（作物遗传育种专业论文）小麦杂交种与亲本之间差异表达基因的分离、克隆与功能鉴定.pdf

摘要 研究表明，杂种优势的形成与杂种一代中亲本基因的表达方式改变有关。为深入探讨基因差 异表达与小麦杂种优势表现的关系，本研究以普通小麦( t r i t i c u ma e s t i v u ml ) 3 3 3 8 和斯卑尔脱 小麦( t r t i c u ms p e l t al ) 2 4 6 3 及其种间杂交种3 3 3 8 2 4 6 3 为材料，采用抑制差减杂交技术，对杂 种与亲本叶片和根系中差异表达的e s t 进行了批量克隆，并对部分e s t 进行了差异表达验证、 电子定位和比较基因组学分析。另外，还分离了部分差异表达基因的完整o r f 序列，完成了其 表达模式分析。并将其中的3 个基因( 1 4 3 3 、a d p 核糖基化因子以及组蛋白脱乙酰化酶基因) 转化拟南芥。得到了表型存在明显变异的阳性植株。主要结果如下： 1 ， 采用温室营养液培养方法，系统测定了种间杂交种3 3 3 8 2 4 6 3 与其亲本根系性状的表现，并 计算了各性状的中亲优势和超亲优势。结果表明，5 个性状( 总根长、根表面积、总体积、 根尖数、根干重) 的中亲优势均超过2 0 而且达到显著水平，尤其是根千重，中亲优势和 超亲优势分别达到3 5 3 2 和2 5 5 2 ，而叶干重的中亲优势为2 3 3 3 ，超亲优势未达到显著 水平，可见根系的杂种优势幅度要大于地上部。同时提出以“遗传发育相对简单的根系”作 为模式性状开展研究，将有助于加深对小麦杂种优势分子机理的认识。 2 利用抑制差减杂交法，构建了4 个小麦杂交种与亲本的差减f a s t 文库，分别富集了根系中杂 种增强、杂种减弱表达以及叶片中杂种增强、杂种减弱表达的基因，并依次命名为根系杂种 库、根系亲本库、叶片杂种库、叶片亲本库。对4 个库中9 2 6 个e s t 进行了测序，获得了 7 4 8 个非冗余的f a s t 序列。这是目前对小麦杂交种和亲本之间最大规模的差异表达e s t 的分 离和克隆结果。b u 堪t x 分析结果表明，有4 6 5 个e s t 推测编码的蛋白质与其他物种的已 知蛋白氨基酸具有很高的相似性，其功能涉及到植物生长发育的各个过程，包括新陈代谢、 细胞生长与维持、光合作用、转录调控、抗逆性等。 3 采用反向n o r t h e r n 技术验证了4 4 3 个来自于根系差减杂交库的e s t 的差异表达，发现6 8 1 6 的基因在杂交种与亲本之问的差异表达模式与s s h 结果相一致；对1 8 个基因进行了半定量 r t - p c r 分析，结果显示其中的1 5 个与s s h 结果一致：另外，采用荧光实时定量p c r 技术 分析了3 个e s t 的表达情况，发现其差异表达模式与s s h 、半定量r t - p c r 以及反向n o r t h e r n 结果一致。 4 利用比较基因组学的方法将差异表达e s t 定位在水稻的基因组上，著与前人定位的水稻杂种 优势位点进行了比较分析。结果发现，有1 0 4 个e s t 定位于4 个控制水稻产量性状杂种优势 q t l 位点中( 9 0 ，e 值 e ”) 。其中有3 0 个f s t 位于控制每穗粒数的杂种优势区域9 个 e s t 位于控制每株分蘖数的区域。3 4 个e s t 位于控制千粒重的区域，另外5 2 个e s t 位于控 制产量的杂种优势位点。这是目前对小麦杂交种与亲本之间差异表达e s t 最大规模的定位和 比较基因组定位结果，为实现杂种优势的分子基础和遗传基础的整合提供了可能的研究途径 和方法。 5 采用电子克隆结合r t - p c r 的方法验证，分离克隆了2 5 个具有完整o r f 结构的差异表达基 因，其中包括1 5 个小麦核糖体蛋白基因( t a r p ) ，g t p 结合蛋白( t a r a b ) ，2 0 s 蛋白酶体b 4 、b5 、b7 亚基( t a 2 0 8 4 ，t a 2 0 8 5 、t a 2 0 8 7 ) ，a d p 核糖基化因子( t a a r f ) ，1 4 3 3 蛋白 ( t a l 4 - 3 3 ) ，组蛋白脱乙酰化酶( 姗) ，泛素结合酶( t a u b c ) ，肌酵磷酸化蛋白( t a l p p ) 以及富含亮氨酸重复蛋白( t a l r r p ) 。并对其时空表达特点以及在杂种与亲本之间的表达模 式进行了分析。 6 为了进一步研究差异表达基因的生物学功能，对3 个差异表达基因( t a 4 p , f 、t a l 4 - 3 3 、t a h d ) 进行超量表达转化拟南芥，并对转基因阳性植株进行了基因组水平、表达水平以及插入拷贝 数的检测，在转基因株系中的确检测到上述基因的表达。对转基因株系进行表型鉴定，3 个 超表达t a l 4 - 3 3 的转基因株系比野生型和转入空载体株系根系明显变短平均变短2 2 7 ， 达到极显著水平( p 0 毗) 而且株高变矮；3 个超表达t a a r f 的转基因株系叶片变大，开花 期提前；2 个超表达t a h d 的转基因表现叶形态变异，包括第一、二片真叶不对称生长，以 及叶形的变化。这些研究结果为揭示基因差异表达与根系杂种优势的关系提供了重要的实验 证据。 关键词；小麦，杂种优势，抑制差减杂交，基因表达，基因克隆 a b s t r a c t h e t e r o s i sw a sd e f i n e da st h ea d v a n t a g eo fh y b r i dp e r f o r m a n c eo v e ri t sp a r e n t si nt e r m so fg r o w t ha n d p r o d u c t i v i t y p r e v i o u ss t u d i e ss h o w e dt h a t d i f f e r e n t i a lg e n ee x p r e s s i o nb e t w e e nh y b r i d sa n dt h e i r p a r e n t s i sr e s p o n s i b l ef o r t h eh e t e r o s i s ；h o w e v e r , i n f o r m a t i o no ns y s t e m a t i ci d e n t i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o n o ft h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e s & r el i m i t e d 1 i nt h i ss t u d y , a ni n t e r s p e c i f i ch y b r i db e t w e e nc o b n o nw h e a t ( t r i t i c u m a e s t i v u m i 2 n = 6 x = 4 2 ， a a b b d d ) l i n e3 3 3 8a n ds p e l t ( t r i t i c u m s p e l t al2 0 = 6 x = 4 2 ，a a b b d d ) l i n e2 4 6 3w a sf o u n dt o b eh i g h l yh e t e m t i ci nb o t ha e r i a lg r o w t ha n dr o o tr e l a t e dt r a i t s ，t e nr o o tc h a r a c t e r sw e r em e a s u r e d i n c l u d i n gt o t a lr o o tl e n g t h ( t r l ) ，r o o ts u r f a c ea r e a ( r s a ) ，r o o ta v e n g ed i a m e t e r ( i d ) r o o tt i p s n u m b e r ( r 舶町，l o n g e s tr o o tl e n g t h 觚l ) ，t a p r o o tn u m b e rf i n ) ，t a p r o o tl e n g t h0 x ) ，r o o tv o l u m e 皿v ) ，r o o td r yw e i g h t ( r d w ) a n dr o o t s h o o tr a t i o 僻s r ) w eo b s e r v e ds i g n i f i c a n tm p h ( p 0 0 5 ) f o rf i v et r a i t s0 r lr s a ，r v ，r t na n dr d w ) 2 s u p p r e s s i o ns u b t r a e t i v eh y b r i d i z a t i n nw a sp e r f o r m e dt 0g e n e r a t ef o u rs u b t r a c t e de d n al i b r a r i e s ， d e s i g n a t e df s l ( f o r w a r ds u b t r a c t i v el i b r a r yo fl e a v e s ) ，r s l ( r e v e r s es u b t r a c t i v el i b r a r yo fl e a v e s ) ， f s r ( f o r w a r ds u b t r a c t i v el i b r a r yo ft o o t s ) ，a n dr s r ( r e v e r s es u b t r a c t i v el i b r a r yo fr o o t s ) ，w h i c h e n r i c h e dg e n ee x p r e s s e ds p e c i f i c a l l yo ra th i g h e rl e v e li nh y b r i dl e a v e s ，p a r e n tl e a v e s ，h y b r i dr o o t s a n dp a r e n tr o o t s ，r e s p e c t i v e l y at o t a lo f7 4 8n o n r e d u a n d a n tc d n a sw e r eo b t a i n e d a m o n gw h i c h 4 6 5 h a dh i g hs e q u e n c es i m i l a r i t yt ot h eg e n b a n ke n t r i e sa n dr e p r e s e n td i v e r s ef u n c t i o n a l c a t e g o r i e s ，s u c ha sm e t a b o l i s m ，c e l lg r o w t ha n dm a i n t e n a n c e ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，p h o t o s y n t h e s i s ， r e s p o n s et oa t r e s s ，t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o na n do t h e r s 3 t of u r t h e rt e s tt h er e l i a b i l i t yo fs s ha n dc o m p a r et h ee x p r e s s i o np a t t e r no fd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d c d n a sb e t w e e nh y b r i da n di t sp a r e n t s ，r e v e f s en o r t h e r nb l o ta n a l y s i sw a sc o n d u c e df o ras u b s e to f 4 4 3n o n r e d u n a n tc d n a so b t a i n e df r o mt h er o o tl i b r a r i e s t h er e s e t si n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o n p a t t e r n so f6 8 2 s s h - d e r i v e dc d n a sw e r ec o n f h m c db yr e v e r s en o , h e mb l o t w e a l s o p e r f o r m e dt h es e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c ra n a l y s i so f1 8e s t s w h i c he x h i b i t e dt h es i m i l a rr e s u l t s ( 7 2 2 、t h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o np a t t e r n so fa n o t h e r3e s t sw e r ec o n f i r m e db yr e a l t i m e q u a n t i t a t i v ep c r 4 at o t a lo f 3 1 3c d n a sw e r el o c a t e do nt h ec h i n e s es p r i n gd e l e t i o nm a pb y ns i u c om a p p i n gw i t h e - v a l u et h r e s h o l d se - ”，a n d1 0 4c d n a sw e r em a p p e di nr i c eh e t e r o t i cl o c ir e g i o n sb yc o m p a r a t i v e m a p p i n g ，i nw h i c h3 0c d n a sf o rg r a i n sp e rp a n i c l e ，9f o rt i l l e r sp e rp l a n t ，3 4f o rw e i g h to f1 0 0 0 g r a i n sa n dt h e5 2f o ry i e l d 5 i ns i l i c oc l o n i n ga p p r o a c hw a sa p p l i e dt oo b t a i nf u l l l e n g t he d n as e q u e n c e sf r o mn o v e lg e n e s e q u e n c e sa n dt h es e q u e n c e sw e r ec o n f i r m e db yr t - p c r w eo b t a i n e d2 5c d n a sc o n t a i n i n g c o m p l e t eo p e nr e a d i n gf r a m e s 幻r f ) a c c o r d i n gt ob i o i n f o r m a t i ca n a l y s i s ， w h i c hi n c l u d ef i f t e e n p u t a t i v ew h e a tr i b o s o m a lp r o t e i ng e n e s ( r a r e ) ，s m a l lg t p - b i n d i n gp r o t e i n ( t a r a b ) ，2 0 s i l l p r o t e a s o m e b4 ，b5 ，b7 s u b u n i t ( t a 2 0 8 4 , t a 2 0 b s , t a 2 0 8 7 ) ，u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n ge n z y m e ( 而u b 0 ，i n o s i t o lp h o s p h a t a 一l i k ep r o t e i n ( t a l p p ) ，l e u c i n e - r i c hr e p e a tp r o t e i n ( t a l r r p ) ， a d p - r i b o s y l a t i u nf a c t o r ( t a , 4 r f ) ，h i s t o n ed e a c e t y l a s e ( t a h d ) ，a n d1 4 - 3 - 3p r o t e i n ( t a l 4 - 3 - 3 ) a n d t h es p a t i o 。t e m p o r a le x p r e s s i o np a t t e r na n dd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o nb e t w e e nh y b r i da n di t s p a r e n t s w e r ea l s od e t e r m i n e db ys e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c r 6 t h e 8g e n e s ，s u c ha st a l 4 - 3 3t h a tw a sd o w n - r e g u l a t e di nh y b r i di nl e a fa n dr o o ta tt i l l e r i n gs t a g e t a a r fa n dt a h d ，b o t ho fw h i c hw e r eu p - r e g u l a t e di nh y b 谢。w o r eo v e r e x p r e s s e di n a r a b i d o p s i s t h ep r e s e n c ea n dt h ee x p r e s s i o no ft a l 4 - 3 - 3 ，t a a r fa n dt a h di nt h et r a n s g e n i c a r a b i d o p s i sw e e c o n f i r m e di nt h et r a n s g e n i cp l a n t s w ef o u n dt h a tt h er o o tl e n g t ho ft r a n s g e n l cp l a n t so ft a l 4 - 3 3 w a sd e c r e a s e db y2 2 7 i na v e r a g ea sc o m p a r e dt ot h a to fw i l dt y p e a n dt h el e a fs i z ea n dp l a n t h e i g h tw a sf o u n dt ob ei n c r e a s e di nt h et r a n s g e n i ep l a n t so ft a a r f i na d d i t i o n ，t h ep h e n o t y p l e a b n o r m a l i t i e si nl e a fd e v e l o p m e n ts u c ha sa s y m m e t r i cl e a v e sw e r ef o u n di nt r a n s g e n i cp l a n t so f 而肋 k e yw o r d s ：w h e a t , h e t e r o s i s , g e n e e x p r e s s i o n , o e n e c l o n i n g s u p p r e s s i o ns t d y a a c t i v e h y b r i d i z a t i o n 本研究是孙其信教授主持的国家重点基础研究发展规划项 目( 9 7 3 项目) “农作物杂种优势及其利用的分子生物学基础” ( 2 0 0 1 c b l 0 8 8 ) 、国家杰出青年科学基金( 3 9 9 2 5 0 2 6 ) 、国家自 然科学基金( 3 0 2 7 0 8 2 4 ) 和北京市自然基金重点项目“小麦杂 种优势群构建及其遗传基础研究”( 5 9 9 1 0 0 1 ) 的部分研究内容 英文符号 a f l p c d n a ： c d n a - a f l p ： d d i n ：p c r ： d n a m r n a 0 d o l i g o ( d n o r f p c r r a p d r p m r t 二p c r s s h s s r m p h b p h t r l r s a r a d r t n u u 。 t n t l r v r d w r s r g o 主要符号表 英文全称 a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m c o m p l e m e n t a r yd n a c d n a a m p l i f l e df r a g m e n tle n g t hp o l y m o r p h i s m d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r d e o x y f i b o n u e l e i ca c i d m e s s e n g e rr n a o p t i c a ld e n s i t y o l i g o d e o x y t h y m i d y l i ca c i d o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a r o u n d sp e rm i n u t e r e v e r s e - t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n s i m p l es e q u e n c er e p e a t m i d - p a r e n th e t e r o s i s b e s t - p a r e n th e t e r o s i s t o t a lr o o tl e n g t h r o o ts u r f a c ea r e a r o o ta v e r a g ed i a m e t e r r o o tt i p sn u m b e r l o n g e s tr o o tl e n g t h t a p r o o tn u m b e r t a p r o o tl e n g t h r o o tv o l n i n e r o o td r yw e i g h t r o o t s h o o tr a t i o g e n eo n t o l o g y 中文译名 扩增片段长度多态性 互补d n a c d n a 扩增片段长度多态性 差异显示逆转录p c r 脱氧核糖核苷酸 信使r n a 吸光值 寡聚脱氧胸苷酸 开放阅读框 聚合酶链式反应 随机扩增多态性d n a 每分钟转速 反转录聚合酶链式反应 抑制消减杂交法 微卫星d n a ( m i c m s a t e l l i t e d n a ) 又称简单重复序列 中亲优势 超亲优势 总根长 根系表面积 根平均直径 总根 最长根长 主根数 主根长度 根系体积 根干重 根冠比 基因功能分类 v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研姓张饥穰幔帆硝年多月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：由悟薇影艮 时间：旷叮年月，莎日 导师签名：讥彩 r 髓飒：乳劣年r f zl t 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 杂种优势( h y b r i dv i g o r , h e t e r o s i s ) 是生物界普遍存在的一种现象。杂种优势是指两个遗传基 础不同的品种、品系或自变系进行杂交，所产生的杂交种在生活力、生长势、抗逆性、适应性以 及产量、品质等方面超过其双亲的现象。 植物杂种优势研究最早始于欧洲。德国学者k o l r e u t e r 在1 7 6 1 1 7 6 6 年间利用早熟的普通烟草 ( mt a b a c u m ) 与比较晚熟的心叶烟草( mg l u t i n o s a ) 进行种间杂交，育成了早熟、品质优良的 种间杂种。m e n d e l ( 1 8 6 5 ) 在豌豆杂交试验中，也观察到杂种优势现象，并首次提出杂种活力( h y b r i d v i g o r ) 这个术语。真正对植物杂种优势现象进行系统理论研究的，最早应追溯到d a r w i n 撰写的 物种起源。他利用1 0 年的时间仔细观察了植物界异花受精和自花受精的变异，搜集并研究 了共3 0 个科5 2 个属5 7 个物种及其许多变种的不同植物亲本与其杂交后代( 包括杂种一代) 在 种子发芽率、株高、生活力和结实率等方面的差异，提出了“异花受精对后代有利和白花受精对 后代有害”的结论，并第一个指出玉米杂种优势现象。此后，s h a m e l ( 1 8 9 8 - 1 9 0 2 ) 、s h u l l ( 1 9 0 2 1 9 0 9 ) 、 e a s t ( 1 9 0 8 ) 、c o l l i n s ( 1 9 1 0 ) 和j o n e s ( 1 9 1 8 ) 等先后进行了玉米自交系选育与杂种优势的研究。 直至2 0 世纪2 0 年代中后期玉米杂交种在生产上成功大面积推广和应用，并产生了专门生产和 经销玉米商用杂交种的科技行业，即种子公司。到目前为止，世界上主要农作物中的玉米、向日 葵、烟草、高粱、棉花、油菜和水稻等都已经成功利用杂种优势，并取得了巨大的经济效益，为 人类的生存和发展做出了巨大的贡献。 目前作物杂种优势已在生产上得到广泛利用，但杂种优势机理研究却远远落后于实践，缺乏 全面系统的认识，制约了更大范围内杂种优势的有效利用。例如，我国玉米杂交种的杂种优势潜 力在过去1 5 年中没有显著的提高。围绕杂种优势形成的原因，国内外学者作了大量探讨，提出 了种种假说。近年来，随着分子生物学技术的发展，杂种优势分子机理成为国内外关注的热点， 并已取得了一些可喜的研究进展。 第一节杂种优势的遗传学基础研究进展 1 1 1 显性假说 显性理论称为有利显性基因假说，或称显性假说，由b r u c e 等( 1 9 1 0 ) 首先提出，经j o n e s 等( 1 9 1 7 ) 进一步补充。该假说认为：杂种优势是由于双亲的显性基因在杂种中聚合所引起的互 补作用。多数控制个体生长和发育的基因对中，显性基因比其相应的隐性基因更有利于个体生长 和发育。来自一个亲本的显性基因可以遮盖来自另一亲本的隐性基因，f l 杂种比亲本的显性基因 组合多从而增加了杂合子代的生长势。该假说的基本观点是，有利的显性基因抑制隐性基因的 不利作用，通过基因问的互补，杂交种就能发挥出超过亲本的强大生长势。 显性假说的强有力的试验证据是k e e b l e 和p e l e w ( 1 9 1 0 ) 发表的豌豆品种杂交试验。他们 发现用两个豌豆品种杂交所得到的杂交种，由于两个不同显性基因对生长具有不同的效应，即两 置目量兰皇曼曼! 皇曼鼍曼鼍皇皇皇曼皇! 曼曼曼! 曼舅蔓曼皇皇曼! ! 曼! 曼曼鼍鼍曼量兰皇蔓寰曼曼鼍鼍舅量曼! 兰! ! !l ： ： 个株高1 5 3 - 1 8 3 m 的豌豆品种杂交，一个是粗茎的，节数多而节间短，另一个是细茎的，节数少 而节间长，杂种一代结合了两个亲本节数多和节间长的特性，使株高达到2 1 4 2 4 4 m ，表现出株 高杂种优势。 关于显性有利基因的作用大体有3 个方面：它们对不利隐性基因的抑制作用；圆有利显 性基因的累加效应，是由于两亲本带有多个显性等位基因所引起的结果使杂交种获得更多数目 的显性基因，即加性效应： 分布在不同位点上的显性基因的互作效应，即上位性效应。 1 1 2 超显性假说 由s h u l l ( 1 9 0 8 ) 和e a s t ( 1 9 3 6 ) 提出的超显性假说从等位基因杂合性出发，认为等位基因 的互作( 包括上位性) 产生的表型效应超过纯合的等位基因，杂种优势主要取决于双亲基因型的杂 合状态。e a s t 认为产生杂种优势的根本原因是亲本的异质性。两个自交系的基因型差别越大，杂 种优势就越大。这种差别发生于同一基因位点上，同一基因位点上可以分化出许多微效基因，具 有不同的结构和生理功能。微效基因之间无显隐性关系但是它们的共同作用却能显示出超过显 性的效果。 超显性理论的直接试验性证明是所谓单因子杂交种的杂种优势。是在两个纯合系杂交时观察 到的。这两个纯合系只在一个位点上的一对等位基因上有差异。s e h u l l e r 等( 1 9 5 4 ) 许多研究者 在发现和研究这个现象及其在杂种优势中的作用方面作了大量工作。在具有不同水平杂合性、但 来自相同亲本自交系的杂交种上进行了杂种优势大小鉴定的试验，来说明超显性理论。 总之，显性假说考虑到等位基因的显性作用，但没有指出非等位基因的相互作用，即上位性 效应；超显性假说完全排除了等位基因间的显隐性的差别。综观生物界杂种优势的种种表现，这 两种假说所解释的情况都存在。 1 1 3q t l 定位和分析与杂种优势遗传学假说 由于表现杂种优势的许多农艺性状都是数量性状，是许多0 1 k 共同作用的结果。而以上的 两种假说都基于遗传学单基因理论，很难解释非等位基因之间的互作效应。因此。基因间的上位 性研究近年来越来越受重视。而且随着分子标记技术迅速发展和高密度遗传连锁图的构建，基于 分子标记位点的q t l 效应检测不仅可以对经典的显性假说和超显性假说在分子水平上进行检验 而且可以通过标记位点的互作分析来检测非等位基因间的互作( 上位性) 及其效应大小和方向。 s t u l ”r 等( 1 9 9 2 ) 选用覆盖玉米9 0 - 9 5 基因组的7 6 个r f l p 分子标记对一个优良玉米单交 种( b 7 3 x m o l 7 ) 产生的b 与双亲回交得到的两个回交群体进行了o t l 定位。在两个回交群体 中分别检测到6 个和8 个q t l s 影响籽粒产量，每个群体中的q t l s 分别约解释6 0 的表型变异， 结果发现玉米数量性状籽粒产量的杂种优势与位点杂合性呈正相关( 相关系数0 6 8 ) ，从而认为 超显性是杂种优势的遗传基础。x i a o 等( 1 9 9 5 ) 利用籼稻f 7 代r i l s 与两亲本的回交群体为材料， 进行了数量性状o t l 定位研究，结果认为。显性效应是杂种优势的主要遗传基础。y u 等( 1 9 9 7 ) 以我国生产上广泛应用的水稻优势组合油优6 3 ( 珍汕9 7 明恢6 3 ) 的f 2 3 群体为材料，经过2 2 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 年田问重复试验，利用分子标记对产量及其构成因子( 有效穗数，每穗粒数和千粒重) 的q t l 进行了检测，结果表明显性或超显性效应对实验群体的贡献都不大，而上位性对数量性状的遗传 和杂种优势的表达均起着重要作用。l i 等( 2 0 0 1 ) 对水稻的生物学产量和籽粒产量的q t l 研究 表明，大多数和自交衰退以及杂种优势相关的q t l 表现为上位性，9 0 对杂种优势有贡献的q t l 表现为超显性，因此认为上位性和超显性是水稻杂种优势的遗传学基础。l u o 等( 2 0 0 1 ) 对于水 稻产量构成三因素( 穗粒数、千粒重和单株产量) 的o t l 研究得出了相似的结论。h u a 等( 2 0 0 3 ) 采用永久f 2 群体对杂种优势位点的定位和效应分析表明，超显性、显性以及上位性效应都对杂种 优势有贡献。在小麦中，孙其信等( 1 9 9 7 ，1 9 9 8 ) 用w i c h i t a 和c h e y e n n e 之间的染色体代换系获 得只有3 a 或6 a 的单染色体杂合体，以及3 a 和6 a 两条染色体杂合体，研究了冬小麦部分遗传 杂合性与杂种优势表达的关系，发现0 t l 杂合时可表现出杂种优势，且随着杂合q t l 位点的增 加，杂种优势可进一步提高，从而认为超显性是小麦杂种优势的遗传基础。 定位与杂种优势有关的q t l ，进而探讨其互作方式与杂种优势的关系为显性假说、超显性假 说及上位性提供了证据。但需要回答的闯题是：上述q t l 的生物学功能是什么? 即如何影响由 微效多基因所决定的数量性状? 这也是解释杂种优势机理，并应用于实践的核心所在。为此，鲍 文奎先生提出的基因网络系统给我们有益的启发。 基因网络系统( 鲍文奎，1 9 9 0 ) 认为：杂种一代是由两个不同的基因群组合在一起形成的一 个新的网络系统，在这个新组建的网络系统内，等位基因成员处在最好的工作状态，使整个遗传 体系发挥最佳效率，从而实现杂种优势。迄今已定位了大量与杂种优势有关的q t l ，这些o i l 在杂种网络系统中属于结构基因还是调控基因，又如何影响由微效多基因所决定的数量性状? 对 此，t a s f l a r i s ( 1 9 9 5 ) 提出，这些q t l 所编码的蛋白应首先为调控蛋白( 如转录因子或接受蛋白) 。 因为调控蛋白能直接或间接对其它调控成分如生长因子施加影响，也能控制与复杂性状( 如产量和 杂种优势1 形成有关的一系列基因的表达。所以，调控蛋白有可能对杂种优势的形成起重要作用。 近来，对调控蛋白基因的表达与杂种优势关系的研究也支持这一观点( t a s f t a r i se ta 1 ，1 9 9 8 ；赵 相山。1 9 9 7 ) 。 综上所述，在杂交种的基因表达网络系统内，可能由于调控基因最先处于最优化组合状态， 才使得整个遗传体系得以发挥最佳功能。因此，杂合体与亲本白交系在基因表达和调控方面的研 究便成为探讨杂种优势形成的分子机理的突破口。 3 第二节杂种优势分子机理研究进展 以上研究或者从表现型水平或者从基因组( d n a ) 水平上分析杂种优势的产生机理。真核生 物细胞分化、生长和发育的全过程都取决于基因的表达调控，尤其是转录水平上的基因表达调控 影响或控制着许多生物学过程( 例如，细胞的分裂、物质代谢以及对于环境的反应) ，能在特定 时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现“预定”的，有序的，不可逆的分化和发育过程： 杂交种的全部基因都来自于其两个杂交亲本，从基因组组成上看，杂交种并没有任何超越其双亲 的新基因引入，杂种优势的产生应当与相关基因表达调控变化有关因此杂合体和亲本在基因 表达调控方面的研究成为进一步认识杂种优势机理的新突破口。 1 2 1 基因差异表达与杂种优势 1 2 i i 杂交种与亲本自交系之问的基因差异表达类型 早在6 0 年代，c h e r r y 等( 1 9 6 1 ) 就曾注意到玉米自交系和单交种之间总r n a 台成数量上存 在差异，后来的一些研究也发现了类似的结果( m i n oc ta 1 ，1 9 8 0 ，n e b i o l oe ta 1 ，1 9 8 3 ) 。基因表达 的差异可以通过2 种途径加以研究，一是分析基因表达产物，即每种蛋白质合成数量的差异；二 是直接分析基因的转录产物，即m r n a 合成数量的差异。 r o m a g n o l i 等( 1 9 9 0 ) 首先研究了基因表达与玉米杂种优势的关系，结果表明：从杂交种c d n a 文库中选出的三个在杂交种和亲本自交系中差异表达的克隆中，有一个克隆在f l 表达中介于双亲 之间，另外两个克隆在f l 的表达接近高效表达亲本。对于杂交种和亲本的p l o y ( a ) r n a 进行 离体翻译的结果显示，i ) 在杂交种和亲本自交系之间有i l 种多肽表现差异，其中6 种多肽在f 1 的表达超过双亲。有1 种多肽只在f 1 表达，说明杂交种具有更丰富的和特异表达的基因产物，且可 能与杂种优势形成有关；2 ) 有1 1 种多肽在f l 的表达与亲本之一相同，说明这些基因显性表达； 3 ) 2 种差异表达的多肤在f l 的表达介于双亲之间，呈共显性表达：4 ) 有1 种多肽只在一个亲本 中表达。而在f l 和另一个亲本中不表达。据此，他们认为杂种优势产生与杂交种中许多基因的差 异表达有关，因为有3 3 的差异表达产物在杂交种中更丰富或特异表达。 t s a f t a f i s 等( 1 9 9 5 ) 对2 个杂交种f l ( 1 个强优势杂交种f l 和1 个弱优势杂交种f 1 ) 及其3 个 亲本之间( 2 个父本和一个共同的母本) 基因差异表达进行了研究。发现3 5 种基因( 3 5 个探针 和r n a 杂交) 在杂交种中的平均转录水平高于亲本自交系，3 5 个基因的m r n a 含量平均值在强 优势杂交种f 1 中高于亲本也高于弱优势杂交种f l ，在强优势杂交种f 1 中表现超亲本表达的基 因数目明显多于弱优势杂交种f 1 。 应用m r n a 差异显示技术，程宁辉等( 1 9 9 6 ，1 9 9 7 ) 对玉米和水稻杂交种与亲本之间基因 表达差异进行了分析，发现杂交一代与亲本之间基因表达差异存在各种差异表达类型，；包括杂 种一代特异表达、杂种一代增强表达、杂种一代减弱表达和杂种一代表达沉默等。最近，我们实 验室( s u ne ta 1 ，2 0 0 4 ；倪中福，1 9 9 9 ) 以不同组织器官和发育时期的小麦为材料研究发现小 麦杂交种与亲本之间也发生了明显的基因表达改变，存在上述各种差异表达类型。 4 1 2 1 2 杂交种与亲本之间基因差异表达模式与杂种优势的关系 由以上分析可知，杂交种与亲本之间在基因表达上发生了明显的改变，需要进一步回答的问 题，这种表达变化是否与杂种优势有关? 为此，许多学者对杂交种与亲本之间的差异表达模式与 杂种优势表现的关系进行了探讨。 x i o n g 等( 1 9 9 8 ) 分析了一组水稻双列杂交组合中基因的差异表达与杂种优势的关系，发现 亲本特异表达与杂种优势正相关，而杂种特异表达与杂种优势呈负相关。 吴利民等( 2 0 0 1 ) 以- - 套4 x 5 的小麦双列杂交组合苗期叶片为材料，对m a d s o b o x 、g b f s 、 s e r t h r 蛋白激酶、e i f - 4 a 和a r f l 基因家族共五类家族基因的差异表达进行了初步分析。结果 表明4 个家族基因各种差异表达模式与8 个性状的杂种表现( f l 均值) 均不相关。但是，分析发 现有的家族基因中部分基因差异表达模式与部分性状的杂种优势里显著相关。就m a d s - b o x 家族 基因而言，穗长、小穗数、单株产量、单穗产量杂种优势均和杂种特异表达带型呈显著正相关。 而小穗数、千粒重、单穗产量杂种优势和双亲共沉默类型呈显著负相关。对于g - b o x 基因家族则 不同仅小穗数杂种优势和双亲共沉默类型呈显著负相关，其余则均不相关。对于e i f - 4 a 家族 基因，株高杂种优势和单亲表达一致性呈显著负相关，小穗数和单穗产量杂种优势均和双亲共沉 默类型呈显著负相关，单穗产量杂种优势还和单亲表达一致型成显著正相关。而蛋白激酶家族基 因的各种差异表达模式与性状杂种优势的相关分析均不显著。 王章奎等( 2 0 0 4 ) 系统测定了小麦杂交种与亲本的8 个根系性状表现，包括总根长、根表面 积、根尖数、平均直径、根体积、最长根长、根冠比和根千重。差异表达模式与8 个性状的杂种 优势相关性研究表明，双亲共沉默类型与根体积的中亲和超亲优势表现极显著的负相关：单亲表 达一致型与根干重和根体积的中亲和超亲优势表现极显著的负相关。 s u n 等( 2 0 0 4 ) 以两个时期叶片( 拔节期叶片和抽穗期旗叶) 为材料，分析了一套双列杂交 组合的2 0 个杂交种及其亲本之间的基因差异表达模式，并与9