形成c d k - a - c y c d 复合体使c d k - a 活化，进而 对r b ( g 。期限制点调节因子) 磷酸化，使细胞通过“限制点”进入分裂周期。然后，由c d k b 与c y c b 以及相关的调节蛋白完成从s 期到m 期的调控。而在离体培养条件下由于所取外植 体细胞在植物体内所处的组织器官不同，其分化状态也存在很大差异，不同分化程度的细胞 是否存在相同的细胞分裂周期激活机制，在不同的培养诱导中是何种机制首先感受培养条件 的刺激进而启动细胞进入分裂状态等，目前还没有足够的研究。然而，1 9 9 2 年n a g a t a 等建 立的高度同步分裂的烟草细胞系b y 一2 及其细胞同步化技术的应用，为植物细胞脱分化及其 相关研究提供了方便鲴。近年来，利用这些系统对脱分化细胞的调控研究已取得很多重要进 展，并已分离和检测出多个与植物细胞脱分化相关的基因，为了解植物细胞在培养条件下脱 分化，进而进入有丝分裂周期的调控过程奠定了基础。 1 1 3 2 激素的作用 激素的成分和浓度是诱导植物细胞脱分化最重要的因素，外源激素首先激活外植体细胞 中特定基因表达，诱导细胞进入脱分化过程。目前已从不同植物中克隆出多个植物激素诱导 表达的基因，但大部分基因的功能尚不清楚。研究证明，植物激素本身并不能直接作用于 d n a 从而导致特定基因的激活，而是需要其受体蛋白以及其他信号转导过程的参与。被激活 的受体可能引起某些特定的反应，进而引起一系列连锁信号的传导反应，最终导致生长素诱 导的基因表达n 即。1 9 8 9 年，t a k a h a s h i 等从叶肉细胞原生质体e d n a 文库中分离到2 ，4 - d 诱导的基因的转录表达，他们把这个基因命名为p a r 基因，在没有2 ，4 _ d 的培养基里检测 不到该基因的表达，在旺盛生长的烟草悬浮系中表达量也很弱。迸一步研究表明，该基因在 细胞从g o 期转入s 期的早期启动中具有功能性作用h 们。此后，该实验室在1 9 9 4 年，分离出 3 个生长素调节基因并分别命名为p a r a , p a r b 和p a r c 。其中，p a t h 编码谷胱甘肽一s 一型转 移酶，p a r a 和p a r c 被认为在生长素诱导后在转录调节中起到关键性的作用 1 7 o m a t s u b a y a s h i 和s a k a g a m i 应用一个竞争性酶联免疫分析系统，在石刁柏叶肉细胞低密度悬浮培养系统中， 分离到两个促进细胞分裂的黄肽素，p s k a ，p s k 一夕。在培养基里没有n a a 和b a 的培养细胞 里，检测不到p s k 一盯的存在，同时细胞也停留在g o l g t 期而不启动分裂。由此推测，在细胞 脱分化和促进细胞分裂的过程中，p s k a 可能介导了与生长素和细胞分裂素密切相关的信 号传导途径舭埘。p s k 与p s k 受体结合是一个涉及到植物细胞脱分化以及保持细胞脱分化状 态的级联信号调节机制幢训。 1 1 4 细胞分裂与愈伤组织形成 通常情况，培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过 5 程就是细胞脱分化。但对于细胞脱分化是在启动分裂的过程中完成，还是发生在细胞分裂之 前，尚存在不同观点。一种观点认为，在离体培养条件下，一个分化细胞转变为分生状态， 进入细胞分裂的现象即为脱分化。另一些学者认为，细胞脱分化发生在细胞分裂之前，细胞 分裂是细胞脱分化的结果，而不是脱分化的过程。张丕方等口u 在烟草表皮薄层细胞培养的活 体连续观察和d n a 测定中，提出脱分化过程发生在第一次有丝分裂之前。并认为植物细胞中 执行一定功能的g o 期细胞在接受外界信号以后，在基因选择性表达基础上，经过一系列生 理、生化变化，脱离g o 期重新进入细胞周期的过程就是脱分化。随着细胞分子生物学研究 的不断深入，这一观点已被众多研究者认可瞄 符1 。 对于单个细胞而言，分化细胞启动分裂显然是发生在细胞完全脱分化之后，其第一次分 裂方式比较复杂，分裂方式与外植体细胞类型有关。 对于组织器官培养而言，细胞分裂首先发生在组织分离时的伤口部位。在组织培养中通 常可以观察到，一旦伤口处某些细胞启动分裂，之后可很快影响整个外植体细胞进入分裂周 期而启动分裂。 在大多数情况下，细胞脱分化后进入细胞分裂的结果都是形成愈伤组织，但并不是所用 的细胞脱分化都一定要形成愈伤组织。许多实验表明，有些外植体的细胞脱分化以后直接形 成胚性细胞，进而形成体细胞胚。愈伤组织和脱分化是两个不同概念，脱分化与愈伤组织的 形成在性质上是不能等同的，脱分化是细胞生理状态的改变，而形成愈伤组织是离体培养中 的一个阶段。愈伤组织的形成与脱分化发生的时期不同，一般认为诱导启动是脱分化的开始， 进入分裂期是脱分化的完成。而愈伤组织的形成不单包含脱分化的全部过程，而且包含细胞 形成愈伤组织的分裂期。 1 2 小麦愈伤组织诱导 1 2 1 小麦成熟胚离体培养 因为小麦成熟胚具有取材方便的优点，所以用它作为外植体进行离体培养，建立小麦再 生体系引起了人们的广泛关注。和小麦幼胚离体培养研究一样，在小麦成熟胚离体培养研究 中，2 ，4 - d 是用得最为广泛生长素类激素，而且小麦成熟胚对2 ，4 d 的耐受程度极强1 。 m g m e n d o z a ，e ta l ( 2 0 0 2 ) 比较了几种激素：2 ，4 - d ，d i c a m b a 和p i c l o r a m 对成熟胚离体培养 的影响，结果表明p i c l o r a m 虽然对愈伤组织的形成有利，但对愈伤组织的再分化不利瞄1 。 b l i u ，e ta l ( 1 9 8 8 ) 用1 0 个春小麦品种的成熟胚进行试验表明：在m s 培养基中添加2 m g 2 ， 4 - d 和0 5 m g n 从可达到最好的效果嘲。s k i n t z i o s ，e ta l ( 1 9 9 6 ) 认为2 ，4 - d 和k t 组合有利 于小麦成熟胚愈伤组织的形成，但对根芽分化有不利的影响，而激素对成熟胚愈伤组织的形 成是必不可少的踟。李宏潮等( 1 9 9 0 ) 啪1 指出，a b a 仅对根的分化有促进作用：而于晓红等 ( 1 9 9 9 ) 认为a b a 有利于成熟胚愈伤组织的诱导和愈伤组织再生能力的保持矧。在早期的小麦 成熟胚离体培养的研究中，取得的效果不是很显著。不少研究者指出成熟胚来源的愈伤组织 再分化为植株的能力较差鼽3 1 1 。随着对小麦成熟胚离体培养研究的不断深入，人们在这方 6 面取得了很大的进展。k a s e mz a h m e d ，e ta l ( 1 9 9 2 ) ，t b o rb a r t o k ，e ta l ( 1 9 9 0 ) ，m 0 z g e n ，e t a l ( 1 9 9 6 1 9 9 8 ) 啪一踮1 采用胚乳支持培养法取得了很好的效果。他们将附带胚的种子( 胚已被 剥松动) 放入仅含8 m 9 2 ，4 - d 的液体中诱导愈伤组织，经9 一1 1 天的诱导后，愈伤组织形成，并 被转入分化培养基中进行分化培养，得到了9 0 以上的愈伤组织形成率和8 0 以上的植株分化 率。小麦成熟胚离体培养效应同样受基因型影响朴嘲。l i u b ，e ta l ( 1 9 8 8 ) 认为分化频 率高的基因型，成愈率也高，可以用成愈率来作为判断分化率的指标啪1 。而m 0 z g e n ，e ta l ( 1 9 9 8 ) 认为成愈率高的基因型，其愈伤组织的分化率不一定高，成愈率低的基因型，其愈 伤组织的分化率不一定低啪1 。和其他常用的小麦外植体培养情况一样，随着培养时间的延长， 成熟胚来源的愈伤组织分化能力及其绿苗的分化能力下降啪矧。虽然在小麦成熟胚离体培 养研究方面取得了不少的进展，但仍有许多的问题需要解决。如怎样进一步提高成熟胚来源 的愈伤组织的分化率，寻找一种对各基因型小麦成熟胚都较适用的培养基，是人们需要努力 解决的问题。 1 2 2 小麦成熟胚脱分化研究意义 小麦是世界上重要的粮食作物之一，提高小麦产量和改良小麦品质的研究有很重要的意 义。然而，由于运用传统的方法存在育种周期长，增产潜力有限等局限性，而植物生物技术 育种周期短，增产潜力大。但研究表明小麦转基因存在着转化率太低等问题，转化率低的一 个重要原因是再生率低。小麦胚细胞愈伤组织再生率低与脱分化的质量存在很大的关系，虽 然有关小麦胚细胞脱分化的研究很多，然而很多研究都是局限于不同基因型，不同激素浓度 诱导对脱分化和再分化的影响研究，有关小麦胚细胞脱分化的分子机理方面的研究却很少。 在这一领域的研究有望解决小麦胚细胞脱分化的基因调控，以及解决愈伤组织再生率低的问 题。实践证明，用小麦成熟胚作为外植体，可以保证不同的个体间生理状况相似，又有取材 方便的优点，因此，已得到广泛的研究应用。但其愈伤组织的形成及植株再生能力远远不及 幼胚和幼穗，而且还存在不少弊端。如：用成熟胚作外植体易被感染，且感染率很高，愈伤 组织质量差等。唐宗祥等报道，实验中采取切去果毛、2 次消毒的办法可以基本杜绝受感 染的现象。另外，采用切去胚芽和调整激素的办法能够有效抑制愈伤组织的发芽。实验初步 证明了用成熟胚作为外植体进行组织培养进而获得转基因小麦的可行性。张根发曾经提出， 脱分化能力与再分化过程具有一致性，认为外植体的类型对小麦体细胞组织再生能力影响很 大。以上研究表明，利用小麦成熟胚诱导、分化再生植株的方法还有待继续探索，以期为小 麦生物技术育种寻求较好的转基因受体，并建立成熟胚的小麦再生体系，进而为小麦新品种 的选育奠定基础。 1 3 芯片技术 1 3 1 基因芯片技术概述 基因芯片( g o n ec l l i p ) h 卜训通常指d n a 芯片，其基本原理是将大量寡核苷酸分子固定 于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫 7 描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号做出比较和检测，通过检测杂交信号的强弱 进而判断样品中靶分子的数量m 嘣1 。基因芯片产生的基础是分子生物学、微电子技术、高 分子化学合成技术、激光技术和计算机科学的发展及其有机结合。2 0 世纪8 0 年代末，俄罗斯 科学院恩格尔哈得分子生物学研究所和美国阿贡国家实验室的科学家最早在文献中提出用 杂交法测定核酸序列( s b h ) 新技术的想法。几乎与此同时牛津大学生化系的s o u t h e m 等取得 了在载体上固定核苷酸及杂交法测序的国际专利。1 9 9 1 年，美国a f f y m a t r i x 公司创造了世界 上第一块d n a 芯片，并成功成为世界上第一个实现商业化、产业化的公司 4 7 1 。1 9 9 5 年s c h e n a 等首次利用基因芯片技术对拟南芥中e s t s 进行定量分析，随后这一技术得到迅猛发展，很快 在大肠杆菌、酵母、果蝇、老鼠以及人类基因组研究中得到应用 韶1 。2 0 世纪9 0 年代初， 人类开始启动人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ，h g p ) ，随着h g p 即全部核苷酸测序的 即将完成，人类基因组研究的重心逐渐进入后基因组时代( p o s t g e n o m ee r a ) 向基因的功能 及基因的多样性倾斜啼3 剐。基因芯片技术正是随之而产生的一项新技术。该技术突出特点 在于高度并行性、多样性、微型化和自动化。高度的并行性是指通过一次杂交可以检测数以 万计的基因，大大提高了实验的进程。多样性是指在单个芯片中可以进行样品的多方面分析， 从而大大提高分析的精确性，避免因不同实验条件产生的误差。微型化是当前芯片制造中普 遍的趋势，其好处是可以减少试剂用量和减小反应液体积，从而提高样品浓度和反应速率。 高度自动化则可以降低制造芯片的成本和保证芯片的制造质量。由于这些优点，d n a 芯片技 术成为后基因组时代基因功能分析的最重要技术之一。 1 3 2 基因芯片技术的应用 基因芯片集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术、精密控 制技术和激光共聚焦显微技术，使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子以及对杂交信 号进行实时、灵敏、准确的检测分析变得切实可行。基因芯片技术在分子生物学、医学、生 物制药和环境科学等领域显示出了强大的生命力。 基因表达图谱的绘制是目前基因芯片应用最广泛的领域，也是人类基因组工程的重要组 成部分，它提供了从整体上分析细胞表达状况的信息，为了解与某些特殊生命现象相关的基 因表达提供了有力的工具，对于基因调控以及基因相互作用机理的探讨有重要作用嘟删。 d e r i s i 等选用来自恶性肿瘤细胞系u a c c 9 0 3 中的1 1 6 1 个c d n a 克隆制成芯片，通过比较正常 肿瘤细胞的表达差异，发现在恶性肿瘤细胞中p 2 1 基因处于失活或关闭状态，但在逆转的细 胞系中呈高表达侣 。g o l u b 等应用c d n a 芯片检测基因表达的差异进行癌症的分类，成功地 区分出急性髓细胞性白血病( a 池) 和急性淋巴细胞性白血病( a l l ) ，预期这种方法还 能诊断出新的白血病种类旧3 。近年来利用这一技术鉴定植物代谢途径的变化和调控的研究也 很多，如光调控路径，与生物钟有关的调控路径，以及在病原菌、低磷营养胁迫、高盐、干 旱、低温等各种生物逆境与非生物逆境胁迫下植物基因表达谱和代谢途径上的变化研究。c h e 等哺1 嘲利用基因芯片研究了拟南芥根外植体再生出芽的过程中激素诱导基因的表达变化。 8 基因芯片的另一重要应用是基因多态位点及基因突变的检测。基因芯片技术可大规模地 检测和分析d n a 的变异及多态性。w a n g 等应用高密度基因芯片对2 3 m b 人类基因的s n p 进 行筛查，确定了3 2 4 1 个s n p s 位点，显示出大规模鉴定人类基因型的可能嘲1 。随着大量疾病 相关基因的发现，变异与多态性分析将在疾病的诊断与治疗方面体现出越来越重要的价值。 基因芯片技术中杂交测序技术( s e q u e n c i n gb yh y b r i d i z a t i o n ，s b h ) 是一种新的高效 快速测序方法，也是基因芯片的另一重要应用嘲1 。其原理与芯片检测多态位点相类似，即通 过与一组已知序列的核酸探针杂交进行序列测定，用荧光标记的待测序列与基因芯片上对应 位置的核酸探针产生互补配对，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列互补的探 针序列，据此可重组出靶核酸的序列。 基因芯片技术在基因药物的设计与筛选上正在被广泛应用。通过比较和分析病人与正常 人的基因组图谱，得出病变的d n a 信息，就可针对病变的靶序列设计基因药物，以改变靶序 列的表达情况达到治疗该疾病的目的副。同时基因芯片分析技术还可以应用于临床用药，直 接检测化合物对生物大分子( 如受体，抗体等) 的结合及作用，检测化合物作用于细胞后基 因表达的变化。g a r y 等筛选到c d k 2 激酶抑制剂，在用抑制剂处理酵母细胞后，以酵母全基 因组基因芯片对比处理前后m r n a 水平的变化，阐明了该抑制剂对酵母基因表达谱的影响旧1 。 由于所有药物都是直接或间接地通过修饰、改变人类( 或相关动物) 基因的表达及表达产物 的功能而生效，而芯片技术具有高通量、大规模、平行性地分析基因表达或蛋白质状况( 蛋 白质芯片) 的能力，在药物筛选方面具有巨大的优势。用芯片作大规模的筛选研究可以省略 大量的动物试验甚至临床试验，缩短药物筛选所用时间，提高效率，降低风险。随着人类基 因图谱的绘就，基因工程药物将进入一个大发展时期，在基因工程药物的研制和生产中，生 物芯片有着很大的市场。 9 2 引言 生物技术在作物品种改良中己显示了巨大潜力。但是，利用生物技术进行小麦品种改良 却远远落后于其他作物，其主要原因是小麦遗传背景复杂，导致其外植体组织培养再生能力 极差。在小麦的遗传转化中，人们以小麦根尖、茎尖、幼穗、幼胚及成熟胚等组织或器官为 外植体进行了研究哺7 删。目前被公认最好的转化受体是小麦的幼胚口5 删。但是，即是幼胚 这样最好的转化受体，通常其愈伤组织再生率多数在1 0 左右，其最终的转化效率就更低。 因此要获得足够量的转基因个体以选择符合育种目标的转基因后代，就需要剥取大量的幼胚 进行转化。而小麦幼胚的获得受到季节的严重制约，在大田种植时每年只有几天取样时间。 再加上幼胚剥离技术要求高、工作量大、幼胚的发育一致性不易控制等，使小麦的转基因工 作步履维艰。 相比之下，成熟胚则具有发育状态一致、取材方便、操作简单、不受季节限制等诸多优 点而倍受关注口7 彻。但小麦成熟胚做外植体存在着成愈率和植株再生率低等问题。为了提 高小麦成熟胚的成愈率和植株再生率，学者们做了不少研究。其中包括对成熟胚进行预处理 ；调节培养基中各种营养成分呻1 ；调节诱导培养基和分化培养基中的激素种类和配比浓 度阳以及培养条件等恤1 。我们也进行了成熟胚等外植体的脱分化、愈伤组织培养及幼苗再 生等相关研究阱叫。通过采用适当的措施诱导成熟胚脱分化，如胚乳支持、提高生长素 ( 2 ，4 - d ) 的使用浓度、适当延长黑暗时间等。这些措施可以适当地提高由成熟胚诱导的愈伤 组织再生率，说明成熟胚和幼胚诱导的愈伤组织虽然外观相似，但却存在着质的差异。 细胞脱分化的研究已经有很多报道，脱分化是细胞从有组织，有结构的高度分化的细胞 进入无组织无结构具有分生能力的过程，植物、动物细胞脱分化都是以大量的基因表达模式 的显著变化为特点的。很多这样的过程已经得到证实，如癌症，干细胞再生等旧1 ，然而由于 没有便于操作的脱分化体系，所以在这一领域的研究还没有很大突破。自从烟草原生质体培 养技术发展起来以后，原生质体培养作为高等植物脱分化的一种模型，很多有关烟草叶肉细 胞脱分化的研究有了突飞猛进的发展。大量的生理学实验已经证明，细胞的脱分化与生长素 之间有着密切的联系，然而对有关脱分化的内在分子机制却不了解。 从基因表达调控水平研究基因表达差异与脱分化的关系是探索植物细胞脱分化机理的 一个重要途径。d u d i t s 等认为，胚生能力的获得主要取决于脱分化过程。因为在脱分化中 必须删除或改变原有的发育信息才能使细胞对新信号做出相应的响应。从已分化、静止的细 胞到脱分化、分裂和胚生状态的细胞的启动很可能涉及到基因表达的“重新编程”，说明细 胞在脱分化中通过某种方式已经获得了能否再生的相关信息，从而决定了脱分化的质量，最 终决定了愈伤组织的再生能力。因此揭示成熟胚脱分化的机理，提高其脱分化后的再生能力， 有望解决小麦转基因转化率低这一瓶颈问题。 豫麦1 8 是在河南地区有广泛种植面积的小麦品种，并且在愈伤组织培养中有很高的出 愈率。本研究以豫麦1 8 成熟胚脱分化形成的愈伤组织为材料，借用光学显微镜和透射电子 1 0 显微镜观察小麦成熟胚脱分化过程中细胞变化，并利用基因芯片技术研究t d , 麦成熟胚脱分 化过程中细胞壁相关基因的表达情况。伸展蛋白，扩张蛋白，以及与细胞壁物质分解与合成有 关的纤维素合成酶、纤维素酶、甘露糖磷酸变位酶、半乳糖激酶、肉桂酰c o a 还原酶、尿 苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶等，在脱分化过程中细胞壁的变化起到重要作用。期望根据这些 研究结果能够为进一步研究小麦胚脱分化提供参考。 3 技术路线 本实验以小麦成熟胚为材料，比较了有、无2 ，4 - d 诱导条件下小麦成熟胚脱分化时表型 变化，用光学显微镜和透射电子显微镜观察小麦成熟胚脱分化中细胞变化：通过a f f y l n e t r i x 公司寡核苷酸基因芯片g e n e c h i p 圆w h e a tg e n o m ea r r a y s 筛选了小麦成熟胚脱分化相关基因， 分析了小麦成熟胚脱分化过程中细胞壁变化相关基因差异表达。 小麦成熟胚 上 2 ，4 - d 诱导 表型燹化观祭提取m r n a 上上 光镜观察细胞结构变化反转录c d n a 、体外转录带生物素标记的c r n a i上 电镜观察细胞亚显微结构变化c r n a 片断化 上 小麦芯片杂交 上 扫描 上 差异表达转录本 1 l 细胞壁相关基因差异表达分析 1 2 4 材料与方法 4 1 供试材料 豫麦1 8 小麦干种子，由河南农业大学小麦遗传育种组提供。 4 2 试剂配制 4 2 1e p o n 8 1 2 树脂的配制： 试剂用量 e p o n 8 1 2 环氧树脂 1 3 m l 十二碳烯基丁二酸酐( d d s a ) 8 m l 甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐( 心a ) 7 m 1 呈：垒：昼= 三三旦氢基里基2 茎墼l 旦丛= 圣q 21 q = ! 呈煎 4 2 21 0 0 r a m 磷酸缓冲液( p h 7 4 ) 的配制： 试剂用量 磷酸二氢钠( n a l l 2 p 0 4 h 2 0 )1 3 0 9 磷酸氢二钠( n a 2 i - i p 0 4 1 2 h 2 0 ) 1 4 5 9 加双蒸水至5 0 0 m l ，调节乜h 至7 4 4 3 实验方法 4 3 1 显微观察 ( 一) 材料准备 取大小均匀一致且无虫害病害的豫麦1 8 d , 麦成熟种子，用o 1 的h g c l z 进行表面消毒 1 0 m i n ，之后用无菌水漂洗2 3 次，用3 0 c 温水浸泡2 h 。再用解剖刀将胚剥离胚乳，分别放在 含和不含2 m g l2 ，4 _ d 的m s ( 成分包含无机盐和维生素，其中2 0g l 蔗糖、7 9 l 琼脂粉，p h 5 8 ) 培养基上培养。在0 、2 、6 、1 0 、1 2 、1 6 、2 0 、2 4 、2 6 、3 0 、4 2 和7 2 h 分别取样。 ( 二) 切片制备 1 取材和固定： ( 1 ) 用镊子将培养的小麦成熟胚迅速投入前固定液( 2 戊二醛、1 0 0 m m 磷酸缓冲液p h 7 4 ) 中，把体积较大的材料修成不大于i m m i m mx2 m m 条形，真空抽气，使所取材料完全浸没于 固定液中。 ( 2 ) 1 0 0 m m 磷酸缓冲液( p h 7 4 ) 清洗5 次，每次3 0 m i n 。 ( 3 ) 将处理过的材料放入后固定液( 1 锇酸、1 0 0 m m 磷酸缓冲液p h 7 4 ) 中4 c 过夜。 ( 4 ) 用1 0 0 m m 磷酸缓冲液( p h 7 4 ) 漂洗5 次，每次3 0 r a i n 。 2 脱水： ( 1 ) 将冲洗后的材料用3 0 ，5 0 ，7 0 乙醇脱水，3 0 m i n 次。 ( 2 ) 8 5 ，9 0 ，9 5 乙醇脱水，2 0 m i n 次。 ( 3 ) 无水乙醇脱水4 5 m i n ，重复一次。 3 浸透和包埋： 1 3 ( 1 ) 无水乙醇：环氧丙烷，1 ：1 ，纯环氧丙烷，两次，3 0 r a i n 次。 ( 2 ) 环氧丙烷：e p o n 8 1 2 树脂= 2 ：1 过夜。 ( 3 ) 环氧丙烷：e p o n 8 1 2 树脂= 1 ：1 ，1 2 h 。 ( 4 ) 环氧丙烷：e p o n 8 1 2 树脂= 1 ：2 过夜。 ( 5 ) 将组织块用纯e p o n s l 2 树脂包埋在多孔橡胶包埋模板中，把包埋板放入烘箱烘烤聚合 硬化，3 5 ，1 2 h ，4 5 ，1 2 h ，6 0 ，1 2 d ，形成包埋块。 4 超薄切片： ( 1 ) 修块：将包埋块夹在特制的夹持器上，放在解剖显微镜下，用锋利的刀片先削去表面 的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成4 5 度的角度削去包埋剂，修成锥体 形。 ( 2 ) 半薄切片定位：利用l k b v 型超薄切片机切厚度为1i jm 的切片，将切下的片子用镊子 转移到干净的事先滴有蒸馏水的载玻片上，加温，使切片展平，干燥后经甲苯胺蓝染色，光 学显微镜观察定位，中性树胶封片，制成永久切片。 ( 3 ) 超薄切片：半薄切片定位以后，利用超薄切片机切片，厚度8 0 n m ，将切片捞在有支持 膜的载网上。 ( 4 ) 超薄切片的染色：经5 0 乙醇醋酸铀饱和液染色1 5m i n 后，用蒸馏水漂洗3 遍，柠