（作物遗传育种专业论文）甘蓝型与白菜型油菜无花瓣性状的遗传研究.pdf

摘要 油菜是全世界广泛种植的重要油料作物。长期以来，提高油菜的产量和增强油菜的抗病性 一直都是油菜科学家研究的主要课题。无花瓣油菜特异种质在增强油菜的抗病性和提高油菜产 量方面具有潜在的重要利用价值。研究阐明油菜花瓣缺失的遗传规律和分子机理，获得具有较 高实用价值的与无花瓣性状相关的分子标记，对育种中有效利用无花瓣特异种质资源具有重要 的指导和促进作用：同时对油菜花瓣缺失遗传机制的研究还对深入理解植物花器官发育过程具 有重要意义。 本研究以已发现的两种不同类型油菜无花瓣特异种质资源( 白菜型无花瓣突变体a m 0 3 2 ， 甘蓝型无花瓣突变体a p t 0 2 ) 为实验材料，开展了两种突变体花器官形态解剖特征比较、无花 瓣性状的遗传分析、花瓣缺失基因等位性和互作、无花瓣性状的分子标记研究。主要研究结果 如下： 1 两种突变体材料形态解剖特征比较分析发现，两种材料的突变类型存在本质差异。甘蓝型油 菜无花瓣突变体a p t 0 2 主要表现第二轮花瓣缺失；新型白菜型油菜无花瓣突变体a m 0 3 2 表现 花瓣转变为雄蕊和叶片卷曲。 互 对甘蓝型无花瓣油菜a p t 0 2 和三种正常花瓣甘蓝型油菜杂交后代的遗传分析结果表明： a p t 0 2 的无花瓣性状受两对主效隐性基因和一对隐性修饰基因控制，不存在母体细胞质效应。 3 对白菜型无花瓣油菜a m 0 3 2 和两种正常花瓣白菜型油菜杂交后代的遗传分析结果表明： a m 0 3 2 的无花瓣性状受一对隐性基因控制，不存在母体细胞质效应。 4 通过两种突变体杂交，对两种突变体的花瓣缺失机制进行了基因等位性和互作研究。在f 1 及后代分离群体中发现了花瓣缺失、花瓣雄蕊化双突变类型的植株。两种突变体材料的花瓣缺 失基因呈现出复杂的遗传互作关系。 5 两种突变体材料杂交，在后代分离群体中首次发现了雄性不育植株。群体( 舢d 0 3 2 a p t 0 2 ) ( a m 0 3 2 a p t 0 2 ) 、( a m 0 3 2 x a p t 0 2 ) a p t 0 2 、 ( a p t 0 2 x a m 0 3 2 ) x ( a p t 0 2 a m 0 3 2 ) 】中出现育性分离，而群体【( a p t 0 2 x a m 0 3 2 ) x a p t 0 2 、 ( a p t 0 2 x a m 0 3 2 ) x a m 0 3 2 中却未出现育性分离。 6 利用a p t 0 2 与中双4 号杂交构建的f 2 群体，对甘蓝型油菜的无花瓣性状进行了分子标记。 在a p t 0 2 和中双4 号两亲本间筛选2 0 对a f l p 引物和1 7 0 对s r a p 引物，进步通过b s a 法筛选，获得了与a p t 0 2 无花瓣性状连锁的1 个s r a p 标记e 8 m 34 ( 6 0 0 b p 和1 个a f l p 标 记e 3 2 4 71 5 ( 1 5 0 b p ) ，标记与完全花瓣性状之间的遗传距离分别为5 0e m 和1 3 5 e m 。 7 利用含9 3 个f 2 单株的分离群体【( 中双4 号x a p t 0 2 ) ( 中双4 号x a p t 0 2 ) ，构建了一 张含2 1 3 个a f l p 标记、5 6 个s r a p 标记和1 个形态标记的甘蓝型油菜遗传图谱，这些标记被 分配到1 7 个连锁群、两个三联体和4 个连锁对中，遗传图距总长2 4 8 7 1 c m ，标记问平均距离 为1 0 0 9c m ；基于花瓣度的完全花瓣性状( w h b ) 作为形态标记定位在第4 连锁群( l ( 柳上。 关键词：甘蓝型油菜，白菜型油菜，无花瓣突变体，无花瓣性状，遗传分析，分子 标记，遗传图谱 a b s t r a c t o i l s e e dr a p ei s8 ni m p o r t a n to i l c r o pe x t e n s i v e l yp l a n t e di nt h ew o r l d i nt h ep a s ta n dt h en e & r f u t u r e ，c a n o l ab r e e d e r s s t i l lf a c et h ec o r n n o na n dm a j o rg o a lo fi m p r o v i n gt h ep r o d u c t i v i t yl e v e lo f r a p e s e e da n di n c r e a s i n gd i s e a s er e s i s t a n c eo fr a p e s e e d s p e c i a la p e t a l o u sg e r m p l a s mh a si m p o r t a n t e f f e c t o n i m p r o v i n g p r o d u c t i v i t ya n d d i s e a s er e s i s t a n c e o f r a p e s e e m t h ea c c e s s t o k n o w l e d g e o f g e n e t i c m o d e la n dm o l e c u l a rm e c h a n i s mo fp e t a l - l o s sm u t a t i o nr a p e s e e d , t o g e t h e rw i t ht h ea v a i l a b i l i t yo f c l o s e l ya s s o c i a t e dd n am a r k e r s ，w i l lf a c i l i t a t et h ee x p l o i t a t i o no fp e t a l - l o s st r a i ti nb r e e d i n gp r o g r a m a l s o ，g e n e t i cs t u d y0 1 1t h em e c h a n i s mu n d e r l i n i n gp e c r a l - l o s sm u t a t i o nw i l lp r o v i d ea c h a n c ef o rb e t t e r u n d e r s t a n d i n go f t h ed e v e l o p m e n t a lp r o c e s so f f l o r a lo r g a n si np l a n t i n t h i ss t i l d y , a p t 0 2 ，a na p e t a l o u sg e r m p l a s mo fb r a s s i c an a p u sa n d a m 0 3 2 ，a na p e t a l o u s g e r m p l a s mo f b r a s s i c ac a m p e s t r i s ，w g 。r cu s e da sm a i nm a t e r i a l st os t u d y ：c o m p a r i s o no f m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ；g e n e t i ca n a l y s i so f a p e t a l o u st r a i t ；a l l e l i s ma n di n t e r a c t i o no f p e t a l l o s sg e n e s ；m o l e c u l a r m a r k e r sf o ra p e t a l o u st r a i t m a i nr e s u l t so f t h ep r e s e n ts t u d i e sa r ea sf o l l o w ： 1 m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft w om u t a n tm a t e r i a l sw e i ec o m p a r e d t h er e s u l ts u g g e s t e dt h a t t h em e c h a n i s mo fp e t a ll o s s i nb r a a s i c ac a m p e s t r i sw a sd i f f e r e n tf r o mt h a ti nb r a s s i c an a p u s h o r a lo r g a n so f a p t 0 2 s h o w e dm a i n l yp e t a ll o s s ，b u tt h em a t e r i a l a m 0 3 2 s h o w e dm a i n l y s t a m e n o i dp e t a la n dl e a f c u r l e d 2 t h r e ew i l dt y p eb r a s s i c an a p u sv a r i e t i e sw e r ec r o s s e dw i t ha p e t a l o u sm u t a n to fb r a s s i c an a p u s a p t 0 2 g e n e t i ca n a l y s i so nt h e i rp r o g e a t i e si n d i c a t e dt h a ta p e t a l o u st r a i to f a p t 0 2 w a s c o n t r o l l e db yt w om a j o rr e c e s s i v eg e n ep a i r sa n dat h i r dm o d i f y i n gr e c e s s i v eg e n ep a i r , m a t e r n a l e f f e c tw a s h tf o u n di n 血i st r a i t 3 t w ow i l dt y p eb r a s s i c ac a m p e s t r i sv a r i e t i e sw mc r o s s e dw i t ha p e t a l o u sm u t a n to fb r a s s i c a c a m p e s t r i s a m 0 3 2 g e n e t i ca n a l y s i so nt h e i rp r o g e n i e si n d i c a t e dt h a ta p e t a l o u st r a i to f a m 0 3 2 w a sc o n t r o l l e db yo n er e c e s s i v eg e n ep a i r , m a t e r n a le f f e c tw a s n tf o u n di nt h i st r a i t 4 b y c r o s s i n g a p t 0 2 w i t h a m 0 3 2 ，t h er e l a t i o n s h i p o f p e t a l l o s s m e c h a n i s m f o r t w o m u t a n t s w a s s t u d i e a d o u b l e - m u t a t i o n ( p e t a ll o s sa n dp e t a ls t a m e n o i d ) p l a n t sw e r ef o u n di nf 1p o p u l a t i o n sa n d s e g r e g a t i n g p o p u l a t i o n sd e r i v e df r o mt h ec r o s so f a p t 0 2 w i t h a m 0 3 2 p e t a l - l o s sg e n e so f t w o m u t a n t so c c u r r e dc o m p l i c a t e dg e n e t i ci n t e r a c t i o n 5 m a l es t e r i l ep l a n t sw e r ef o u n df o r t h ef i r s tt i m ei ns e g r e g a t i n gp o p u l a t i o n sd e r i v e df r o mt h ec r o s s o f a p t 0 2 w i t h a m 0 3 2 i ta p p e a r e ds e g r e g a t i o no fs t e r i l ep l a n t sa n df e r t i l ep l a n t si nt p o p u l a t i o n s i e ( a m 0 3 2 a p t 0 2 ) ( a m 0 3 2x a p t 0 2 ) 】， ( a m 0 3 2 a p t 0 2 ) a p t 0 2 】a n d ( a p t 0 2 x a m 0 3 2 ) x ( a p t 0 2 x a m 0 3 2 ) b u ti td i d n ta p p e a rs e g r e g a t i o no f s t e r i l ep l a n t sa n d f e r t i l e p l a n t si nt w op o p u l a t i o n si e 【( a p t 0 2 a m 0 3 2 ) x a p t 0 2 a n d ( a p t 0 2 x a m 0 3 2 ) a m 0 3 2 6 o n ef 2 p o p u l a t i o nd e r i v e df r o mt h eg r o s sb e t w e e n a p t 0 2 a n d z sn o 4 w a su s e d f o r i d e n t i f y i n gm o l e c u l a rm a r k e r sl i n k e dt ot h ea p e t a l o u st r a i to fb r a s s i c a 托哩珥嚣2 0p a i r so fa f l p p r i l n c r sa n d1 7 0p a i r so fs r a pp r i m e r sw 1 日 eu s e dt os o l 1 1b e t w e e nt w op a r e n t sa n d t w ob u l k s c o n t r a c t e du s i n gb u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s ( b s a ) a p p r o a c h o n es r a pm a r k e re 8 m 3 _ 4 ( 6 0 0 b p ) a n do n ea f l pm a r k 口e 3 2 4 7 _ 1 5 ( 1 5 0 b p ) w e r ei d e n t i f i e dt ob el i n k e dt o 血1 1 yp e t a l l e dt r a i t ，w i t h t h eg e n e t i cd i s t a n c eo f 5 0 c ma n d1 3 ，5 c mr e s p e c t i v e l y 7 al i n k a g em a pw b sc o n s t r u c t e df i - o mas e g r e g a t i n gp o p u l a t i o nw i t h9 3f 2p l a n t sd e r i v e df r o mt h e c r o s so f z sn o 4 w i t h a p t 0 2 i tc o n s i s t e do f2 1 3a f l pa n d5 6s s r1 0 c ia n dam o r p h o l o g y m a r k e ri n1 7m a i nl i n k a g eg r o u p s ，t w ot r i p l e ta n df o u rl i n k a g ep a i r s t h em a pc o v e r e dal e n g t ho f 2 4 8 7 i c m ，a v e r a g ei n t e r v a lb e t w e e l lm a r k e r sw a s1 0 0 9c m t h em o r p h o l o g ym a r k e r ( w h b ) b a s e do hp e t a l o u sd e g r e ew a s1 0 c a t e d0 1 1l g 4 k e yw o r d s ：b r a s s l c an a p u s ，b r a s s i c ac a m p e s t r l s ，a p e t a l o u sm u t a n t a p e t a l o u st r a i t ， g e n e t i ca n a l y s i s ，m o l e c u l a rm a r k e r s g e n e t i cm a p i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：2 0 0 5 年6 月2 7 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业 科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 时间：2 0 0 5 年6 月2 7 日 时问：2 0 0 5 年6 月2 7 日 中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 油菜是我国乃至全世界广泛种植的重要油料作物。据统计，目前全世界油菜( 包括甘蓝型、 白菜型、芥菜型油菜等，其中以甘蓝型油菜分布最广，面积最大) 种植面积为2 6 5 9 百万公顷， 总产4 3 6 5 百万吨，我国种植面积为7 8 0 百万公顷，总产1 2 0 0 百万吨，两项各约占i 3 ( 资料 来源：w o r l d m 盯l 喊sa n d t r a d e , 2 0 0 4 ) 。 由核盘菌( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) 导致的菌核病是世界范围内的一种重要病害，在我国尤为 严重，列为油菜第一大病害。菌核病在我国每年的发病面积在7 0 0 0 万亩以上，直接经济损失在 3 0 亿元以上( 刘胜毅，1 9 9 9 ) 。菌核病的严重发生对我国油料的可持续发展构成了威胁( 陈碧云 等，2 0 0 1 ) 。由于核盘菌寄主范围极广，至今仍未发现对这一病原菌免疫的抗源材料。对这一病 害的防治主要依赖化学防治，这种方式不仅成本高，而且污染环境( 傅寿仲等，1 9 9 5 ) 。因此， 各国都在积极寻找防御菌核病的新途径。 花瓣是传播油菜病害( 如菌核病等) 的重要媒介，它不仅是病原菌的初次侵染源，为病原菌 的生长提供重要的能源，而且随着花瓣飘落在叶片上，形成再次侵染，为病害的扩展和蔓延提 供条件( m c c l e a n ，1 9 5 8 ；李强生等，2 0 0 0 ) 。无花瓣油菜的形态避病作用十分明显。 m e n d h a m n 等( 1 9 8 1 ) 报道，油菜花期花瓣能反射和吸收光合有效辐射的6 0 。c h a p m a n 等( 1 9 8 4 ) 认为，在初花期和盛花期仅有2 4 和7 的光合有效辐射能到达距地5 0 e m 的植株 基部。无花瓣油菜因无需发育形成花瓣，从而可以节省大量能量，如果这些节省的能量全部流 向籽粒，则理论上可增产1 5 6 ( 吕忠进，1 9 8 9 ) 。无花瓣油菜可以提高光能利用率，从而具有 增加油菜产量的潜力。 提高油菜的产量和增强油菜的抗病性是保障油菜可持续发展的重要途径，提高油菜的产量 和增强油菜的抗病性一直都是油菜科学家研究的主要课题。提高油菜的产量和增强油菜的抗病 性有各种不同的途径，利用无花瓣性状有可能提高油菜的产量和增强油菜的抗病性。 1 1 油菜无花瓣突变体的来源及其利用价值 1 1 1 油菜无花瓣突变体的来源 无花瓣油菜一般是从自然突变和人工杂交或诱变后代中获得，其产生途径主要有4 种： 自然突变。r a m a n u j u m ( 1 9 4 0 ) 、c o u r s ( 1 9 7 7 ) 、伍晓明等( 2 0 0 1 ) 在白菜型油菜中，r a l l a ( 1 9 8 5 ) 在埃塞俄比亚芥中，赵云等( 2 0 0 0 ) 在甘蓝型油菜中均发现了无花瓣自然突变体。种间杂交。 刘厚利( 1 9 8 5 ) 、傅寿仲等( 1 9 9 5 ) 在甘蓝型油菜白菜型油菜杂交后代中，戚存扣等( 1 9 8 9 ) 在甘蓝型油菜埃塞俄比亚芥杂交后代中，蔡明等( 1 9 9 1 ) 、p i e r r e 等( 1 9 9 6 ) 在埃塞俄比亚芥 甘蓝型油菜杂交及回交后代中均发现了甘蓝型无花瓣油菜突变体：m a l i k 等( 1 9 9 9 ) 在b c 3 中获得了芥菜型油菜的无花瓣突变体；c h e r t ( 1 9 8 9 ) 在人工合成甘蓝型油菜后代中发现了无花 瓣材料。品种间杂交。r a k o w 等( 1 9 9 9 ) 在甘蓝型油菜品种( n 8 9 5 3 们斟9 0 一1 0 1 8 s h i r a l e e ) f 5 中获得了无花瓣突变体，但杂交亲本之一 y n 9 0 1 0 1 8 ”来源于n a p u s b a l b o g l a b r a 中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 b r a p a ) 种间杂交后代：谭小力等( 1 9 9 8 ：1 9 9 9 ) 则在2 个甘蓝型油菜杂交后代中获得了无花 瓣材料。理化诱变。t e n g b e ( 1 9 9 0 ) 、r i o 等( 1 9 9 4 ) 利用e m s ( 甲基磺酸乙酯) 诱变，分别在 甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥中获得了无花瓣突变体( 蒋立希等，1 9 9 9 ；罗鹏，1 9 9 5 ) 。 从无花瓣突变体的来源看，白菜型油菜比较单一，主要是自然突变，这也表明白菜型油菜中 普遍存在着花瓣性状的变异。但是白菜型无花瓣材料大多不够稳定，一般开花早期为无花瓣，中 后期产生花瓣，并逐渐恢复正常。甘蓝型油菜主要通过种间杂交获得无花瓣材料，且研究较多的 是甘蓝型油菜埃塞俄比亚芥以及甘蓝型油菜白菜型油菜。从获得无花瓣突变体的数量看，以 甘蓝型油菜中无花瓣突变体较多，且部分已用于育种中，芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥中无花瓣突 变体相对较少。 1 1 2 油菜无花瓣突变体的利用价值 首先，无花瓣油菜的形态避病作用十分明显。j a m a u x 等( 1 9 9 5 ) 利用扫描电镜观察证明，油 菜菌核病菌子囊孢子只有落在花瓣上才能萌发形成菌丝，并侵染叶片和茎秆，如果子囊孢子直接 落在叶片上则无法萌发生长。陈玉卿等( 1 9 9 1 ) 观察油菜花器带菌率发现，花瓣带菌率平均达9 2 3 ，其它花器官如花萼和雄蕊的带菌率也在9 0 以上，无花瓣油菜因缺少花瓣，花器官的总带菌 率比常规品种平均下降3 4 1 ，从而大大降低了病害的发生机率。傅寿仲等( 1 9 9 6 ) 报道，无花 瓣品种发病率明显低于有花瓣品种，田间发病率下降8 0 2 9 4 8 。r r k o w 等( 1 9 9 9 ) 调查表明， 无花瓣品种菌核病发病率和严重度分别为9 o 和6 6 ，而对照品种 a ce x c e l ”分别为3 2 5 和 2 7 5 。 其次，无花瓣油菜可以提高光能利用率，具有增加油菜产量的潜力。油菜花瓣的形成、伸展 和呼吸都需要消耗大量的光台产物。吕忠进分析有、无花瓣油菜花器官各组分的差异，发现有花 瓣品种每朵单花花瓣发育所需的千物质为3 9 m g ，占花器官总重的3 7 0 ；无花瓣品种因去除了花 瓣，从而节省了花瓣发育所需的能量，这些能量主要用于雌蕊与花萼的发育，使雌蕊占花器官总 重的比例从有花瓣品种的6 2 提高到3 7 9 ，花萼所占比例也从1 0 9 增加至l j 2 1 7 ，而雄蕊及 花柄所占比例则略有下降( 吕忠迸，1 9 8 9 ) 。谭小力等( 1 9 9 8 ；1 9 9 9 ) 亦报道，有、无花瓣近等 基因系间的花蕾重量变化不大，但无花瓣系长度增j j h 3 1 4 ，花萼、雌蕊和雄蕊重量均显著增加， 有利于传粉和角果发育，为获得高产打下基础。花期正是油菜生长最旺盛的时期，无花瓣油菜因 无需发育形成花瓣，从而可以节省大量能量，如果这些节省的能量全部流向籽粒，则理论上可增 产1 5 6 0 ( 吕忠进，1 9 8 9 ) 。m e n d h a m n 等( 1 9 8 1 ) 报道，油菜花期花瓣能反射和吸收光合有效辐 射的6 0 ；c h a p m a n 等( 1 9 8 4 ) 认为，在初花期和盛花期仅有2 4 和7 的光合有效辐射能到达距 地5 0 c m 的植株基部。因此，选育小花瓣或无花瓣品种，能使光分布更为有效，并实现油菜高产( y a t e a n ds t e v e n ，1 9 8 7 ) 。r a o 等( 1 9 9 1 ) 比较有、无花瓣油菜在受光态势上的差异，发现盛花期花器 官对入射光的反射，无花瓣品种仅为有花瓣品种的5 0 ，而到达植株基部光合层的光合有效辐射 量，无花瓣油菜比有花瓣品种提高3 0 。f r a y 等( 1 9 9 5 ：1 9 9 6 ) 发现在盛花期，能穿透花冠层的 光合有效辐射，无花瓣油菜要比有花瓣材料高7 0 ，因而能够延长基部叶片的功能期，使无花瓣 品种在花期积累的干物质比有花瓣品种多4 1 ，从而增加每角粒数和千粒重：而有花瓣品种因同 化产物的不足，导致6 0 的角果难以正常成熟。傅寿仲等( 1 9 9 6 ) 比较有、无花瓣近等基因系差 2 中国农业科学院硕士学位论文第一章文献综述 异，认为无花瓣性状有利于延长基部叶片功能期，减少基部分枝的退化，形成分枝点低、分枝数 多、角果数多的较大株型，从而为获得高产打下基础。 1 2 油菜无花瓣性状的遗传 研究者对各自获得的无花瓣油菜的遗传研究结果存在很大差异。总体上讲，白菜型油菜无 花瓣性状主要受核内1 对隐性基因控制( s i n g h ，1 9 6 1 ；c o u r s ，1 9 7 7 ) ；甘蓝型油菜无花瓣性状 的遗传则较为复杂，除赵云等所获得的s c u 无花瓣材料外，均表现为隐性遗传，一般由2 - 4 对 隐性核基因控制，可能存在细胞质效应，有的易受环境因素的影响( b u z z a ，1 9 8 3 ：k e l l y e ta l ， 1 9 9 5 ；傅寿仲等，1 9 9 0 ，1 9 9 3 ，1 9 9 5 ：吕忠进等，1 9 9 1 ；蒋立希等，1 9 9 9 ，1 9 9 8 ，2 0 0 1 ；赵云 等，2 0 0 0 ) 。无花瓣性状的遗传主要分为以下7 类。 1 2 11 对隐性基因 s i n g h ( 1 9 6 1 ) 、c o u r s ( 1 9 7 7 ) 对白菜型油莱无花瓣突变体的遗传研究表明，有、无花瓣杂交 f 】为正常有花瓣，玛及回交世代发生分离，且符合1 对隐性基因控制的遗传模式。 1 2 22 对隐性基因 b u z z a ( 1 9 8 3 ) 报道，无瓣对有瓣为完全隐性，f 2 代存在广泛变异，o - 4 瓣呈连续分布，但以 正常型占多数，在6 0 以上，2 5 植株的花瓣率为1 0 8 0 ，仅有少量植株为无花瓣；f l 与无花 瓣材料回交，则无花瓣、中间型与正常型的比例为1 ：2 ：1 ，因而该无花瓣性状由2 对隐性基因控 制。k e n y 等( 1 9 9 5 ) 所获得的“s t a p 无花瓣材料( 雄蕊状花瓣突变体) ，受2 个位点的基因( s t a p l ， s t a p - 2 ) 控制，分别位于甘蓝型油菜的c 染色体组和a 染色体组。s m g h 等( 1 9 9 1 ) 研究芥菜型油菜 无花瓣性状的遗传，结果同样符合2 对隐性基因的遗传模式。 1 2 33 对隐性基因 k e l l y 等( 1 9 9 5 ) 获得了另一个无花瓣突变体 a p e t ”，该材料9 0 的变异由3 个位点a p e t - 1 、 a p e t - 2 、a p e t - 3 控制，这些位点具有加性和上位性互作效应，其中如a p e t - 1 、a p e t - 2 为主效基因， 控制花的形态，如a p e t - 3 为修饰位点，控制极端表型的表达，a p e t - 1 和a p e t - 2 之间还具有部分同源 性。 1 2 44 对隐性基因 傅寿仲等( 1 9 9 0 ：1 9 9 3 ；1 9 9 5 ) 、吕忠进等( 1 9 9 1 ) 研究无花瓣材料 a p l - 0 2 5 6 的遗传后认 为，无花瓣材料与大花瓣品种杂交，有、无花瓣分离比例f 2 代为2 5 5 ：1 ，b 1 为1 5 ：1 ；与小花瓣 材料杂交，f j 和b 1 的分离比例分别为1 5 ：1 和3 ：1 ，因此该无花瓣材料由4 对隐性基因控制。 3 中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 1 2 5 细胞质十2 对核内隐性基因 蒋立希等( 1 9 9 9 ：1 9 9 8 ；2 0 0 1 ) 对无花瓣材料a p _ _ t 钿g b e 的遗传研究结果表明，该性状由 细胞质及核内2 对隐性基因共同控制，只有质核组成茭j c a p ( p l p l p 2 p 2 ) 时，才表现为完全无花瓣。 另外，该材料的无花瓣性状一定程度上还受环境条件的影响，主要受植株体内生长素和细胞分裂 素的影响。 1 2 62 对主基因十4 对修饰基因 k e l l y 等( 1 9 9 5 ) 获得的完全无花瓣材料 n p e t ”由6 个无花瓣基因位点控制( n p e t - 1 ，n p e = t - 2 ， n p e t 3 ，n p e t - 4 ，n p e t - 5 ，n l m - 6 ) ，其中n p e t - 1 ，n p e t - 2 为主效基因位点，对性状具有加性效应；其余 为修饰基因位点，受2 个主效基因位点的上位性抑制。 1 2 71 对显性基因 赵云等( 2 0 0 0 ) 报道。“s o u 无花瓣材料与有花瓣品种杂交f 1 表现为无花瓣，f 2 代无花瓣株与 有花瓣株的分离比例为3 ：1 ，f l 与有花瓣植株回交，则表现为1 ：1 的分离比例，因此，s o u 无花 瓣材料符合1 对显性基因控制的遗传模式。 1 3 分子标记在油莱遗传改良中的应用 1 3 1 常见的分子标记 从孟德尔的豌豆杂交试验开始，人们就开始有意识地挖掘和利用各种各样的遗传标记进行 研究，总的来说遗传标记可以归纳为4 类，即形态标记、细胞学标记、生化标记和分子标记。 分子标记是随着分子生物学的发展而出现的，它直接从分子水平反映出核苷酸序列的任何差异。 与其它标记系统相比，分子标记具有以下优点：1 ) 不受发育阶段的影响，可以对个体、组织、 器官乃至细胞作检测；2 ) 不受环境因素以及基因是否表达的影响；2 ) 数量非常丰富，几乎无 限；3 ) 有些标记是共显性标记，对选择隐性基因控制的性状十分有利：4 ) 遗传稳定，表达中 性，无表型效应。这些优点使分子标记在物种起源与进化、生物多样性、遗传图谱构建、基因 定位以及分子标记辅助选择等方面得到了广泛应用。目前已经发展出十几种标记技术，比较常 用的有r f l p ，r a p d ，s s r ，s c a r ，s t s ，a f l p ，c a p s ，咀及s n p 、s r a p 等，这里仅对与 本课题研究有密切关系的a f l p 标记和s r a p 标记加以综述。 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 是1 9 9 2 年由荷兰科 学家z a b e a u 和v o s 发展起来的一种新的检测d n a 多态性的方法。其基本原理是运用p c r 技 术对基因组d n a 的限制性酶切片段进行选择性扩增后加以电泳检测。扩增片段的数目主要取 决于所采用的限制性内切酶种类、选择碱性基数目和所研究基因组的复杂程度。通过调整引物 选择性碱基的数目，可获得丰富的多态l 生( v o se t a l ，1 9 9 5 ) 。理论上，址l p 分析可以采用的限制 性内切酶种类和选择性碱基的数目有很多，因此a f l p 可产生的标记数目几乎是无限的。利用 d 中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 这一方法，在不需要事先知道d n a 序列信息的情况下就可以同时进行多数d n a 酶切片段的 p c r 扩增，典型的a f l p 实验一次可获得5 0 1 0 0 条谱带。a f l p 既有r a p d 的简便性，又具 有多态性丰富，不受环境影响，呈典型的孟德尔方式遗传，无复等位效应等优点：d n a 用样 量少，灵敏度高，可以在短时间内提供巨大的信息量，而且绝大部分a f l p 标记随机分布于整 个基因组上( m a h e s w a r a nc ta l ，1 9 9 7 ) ，少数标记则成簇分布于着丝粒区和染色体的末端( b e c k e x e ta 1 1 9 9 5 ) 。因此，a f l p 被认为是一种十分理想的、高效的分子标记技术，被广泛应用到遗传 多样性分析、种质鉴定、基因定位和连锁图谱构建等方面研究。t h o m a s 等( 1 9 9 5 ) 通过对f 2 群体进行集团选择分析( b s a ) ，从4 2 0 0 0 个a f l p 位点中找到了3 个与西红柿叶霉病抗性基因 c f - 9 共分离的a f l p 标记。完成4 2 0 0 0 个位点分析，对于r f l p 和r a p d 分析而言是相当大的 工作量，但对a f l p ，只要1 0 多块胶板即可完成。此外a f l p 还有两个重要特点：1 ) 对d n a 模板的质量要求不是很高，即使发生部分降解，仍然可以扩增出清晰的带纹；它对模板浓度的 变化也不敏感，v o s 等( 1 9 9 5 ) 发现，西红柿的d n a 模板浓度在相差1 0 0 0 倍的范围内变化时， 得到的a f l p 扩增带纹基本一致；2 ) 在反应过程中，引物容易耗尽，当引物耗尽后，扩增带型 将不再受循环数的影响，这样，利用过剩的循环数，即使模板浓度存在一些差异，也会得到强 度一致的谱带，便于比较分析。由于a f l p 具有高效、快速、模板用量少等突出优点，因而在 基因定位和标记辅助选择研究中具有很大的优势。 相关序列扩增多态性( s e q u e n c - r e l a t o da m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ，s r a p ) 是一种新型的基于 p c r 的标记系统，由美国加州大学蔬菜作物系l i 与q u i r o s 博士于2 0 0 1 年提出，又叫基于序列扩增 多态性( s e q u e n c e - b a s e da m p h f i e dp o l y m o r p h i s m ，s b a p ) 。其原理是用一对引物扩增可译框( o r f s ) 。 引物设计是s r a p 分析的核心，s r a p 标记分析共有两套引物，两套引物分正向引物和反向引物， 在一组正向s 渔p 引物中使用“c c g g ”序列，其目的是使之特异结合可译框区域中的外显子。两 套引物中正向引物长1 7 b p ，包含有1 4 b p 的核心序列，从5 端开始是1 0 b p 的没有特别组成的填充序 列，紧接着是序歹u c c g o 和3 个选择性碱基到3 端结束，3 个选择性碱基的不同产生一系列不同的 正向引物；反向引物长1 8 b p ，反向引物也有同样的组成，不同的是含有i l b p 的填充序列。l i 与q u i r o s ( 2 0 0 1 ) 利用c o l l a r dx c a u l i f l o w e r 形成的r i l 群体，构建了由1 3 0 个s r a p 、1 2 0 个a f l p 标记组成的 遗传图谱，s r a p 标记均匀分布平衡在9 个重要连锁群上。“与q u i r o s ( 2 0 0 2 ) 利用r 皿群体，采用 s r a p 技术，将b o g l s - a l k 基因( 十字花科中调节脂肪族芥子油糖菅脱饱和基因) 定位到连锁群 l 1 上，距显性标记s r a p l 3 1 4 c m 。 1 _ 3 2 油菜分子标记遗传图谱的构建和重要基因的定位 1 3 2 1 油菜分子标记遗传图谱的构建 1 9 9 0 年，美国科学家s l o c u m 等( 1 9 9 0 ) 率先发表了第一张芸薹属作物甘蓝( 丑o k r a c e a ，c c ) 的遗传图谱，揭开了构建芸薹属油菜各物种遗传连锁图的序幕。该图谱包含有9 个连锁群，共定 位了2 5 8 个r f l p 标记，遗传图距总长8 2 0c m 。随后又陆续发表了利用不同群体构建的5 张甘蓝遗 传图谱( l a n a r yc t a l ，1 9 9 2 ；k i a n i a na n d q u i r o s ，1 9 9 2 ；k e r a r s e ye ta l ，1 9 9 6 ；r a m s a y e ta l ，1 9 9 6 ； 5 中国农业科学院硕士学位论文第一章文献综述 c a m a r g oe ta l ，1 9 9 7 ) 。h u 等( 1 9 9 8 ) 利用一个f j 群体，将前人( k i a n i a na n dq u i r o s ，1 9 9 2 ；l a n d r ye t a l ，1 9 9 2 ；r a m s a y e ta l ，1 9 9 6 ；c a m a r g oe t a l , 1 9 9 7 ) 发表的甘蓝连锁图进行了整合。整合后的连锁图 共包含1 7 5 个r f l p 标记，分属于1 3 个连锁群，覆盖基因组总长的1 7 3 8c m 。 s o n g 等( 1 9 9 1 ) 构建了白菜型油菜( 丑c a m p e s t r i s ，a a ) 的首张遗传连锁图，该图包含1 0 个 连锁群，共2 8 0 个r f l p 位点，图谱总长1 8 5 0c m 。随后国外的实验室在白菜或白菜型油菜中又构 建了3 张遗传图谱( c h y _ ie ta l ，1 9 9 2 ；t e u t o n i c oe t a l ，1 9 9 4 ；s o n ge t a l ，1 9 9 5 ) 。国内，张鲁刚等( 2 0 0 0 ) 利用芜菁和结球白菜杂交的f j 为材料，构建了含有9 9 个r a p d 标记的白菜连锁图，其平均图距为 1 6 5c m ，总长1 6 3 2 4c m 。卢钢等( 2 0 0 2 ) 利用白菜与芜菁杂交的f j 代分离群体构建了白菜的遗 传图谱，该图谱包括1 3 1 个遗传位点，其中有2 个形态标记( 叶毛有无；叶面光滑皱缩) ，9 3 个r a p d 标记，3 6 个a f l p 标记，这些标记分布在1 0 个主要连锁群及2 个小连锁群上，i 訇谱总长度为1 8 1 0 9c m ， 标记间最大图距为3 8 1c m ，平均距离为1 3 7c m 。 甘蓝型油菜( 丑n a p u s ，a a c c ) 是由白菜型油菜和甘蓝自然杂交后异源多倍化形成的。因此， 在白菜型油菜和甘蓝上应用的分子标记可以用于甘蓝型油菜。第一张甘蓝型油菜的分子标记连锁 图由伽d r y 等( 1 9 9 1 ) 完成。他们以“w e s t e f ，和“t o p a s 杂交产生的f j 群体为材料，用e d n a 克隆为 探针，构建了包含1 9 个连锁群、覆盖基因组总长1 4 1 3c m 的连锁图。随后在不同的实验室又分别 构建了5 张图谱( f e r r e i r ae ta l ，1 9 9 4 ；u z u n o v ae t a l ，1 9 9 5 ；