（作物遗传育种专业论文）拟南芥G蛋白相关基因At1g09630转化水稻研究.pdf

拟南芥g 蛋白相关基因a t l9 0 9 6 3 0 转化水稻研究 摘要 研究表明，拟南芥很多种基因的过量表达能引起拟南芥株型、熟期、产量的改变， 部分基因能增加生长速度和生物量，提早开花，增强抗逆性。为了了解这些基因在农 业生产上的应用价值，有必要将这些基因转化到水稻等农作物中进行进一步异源基因 表达评价。g t p 结合蛋白( g ，r p b i n d i l l g p r o t e i n s ) ，简称g 蛋白，是活细胞内一类具有 重要生理调节功能的蛋白质。此类蛋白由于其生理调节功能有赖于与三磷酸鸟苷( g t p ) 的结合与水解g ，r p 的活性而得名。现已经证明g 蛋白参与细胞生长与分化、细胞 骨架、膜囊泡与蛋白质运输的调节过程，在细胞信号转导过程中有着非常重要的调节 作用。 a t l 9 0 9 6 3 0 是拟南芥中推测与单聚体g 蛋白中的r a b 亚类蛋白合成相关的基因， 本论文研究利用农杆菌介导法将其转入水稻得到2 5 株转基因水稻( 仍彳，贝口6 ) ，在对转 基因植株进行除草剂标记筛选时，所有t o 植株叶片均抗除草剂，t l 、t 2 代苗发生了接近 3 ：1 比例的抗感分离。 转基因水稻佻彳坎曲一个明显的表现是育性下降，通过调查与分析，其主要原 因有：花粉育性低，部分花粉败育；鞘包穗现象：部分植株出现开花时颖壳不打开及花 丝不伸长等现象降低了受精率，影响了结实；部分植株的花粉管的萌发受阻；还有其 他如颖壳退化、无花粉、三个柱头、七枚花药、雄蕊短于柱头等变异。 转基因水稻佻彳尔口6 的株高是野生型植株的7 0 左右，其倒4 节间长比对照 砌妇长，而其他三节间长均按比例比对照鼢胁口船短转基因水稻仍彳球口6 的分蘖 角度比对照殿幻幽大，从而使植株呈丛状；动态分蘖分析，其分蘖均以对称成对发生。 转基因水稻孤彳氓动叶角近于直角，而使叶呈披垂状；首穗花期也比对照迟，最迟 花期比对照迟2 5 天，甚至部分植株不开花；种子萌发率低，平均只有3 3 ；萌发需要 时间比对照长2 天左右。与野生型相比，转基因水稻佻彳政动的叶色较黄，叶绿素 含量动态分析结果表明，转基因水稻伽彳缏动在叶片整个发育过程中有一个高的叶 绿素怕比值，转基因水稻佻彳坎口6 属于叶绿素b 减少型。 关键词：转基因g 蛋白水稻株型育性 a b s t r a c t r e s e a r c hs _ h o w s 也a t0 v e r e x p r e s s i o no fs o m eg e n e 丘o m 心a b i d o p s i s t h a l i a h ac a nc h 锄嚷声t 1 1 ep h e n o 帅eo ft h ep l a n t ，s u c ha sp l a n t 卯e 、m a m r e p e r i o da n db i o m 雒se t s o m eo f 恤e s eg e n ec a ns h o r t e nt h ep e r i o do fn o w e r m g ， i n c r e a s em eg r o 、mp r o c e s s ，i n l p r o v et l l eb i o l o g i c a lp r o p e r t i e sa n da d v e r s i t y r e s i s t a l l c e t i os t u d yt l l ev a l u eo ft 1 1 e s eg e n ei na g r i c u l t u r e ，i ti sn e c e s s a 巧t o t r a n s f - o m a t e 吐l e s eg e n ei n t or i c et 0r e v a l u et h ee x p r e s s i o no fm ee x o g e n o u s g e n e e x t e n s i v es t u d i e sm d i c a t e dt h a tg t p b i n d i n gp r o t e i ns h m l ev e s i c l e s w i t h i ns p e c i f i cc e l l u l a rc o m p 叭m e n t sa i l de n a b l e ，e x o c ”o s i se n d o c ”o s i s ， m e m b 啪ec y c l 访ga i l do t h e r 们伍c 姑n ge v e n t s ，g t p - b i n d i n gp r o t e i np l a y i m p o n a r l t r o l e si 1 1t l l ec e us i g n a lt r 肌s d u c t i o n 1 1 1 ea t l 9 0 9 6 3 0g e n e ，w h i c hp u t a t i v ee n c o d e sas m a l lg t pb i n d i n g p r o t e i n 舶ma r a b i d o p s i sm a l i a h a ，w a si n t r o d u c e di n t o c a l l u s 丘o mm a t u r e e m b u o so fr i c e 而嬲妇) b ya g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o m a t i o n a r e r t h ec e l l st h a th a dp r 0 1 i f e r a t e d 、r e 缸a 1 1 s f e 玎e dt oas e l e c t i o nm e d i u mm a t c o n t a i n e do 2 h e r b i c i d e 锄跆) ，a m o n g5 0c o l o n i e sm a tw e r es e l e c t e da n d 仃a n s f e 盯e dt or e g e n e r a t i o nm e d i u m ，2 5r e g e n e r a t e ds h o o t sm a tf o m e dm o t s w e r ep l a n t e di ns o i la n dt r a n s f e r r e dt 0t h ey i e l d i nat e s to fh e r b i c i d e 刀彪) r e s i s t a n c e s ，a 1 1m et 册s g e n i c ( t o ) p l a n t s w e r er e s i s t a n t ，t 1 1 ep r o g e n y ( t 1 ) v i a b l es e e d ss e g r e g a t e di n t or e s i s t a n ta n d s e n s i t i v es e e d i n g sa tar a t i oo f 印p r o x i m a t e l y3 ：1 ，t h ep r o g e n y ( t 2 ) v i a b l e s e e d sa l s o s e 星乒e g a t e di n t or e s i s t a n t a r l ds e n s i t i v es e e d i n g sa tar a t i oo f 印p r o 虹m a t e l y3 ：1 、 t h e t r a n s g e n i cp l a n t sp r o d u c e dm o s t l y s t e r i l e s e e d s t h r o u 曲 i n v e s t i g a ：t i n gm a i nr e a s o no ft h es t e r i l e ，w ef i n dt h a tp a r to fp o l l o ni n f e r t i l 姆； s h e a m e dp a n i c l e 。g l u m e sc l o s e da n df i l 锄e n t 、e r e n o te x s e r t i o n 、h e n f l o w e r i n g ；p o l l e nt u b eg e r m i n a t i o nw a sh i n d e r e d ；a n ds o m eo fp 1 锄t sa p p e a r e d m u t a t i o ns u c h 邪：d e 伊a d a t i o ng l u m e s ，n op o l l e n ，t 1 1 en u m b e ro fs t i g m aw a s3 ， t h en u m b e ro fs t a m e n sw a s7 ，s t 咖e n ss h o r t e rm a ns t i g m a t h et r a n s g e i l i cp l a n tw a ss h o r t e rm a l lt l l ec o n 仃o l s ，i td e v e l o p e d7 0 鹤 c o n t r o l s ，t h el e n g t ho fi n v e r t e d4s t e mi n t e m o d ew a sl o n g e rt h a i lk i t a a k e ，a n d t h eo t h e r3s t e mi n t 啪o d ew e r es h o r t e rm a nm ec o n t r o l si np r o p o r t i o n ；t h e i i 锄g l eo f t i l l e ro f 缸舭s g e n i cp l a n t s 、懈l 鹕en 1 锄m ec 伽仃o l s ；t l l ea n 9 1 eo fl e a f w 弱c l o s et o9 0 油ef l o w e r i l l gt i m ew 髂l a t e ft l l 锄也ec o m r o l s ；s e e d g c 肌i n a t i o np e r c e n t a g ej u s th a s3 3 a n d m et h n eo fs e e dg e 肌i n a t ei sm o r e2 d a y st i l 锄t l l ec o n 协d l ；t h et r a n s g e n i cp l 锄tw 弱ac i l lbd e f i c i e n tm u t a n ta n d s h o w e dy e l l o wc 0 l o rp h e n o 哆p e t h er e s u i t ss u g g e s tt h a tm eo b s e e d p h e n 0 勺伊i cc h a n g 馅w e r ed u et 0e x p r e s s i o no ft l l ee x o g e n o u sa t l9 0 9 6 3o 璺b n e k e yw o r d s ：t r a n s g e n e 酣c e g 耶- b i n 血gp r 0 i t e i i lp l 觚t 帅ef e r t i l 时 n l 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 一：耷缘 醐洲年n 6 日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海 南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 ， 一：身分豸、一名：多，孑琵 日期，炒j 2 1 年r 月j 6 日。日期：如9 释易月f 知 本人已经认真阅读“g 气u s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“c a i i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关 权益。 论 悠，7 因 1 综述部分 1 1r a b 蛋白 g t p 结合蛋白( g t l p - b i n c 陆gp r o t c i i 哟，简称g 蛋白，是活细胞内一类具有重要生 理调节功能的蛋白质。此类蛋自由于其生理调节功能有赖于与三磷酸鸟苷( g t p ) 的结 合与水解g t p 的活性而得名。自从7 0 年代初在动物细胞中首先发现g 蛋白的存在以 来，有关g 蛋白的研究发展迅速。现在已不仅知道在几乎所有真核细胞中存在g 蛋 白，而且已经证明g 蛋白在细胞信号转导过程中有着非常重要的调节作用。g 蛋白的 发现和研究，不仅使人们对细胞信号转导以及神经系统的信息传递有了新的进一步认 识，而且在临床医学上有广泛的应用前景和价值，发现和研究g 蛋白的先驱a l 毹d g i l m a n 和m a r t i nr 0 d b e l l 也因此获得1 9 9 4 年度诺贝尔医学生理奖。 活细胞内的g 蛋白一般被分为两大类。一类是由3 种不同亚基( a 、p 、d 构成 的三聚体g 蛋白o l e t e r o t r i m e r i cg p r o t e i l 塔，也被称作大g 蛋白) ，其a 亚基含有与g t p 结合的活性位点并具有g tp 酶活性；a 亚基的分子量范围在3 5 5 5l 【d ；p 和y 亚基 的分子量分别为3 5 3 6l 【d 和8 1 0k d ；b 和y 亚基一般呈稳定的复合体状态存在。 另一类是只含有一个亚基的单聚体g 蛋白，故又被称为小g 蛋白( s n l a l lg f o t e i r l s ) ； 小g 蛋白的结构与功能类似于三聚体g 蛋白中的a 亚基，其分子量在2 0 3 0k d 之间， 有与g t p 结合的活性位点并具有g t p 酶活性；小g 蛋白又可分为胁、和黜【b y _ p t3 个亚类，它们分别参与细胞生长与分化、细胞骨架、膜囊泡与蛋白质运输的调 节过程。本论文研究的基因是拟南芥中的r a b l l ，所以重点综述鼢亚类蛋白。 1 1 1r a b 蛋白的结构 呦蛋白是一种单体形式的g t p 结合蛋白，大约由2 0 0 个氨基酸组成，能够结合 g t p 并将g 1 1 p 水解。由蛋白具有一些共同的结构特征，即由保守的g 结构域和高 度可变的n 端和c 端组成。g 结构域包含5 个a 螺旋( a l a 5 ) ，6 个d 片层( b 1 b 5 ) 和5 个多肽环( g 1 g 5 ) ，并与m 孑+ 相连。6 个p 片层形成疏水的核，与亲水的a 螺旋 和多肽环连接。5 个多肽环中有序列元件与m 矿+ ，g t p g d p 发生相互作用。g t p 的 结合和水解，g 结构域中构象发生变化的区域称为分子开关区域，包括分子开关 i ( s 、i t l li ) 和分子开关i i ( s 、v i t l ii i ) 。研究数据表明，不同i 渤蛋白的分了开关区域相 似，其活性形式不仅结构特点相同而且分子开关i i 的构象保守。与胁蛋白相比， r a b 蛋白的n 端和c 端在长度和序列上是高度可变的。鼬蛋白c 端均有c ，c c ， c x c 或c o ( 模体，该模体是一种膜定位信号。当模体中的半胱氨酸异戊二烯化修 饰后，呦蛋白即通过c 端与膜相连。n 端的作用可能是参与指导c 端半胱氨酸进行 异戊二烯化修饰。对i 讪蛋白突变体及嵌合体的研究表明，分子开关i 和分子开关， 高度可变的n 端和c 端是i 汕蛋白重要功能的决定者。 1 1 2 r a b 蛋白的功能 鼬蛋白作为细胞内囊泡运输的分子开关，与其上游调控子和下游特定的效应子 相互作用，并与g 1 1 p 的结合和水解过程相偶联，在囊泡运输的不同阶段发挥作用。 而其作用的发挥需要l b 蛋白与特定膜的连接。这一过程需要c 端保守的半胱氨酸 进行异戊二烯化修饰。 r 丑b 蛋白的囊泡运输功能真核细胞内细胞器之间通过囊泡的运输相连接，细胞内 膜腔之间的运输一般分为囊泡的形成( b u d d i n 曲、转运m a 船p o n ) 、粘附( t e t l l e r i i l 曲、锚 定( d c o c l 【i i l g ) 和融合( 血s i o r l ) 几个阶段( 图1 1 ) 。i 己a b 蛋白是囊泡运输中普遍存在的组 分，在囊泡运输中既有基本功能又有精细的调控功能。r a b 蛋白通过其定位和活性形 式在确切的时间和地点连接或激活特定的效应子，在囊泡形成、转运、粘附、锚定、 融合等不同的运输阶段调控囊泡的运输。 ( 1 ) l 讪蛋白与囊泡形成囊泡形成需要触江g t p 笛e 、外被体亚基、衔接蛋白、网 格蛋白等多个蛋白质之间的相互作用。一些r a b 蛋白对囊泡的形成是必需的。 ( 2 ) 鼬蛋白与囊泡转运在胞液中，囊泡运输必须经过很长的距离。出蛋白通过 与细胞骨架中肌动纤维和微管蛋白相互作用调控囊泡的运输。如r a b 驱动蛋白6 ( i 汕 l 【i n e s i n 6 ) 是啪6 的效应子，是驱动蛋白家族中的一员，具有传统驱动蛋白的结构特 点。r a b 蚰s i 盯6 与r a b 6 g ，r p 相互作用，并利用以微管蛋白为基础的细胞骨架指导 囊泡的运输。 ( 3 ) r a b 蛋白与囊泡粘附无细胞体系实验研究表明，i 汕蛋白在囊泡的粘附过程中 起重要作用。粘附过程十分复杂，涉及到靶膜、泡膜及胞液中多种蛋白质之间特定的 相互作用。粘附因子常是比较大的多亚基复合物，目前已鉴定的粘附因子包括u s o l ， t r a p p ，e x o c y s t 和e e al 。囊泡不同运输途径中粘附因子无同源性，这表明粘附因子 在赋予囊泡运输特异性中起重要作用。现已证明l 汕5 与e e a l ，s e c 4 与e x o c y s t 之间 有直接的相互作用。呦蛋白与粘附因子在囊泡形成期间( 即在吸收s n 6 眦到运输囊 2 泡上时) 也发生瞬间的相互作用。r a b 蛋白可能通过相同的粘附因子有次序地在囊泡运 输的两个阶段( 形成和粘附) 起作用。 ( 4 ) 壬k l b 蛋白与囊泡锚定及融合囊泡在靶膜上的锚定是由v s n m 砸和t s n 6 u 陋 配对来调控，而且此配对为膜的融合反应提供特异性。i 汕蛋白通过与粘附因子和其 他效应子相互作用促进v s n a r e 和t - s n j d 衄之间的配对，进而促进囊泡与靶膜的融 合。 ( 5 ) 一些r a b 蛋白作为分子时钟。r y b i i l 等研究发现r a b 以循环形式水解g t p ，但 与膜的融合完全不偶联。r a b5 对核苷酸水解速度的限定决定了囊泡锚定及膜融合的 速度。r a b5 被视为内体融合的分子时钟。 囊泡运输是细胞内物质运输的重要方式，如果囊泡运输出现障碍，蛋白质不能到 达目的地，就有可能出现生理失调乃至疾病的发生。目前已经证实一些疾病与r a b 蛋 白有关：m e n 嬲c h c ( 2 0 0 0 ) 研究发现i 己a b 2 7 a 的错义突变导致免疫缺陷，引起g t i s c e l l i s ) ，i l d r o m e ，该病是一种常染色体隐性疾病，由于r a b 2 7a 的突变使得黑色素细胞内黑 素小体的运输出现障碍，从而导致t 细胞的杀伤能力丧失。r h a b d o i d 是一种恶性儿童 肿瘤，m o r i ( 1 9 9 9 ) 等发现鼬a _ b d o i d 肿瘤的发病与r 丑b 3 6 有关。c u l i m ( 1 9 9 4 ) 和h e ( 2 0 0 2 ) 等在研究中分别发现多种肿瘤中存在鼬的过量表达。 形成 桔附 锸定 r a b 曩自； o 技应子； o 鲴曲骨槊叠自； 一s n r e ； o 粘附蛋自 图1 1 囊泡运输阶段示意图 f i g1 1c a p s u l ef o l l i c l et r a n s p o r t a t i o ns l a g e 3 堰谨墨遗蘧薏1霜嘲卜f卜萝 1 1 3r a b 蛋白的循环 l 汕蛋白不仅在g d p ( 二磷酸鸟苷) 结合的无活性形式和g t p 结合的活性形式之间 循环，在时间和空间上调控囊泡的运输，同时也在胞浆和膜之间转位。这些循环的激 活失活及转位至少需要三种调控：g d p 解离抑制因子( g d pd i s s o c i a t i o ni 1 1 1 1 i b i t o r ，g d i ) 、 鸟嘌呤核苷酸交换因子( g i 姗i j 托删d e o t i d e 饮c h a n g ep r o t e i n ，g e p ) 和g t p a 激活蛋白 ( g ，r p a a c t i v a t i n gp r o t e i i l ，q ”) 。 g d l 只与异戊二烯化修饰的无活性的r a b 蛋白连接，将r a b g d p 保持在胞液中， 一旦g d i 移位因子( g d id i s p l a c 锄e n tf a c 胁rg d f ) 将r a b 从g d i 释放出来，r a b 蛋白就 转运到特定的膜腔，在那里g e f 催化g d p 转化成g r p ，r a b 蛋白被激活，r a b g r r p 与下游效应子相互作用，使效应子功能变化。g a p 催化g t p 水解，使r a b 蛋白失活。 g di 与r a b g d p 结合，与其形成复合物，从膜上转移到胞浆中，开始新的循环。 逛2q 多 。 ? 、 昌摊 警 畸 i ：彩，一曩 h i ? 二_二、一；r 。 俄，_ 羹- 一t # 图1 2r a b 蛋白的激活失活循环及转位 1 2 水稻雄性不育研究进展 雄性不育( m a l es t e r i l 时，m s ) 是指雄性器官退化、发育不良或花粉、精子败育 不能行使生育能力而雌蕊发育正常的现象。雄性不育是植物中普遍存在的现象，在高 等植物中，约有4 3 个科1 6 2 个属约6 2 0 个物种具有雄性不育现象。水稻雄性不育分为： 细胞核雄性不育( g e n i cm a l es t e r i l 时，g m s ) 、细胞质雄性不育( c ”叩l 嬲i i l i cm a l e s t 甜l 埘，c m s ) 和细胞核质互作不育。近年来，对于水稻雄性不育进行了遗传学、细 胞学和解剖学以及生理生化等方面的研究，取得了一定进展。本文主要对近年来水稻 雄性不育的研究结果进行了概述。 4 1 2 1 细胞质雄性不育 细胞质雄性不育( c ”o p l 教n i cm a l es t 耐l 时，c m s ) 是指不能产生花粉或只产生没有 活力的花粉的一种母性遗传现象，已报道的水稻雄性不育胞质多达3 5 种，但是在生 产上利用的仅有少数，其中遗传研究较深入的类型有野败型( c m s w 、矮败型 ( c m s d a ) 、红莲型( c m s 瑚、包台型( c m s b d 和滇型( c m s d i a n ) 5 种。研究表明， 其不育主要是由线粒体基因组引起的，而育性恢复要靠细胞核基因组中恢复基因( i 沲) 的作用来实现。 线粒体d n a ( n l t d n a ) 与植物c ms 的关系最为密切。据认为，删a 引起c m s 发生的原因有以下几方面：其一，由嵌合基因引起，m t d n a 中重复顺序介导的重 组频繁，从基因组结构特点看，基因组内有多个正向或反向重复顺序，分子内或分子 间的重组或重排，易形成嵌合基因，阻断了某些发育相关基因的表达，进而导致c m s 发生。其二，由时蛆编辑的不充分和偏离引起，鼬蛆编辑是一种特殊的对妊加工 q r o c e s s i l l g ) 过程，是指转录产物的核苷酸序列与其d _ n a 模板相比发生了变化。i 矾a 编辑有2 种不同的类型：一种是核苷酸的插入或删除，改变了r n a 产物的长度，在 翻译水平上因密码子移位而使下游序列编码出不同的多肽片段；另一种是碱基被替换 而转录本大小不发生改变，在翻译水平上表现为某个氨基酸残基的改变。典型的例子 是碱基c 转化为a ，从而产生新的起始密码子( a u g ) 或终止密码子( u 气a ，u a g ， u g a ) ，最终改变了预测的与c m s 相关的开放阅读框序列。线粒体基因组中与不育 性相关基因的丢失也可导致育性恢复。线粒体基因组只有部分能转录表达，但转录和 翻译情况比较复杂，在任一阶段都可能导致c m s 。 多年来不同胞质类型的恢复基因定位结果可以看出野败型、红莲型、b t 型和滇 一型的主效恢复基因都位于第1 0 染色体长臂中部。野败型细胞质雄性不育系 ( c m s w a ) 是我国杂交水稻生产中应用的主要不育系。研究表明，c m s w a 的育性恢 复性状受两对独立主效基因控制，具有修饰作用，两对基因一强一弱，并存在加性效 应( 梁国华等，2 0 0 1 ) 。t 0 s l l i ) 咄ik b m o r i 等( 2 0 0 4 ) 通过图位克隆的方法克隆了水稻b t 型不育系的恢复基因r f - l ，对其序列进行分析，发现其编码产物为含有1 6 个重复的 p p r o e m a t r i c o p e p t i d er e p e a t ) 基序的线粒体锚定蛋白，对线粒体基因组的a t p 6 ，o r f 7 的 转录产物进行校正加工。b t 型细胞质雄性不育水稻线粒体基因组中存在两个拷贝的 印t 6 ( a t p a s es u b u i l i t6 ) 基因，分别命名为n a p t 6 和b a p t 6 。b a p t 6 转录一个异常的 s 酬盼队转录本，这个转录本包含一个共转录的阅读框o r f 7 9 ，w h g 等将o r f 7 9 基因转 入正常可育水稻中，t 0 代表现半不育，证明了o r f 7 9 引起水稻细胞质雄性不育。w 趾g 进一步图位克隆定位了一段3 7 k b 的染色体区域，测序后发现这段染色体包含两个编 码p p r n t a t r i c o p e p 6 d e 吲搏岣蛋白的基因l m a 和l m b 。通过互补测验发现，r n a 和l m b 都能恢复育性1 m a 和i m b 蛋白通过不同的机制破坏o r f 7 9 产物进行育 性恢复。i m a 通过介导核酸内切酶在三个位置切割b a 肇6 o r f 7 9 i 】f 矾a ，而i m b 通 过介导的b a ：c p 6 6 r f 7 9n l 】心a 降解。 1 2 2 细胞核雄性不育 水稻花粉的发育过程分成8 个时期：( 1 ) 孢原细胞分化期，( 2 ) 小孢子母细胞时期，( 3 ) 减数分裂期，( 4 ) 四分体时期，( 5 ) 小孢子早期，( 6 ) 小孢子晚期，( 7 ) 二胞花粉期，( 8 ) 成 熟花粉期。 1 绒毡层及其他壁细胞相关基因与雄性不育 在水稻中花分生组织由三层细胞构成：l l 层( 表皮) ，l 2 层( 亚表皮) ，l 3 层 ( 核心) 。在花粉囊发育的早期，来自l 2 层的孢原细胞( a r c h e s p o r i 出c e l l s ，a c ) 经 过几次平周分裂，形成初生周缘细胞( 皿m a d rp 撕e t a lc e l l s ，p p c ) 和初生造孢细胞 0 r i i l l a i d rs p o r o g e n 0 璐l l s ，p s c ) 。初生周缘细胞则进行平周分裂产生内外两层次生周 缘细胞( s e c o n d a 巧p a r i e t a l l l s ，s p c ) 。外层次生周缘细胞直接发育成药室内壁，内 层次生周缘细胞进行一次垂周分裂产生中层和绒毡层。绒毡层是直接连接花粉母细胞 的一层，其细胞质中富含线粒体、内质网、高尔基体等细胞器，代谢非常旺盛。它可 向花药室中分泌大量碳水化合物、脂类等物质，为小孢子的发育提供所需的营养和构 成花粉外壁的重要成分。此外，绒毡层还提供各种酶促进小孢子从四分体释放出来。 绒毡层在花粉的发育过程中起着非常关键的作用，任何影响绒毡层发育的突变，都有 可能导致花粉的败育。 在水稻中，m s p l ( n m l t i p l es p o r o c ”e 1 ) 是第一个被克隆到控制早期造孢细胞发育 的基因，它编码富含亮氨酸受体激酶。m s p l 突变产生过多的雌雄孢子母细胞，花药 壁细胞混乱，绒毡层完全缺失，虽然没有影响同源染色体的配对和交换，但花粉母细 胞发育在减数分裂i 期停止，造成完全雄性不育。在水稻中克隆到的另一个绒毡层 发育相关基因是u n d e v e l o p m e n t e dt a p e n 瑚1 d t l ) ，它是次级壁细胞分化为成熟的绒 毡层细胞和孢子母细胞减数分裂所必需的。此基因的t d n a 或t 0 s 1 7 转座子插入 6 引起雄性不育。在减数分裂前，u d t l 花粉囊壁和花粉母细胞都正常，但在减数分裂 期绒毡层空泡化，不能正常分化，中层降解也被抑制，花粉母细胞不能发育成小孢子。 l i 克隆了一个绒毡层细胞程序性死亡( p r o 野珊m e dc e l ld e a m ，p c d ) 相关基因 t a p e n 蚰d e g e 鹏r a l i o nr e t a l 出曲n ( t 蛐，t d r 属于b h l h 类型的转录因子，且t d r 主 要在绒毡层表达。在t d r 突变体中，绒毡层和中层延迟降解，小孢子解体，导致完全 雄性不育。 花粉囊壁由4 层组成：最外面是表皮层，然后是药室内壁、中层，最里面是绒毡 层。表皮层上还有一层角质层，角质层由上表皮蜡质层和角质膜层组成。j u n g 在水稻 中克隆了一个花粉囊蜡发育相关基因w 珏d 醯c i e n ta n n l e r l ( w d a l ) ，该基因在花粉囊表 皮层强烈表达。在w d a l 突变体中，花粉囊严重失水皱缩，并容易为不良环境损伤，花 粉囊表皮层的上表皮蜡质层结晶缺失，花粉外壁不能形成，小孢子发育严重延迟，最 终败育。 2 胼胝质沉积相关基因与雄性不育 减数分裂前，小孢子母细胞在纤维素壁和质膜之间合成一种特殊的由胼胝质( p 1 ， 3 葡聚糖) 组成的细胞壁。随着减数分裂的进行，胼胝质的沉积增厚，包裹着减数分裂 的产物，直到最后形成四分体时达到最厚。四分体之后减数分裂完成，小孢子的外壁 也开始形成，在绒毡层分泌的胼胝质酶作用下，胼胝质开始降解，并将小孢子释放到 花粉囊腔中。胼胝质可以防止花粉母细胞粘连和融合，并可作为分子滤膜保护发育中 的花粉，防止花粉早熟膨胀而破裂。 u d p 葡萄糖焦磷酸酶( l m p 酉u c o s ep y r o p h o s p h o d ，l 雒eu g p a u s e ) 催化葡萄糖一l 一磷 酸酯和u t p 反应生成u d p 葡萄糖和焦磷酸盐。在水稻基因组中有两个同源的 u g - p 嬲e ，l | 印1 和u g p 2 ，u g p l 在植物整个发育过程中都表达，在花器官中表达最强， 尤其在花粉囊发育期的花粉中表达更强。u g p l 基因的r n a 干扰和共抑制使胼胝质不 能在花粉母细胞上沉积，导致完全的雄性不育。在u g p l 埘转基因水稻中双链r n a 干扰载体的表达致使u g p l 和u g p 2 基因完全沉默，引起多种发育异常，表明u g p 邪e 在植物的生长和发育中起着关键的作用。更重要的是，u g p l 共抑制植物带有内含子的 未加工的原始转录本，温度影响这个异常转录本的拼接，由此产生一个新型的温敏核 雄性不育。 3 减数分裂相关基因与雄性不育 7 减数分裂形成雌雄配子体，是进行有性生殖的植物在生殖过程中最早发生的行为， 也是最重要的环节。减数分裂和有丝分裂不同，减数分裂通过一轮d n a 复制，而发 生两轮细胞分裂产生单倍体细胞。减数分裂是一个相当复杂的过程，这个过程需由一 系列的基因在时空上按照极为精确的顺序，通过不断的启动关闭，相互协调，最终完 成从二倍性体细胞到单倍性性细胞的转变过程。这过程需要很多基因的参与，在已克 隆控制减数分裂的基因中，大部分基因是雌雄配子发育共同需要的，小部分基因是雌 雄配子发育特异的。因此，减数分裂过程中的基因突变，往往不仅影响雄性配子的育 性，而且影响雌性配子的育性。水稻减数分裂相关基因p a 瓜l 和姗都是雌雄发 育必需的，这些基因的突变都造成雌雄配子都不育。 最近，在水稻中克隆了一个参与孢子母细胞减数分裂过程的基因i o s i s a i u 也s t e da tl e p t o t e n e l ( m e l l ) ，m e l l 属于a r g o n a u t e ( a g o ) 家族，a g o 家族成员通过i 矾a 介导基因沉默在植物的发育中发挥着重要的作用。在水稻基因组 中有1 8 个a g o 家族基因的拷贝。m e l l 基因突变后，花粉母细胞多核、液泡化，线 粒体也由生殖细胞型变为体细胞型，染色体的浓缩在减数分裂早期停止且大小不规则， 着丝粒旁侧区的组蛋白h 3 赖氨酸的二甲基化作用稍微减少，核仁和核仁组织区的结 构也发生改变，导致雄性配子的完全不育。 4 花药开裂及其他相关基因与雄性不育 水稻花药开裂相关基因a i d l ( a n n 也ri n d e h i s c e lj 编码一个有单m y l 结构域 的蛋白，这与端粒结合蛋白非常相似。该基因突变造成部分雄性不育。洲y b 是g a 信号转导途径中的第一个蛋白，是调控淀粉酶基因表达的正调控因子。水稻中的 o s g a m b 基因在糊粉细胞、花序顶端、雌蕊原基、绒毡层细胞中有高水平的表达。该 基因突变，在营养生长期没有明显的变化，但到生殖生长期，可以看到节间变短，花 器官发育不正常，尤其是花粉发育不正常。表明o s q 6 山m 对于花器官是非常重要的， 对花粉的发育是必要的。o s g e n l ( o s g e n 1 i k e ) 是r a d 2 ，g 核酶家族的一员，它 在早期小孢子发育所需的d n a 代谢方面起着重要的作用，它的突变能造成花粉育性 大大降低或不育。另一个雄性不育突变体o r ) ，s a s a t i v a 肿p o l l 饥( o s n o p ) 的花粉数目减 少，o s n o p ( o d ，s 弱撕v a n 0p o l l e n ) 可能在花粉发育后期以及花粉的萌发期起作用，造 成突变体花粉数目减少。因为o s n o p 有c 2 和g r a m 结构域，所以推断0 s n o p 可 能是链接钙和磷酸肌醇信号的通路 8 1 2 3 结语 尽管近二十年来全世界在细胞质雄性不育分子机理的研究上取得了不少进展，但 仍未能完全揭开细胞质雄性不育机理。主要是由于细胞质雄性不育机理的复杂性、细 胞质遗传的特点以及实验技术限制等原因造成的。细胞质雄性不育与线粒体有关，由 于植物线粒体基础研究相对落后，具有非孟德尔遗传的特点，无法确定控制细胞质雄 性不育线粒体基因“对数 ，更无法分析线粒体基因控制性状与线粒体基因的关系以及 遗传的规律。在水稻发育过程中不知有多少个基因，多少条信号转导途径相互作用， 相互协调，以保证水稻花药的发育。目前在水稻上克隆的雄性不育相关基因大部分属 于这个过程的基因，但是和参与这个过程的基因数量相比，简直是沧海一粟。在水稻 细胞的三大遗传系统中存在着遗传物质的交流，掌握在核、叶绿体以及线粒体之间来 回穿梭的d n a 或r n a 的结构与行为特征，加强分子生物学等新技术方法的运用，就 有望最终阐明水稻雄性不育及育机理。 1 3 株型综述 全世界有大约9 0 的水稻种植者和消费者在亚洲。水稻品质改良与这些地区人们 的生活水平和健康息息相关。中国长期以来以产量为主导思想，虽然在高产育种等相 关方面取得世界领先的进展，但在优质育种的资源积累、优质特性评价、鉴定技术和 创新利用及优质特性遗传研究各方面都落后于日本，泰国，美国等国家。而株型与水 稻产量息息相关。因此株型育种是今后水稻育种的一种趋势。研究表明，水稻株型性 状与产量有显著的相关性，另有研究表明：不同株型水稻品种在糙米率、整精米率、 胶稠度、米粒长度、垩白粒率和垩白面积等品质性状上也表现较大的差异。所以研究 株型性状具有一定的理论意义与现实意义。 株型( p l 蝌tt 1 忡e ) 是指与作物品种产量能力有关的特征或植物体在空间的排 列方式，即长势长相，具体性状包括：株高、节间数、节间长度、叶基角、叶开张角、 叶披垂度、叶长、叶宽、叶厚、叶面积、分蘖力、茎蘖散度、穗型、生物量、谷草比 等。在此基础上，提出理想株型( i d e a lp l a n tt 悒) ，指有利于植株光台作用、 生长发育和籽粒产量的性状组成的理想化株型。它能最大限度地提高群体光能利用 率，提高经济系数。 9 1 3 1 穗型 穗型是株型研究的重点，国内外的论述差异较大，一般认为，水稻的穗型应由穗 粒数，穗重，穗长，分枝集散程度，穗的弯曲程度，着粒密度等一些穗粒性状组成， 是水稻种性的重要组成部分。从不同角度研究穗型，有不同的穗型划分方法。如徐正 进等根据弯曲度标准将水稻品种划分为直立、半直立、弯曲三种穗型，日本通常把水 稻品种划分为穗数型，穗粒并重型和穗重型 1 3 2 株高 株高是水稻最重要的农艺性状之一。2 0 世纪5 晰o 年代，世界上以水稻矮秆育 种为特征的“绿色革命一源于我国，是实践与株型理论相结合的第一个发展阶段，即 矮化育种阶段。这一阶段的研究中心是通过降低株高提高作物的抗倒伏能力，进而增 加种植密度，提高叶面积指数和生物产量，从而提高作物群体的产量，并选育出了一 条列的矮秆高产品种。 随着株型理论研究的深入和生产实践发展，对株高有了新的认识，认为产量上要 有较大的突破必须在生物产量上有大幅度的提高，株型矮小影响群体生物产量的进一 步提高，因而在育种上选育株高在1 m 左右的半矮秆品种成为现代育种的主流，纵观 株型育种的发展在株高方面是矮中有升。 目前，水稻矮杆性状的遗传机制己较明确，s d 1 是迄今为止唯一广泛应用于育种 和生产的半矮杆基因。在籼稻中，矮杆是由单隐性基因或，l 对隐性基因控制，而由 多基因控制的矮杆性状仅有2 - _ 3 例文献报道。在粳稻中，矮杆性状的遗传分两种情 况，如矮银坊，朝日等的半矮生性受单隐性基因控制。伴有较高修饰作用的修饰基因， 少部分矮杆表现了2 或3 对基因遗传：清锦、矮杆黄等则表现为微效多基因遗传，水 稻株高的野生型表现为高杆。但在众多的矮杆突变体中。有2 个矮杆基因d 5 3 和d r n l 表现为显性或部分显性。 迄今已发现了显性矮杆基因。隐性高杆基因及6 0 余个互不等位的隐性矮杆基因， 但是对水稻非s d 1 矮杆的育种利用研究进行的不多。水稻利用s a 1 育成大量的品种， 并使水稻产量在7 0 年代上了一个台阶。同时单一利用s d 1 基因带来的隐患也正成为 广大育种家和遗传专家的共识。因此利用水稻非s d 1 矮杆基因及其紧密连锁的有利 基因，能使水稻的产量、抗性、米质育种上一个新台阶。 水稻根系不仅是水分和肥料的吸收器官。而且还具有氨基酸和激素的合成以及转 1 0 化等多种功能。水稻根系的生长和活力的维持。对地上部分的生长发育和产量形成有 着十分重要的意义一。在水稻中己定位了控制根长、根粗、根重、根穿透能力等性状 的q t l ，但对根系活力遗传的研究尚处于起始阶段。 1 3 3 叶片 叶片是水稻的主要光台器官，叶片角度与光台速率有密切关系，是水稻重要的形 态特征之一。群体的光台生产力主要袂定于叶的光台生产力，它包括叶面积指数的大 小( l m ) ，叶面积持续时间( l 岫) 和单位叶面积的净同化率( n a r ) 等三方面因 素。从6 0 年代起，作物生理学家、育种家和栽培学家对群体光台生产力的研究，一 直围绕适宜叶面积和提高单位叶面积光台效率等问题进行了大量的工作。 据郭二男( 1 9 8 1 ) 研究，使粳稻叶片表现直立型的剑叶张开角、长度、宽度以及 剑叶面积似乎皆受微效多基因控制，且不同程度地表现显性或部分显性。c h g 研究 认为，开展剑叶对直立剑叶为部分显性，在株型差异显著的亲本杂交组合中，下部叶 片角度是一个动态性状，即f l 植株的角度在早苗期明显下垂。但f 2 植株的叶片角度 在抽穗期转为接近正态分布且有稍多的直立叶后裔。叶长、叶宽和叶面积在某些组台 中表现接近正态分布，而在另一些组台中被证明为复杂的基因相互作用。 从上世纪5 0 年代矮化育种的兴起，育种家对上位叶的直立特别关心。吕川根认为 理想株型属前期叶片弯披、株型松散，中后期叶片挺直、株型紧凑，茎部消光系数在 0 7 0 8 ，群体光照分布合理。戴照义对齐穗期的高杆农家品种、高杆改良品种、矮杆 品种和杂交稻研究表明：顶3 叶和茎杆夹角逐渐减少。群体透光率增加，因此群体结 构不断改善。 一般高产品种功能片的配置关系长度以倒二叶最长，宽