（作物遗传育种专业论文）耐储藏水稻脂肪酶基因的遗传学分析及定位.pdf

图表索引 图l 酸败的类型8 图2 两亲本植株形态1 4 图3 两亲本种胚脂肪酸比色反应1 8 图4f ：种胚脂肪酸比色反应2 2 图5f ：群体脂肪酶活性基因型分离图2 l 图6 部分在两亲本间呈现多态性的引物2 2 图7r m 7 、r m 2 3 2 在亲本和基因池间的多态性2 3 图8r m 7 、r m 2 3 2 在基因池和定位群体单株问的表现2 4 图9 第3 染色体上，口基因的ssr 图谱25 图1 0 部分典型供试材料老化指数折线图2 8 图1 1 脂肪酸标准曲线4 0 图1 21 0 0b pd n al a d d e rm a r k e r3 a g a r o s e 电泳示意图4 6 表l 水稻种胚脂肪酶定量检测1 9 表2 亲本脂肪酶活力分析1 9 表3 部分供试材料脂肪酶活力分析2 0 表4f z 群体脂肪酶活性基因遗传学分析2 1 表5 部分典型供试材料脂肪酶活力和不同老化时间的发芽率2 6 表6 部分典型供试材料脂肪酶活力和不同老化时间的老化指数27 h i 附录索引 附录一水稻种胚脂肪酶酶活的精确定量测定4 0 l 脂肪酸比色法4 0 2 脂肪酸吸光度标准曲线的制定4 0 3 脂肪酶活力的定义与计算4 1 附录二水稻叶片d n a 提取方法( c t a b 法) 4 2 附录三p c r 反应体系与程序4 3 1p c r 反应体系( 1 0 ul ) 4 3 2p c r 反应程序4 3 附录四电泳及染色4 4 1 制胶“ 2 电泳4 4 3 染色4 4 附录五试剂及所需溶液配比4 5 l 总d n a 提取( c t a b 法) 4 5 2s s r 标记4 5 附录六双层滤纸卷纸法测发芽率4 7 l 实验步骤4 7 2 注意事项4 7 附录七实验所用s s r 引物序列及其在亲本间的多态性分析结果4 8 1 分布于1 2 条染色体上的1 3 6 对s s r 引物4 8 2 第3 染色体上的5 3 对s s r 引物5 1 i v 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：参女整章日期：矽叮5 引 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 鸯断 1 日期：碑r ；j 指导教师亲笔签名：彳盯彳t 步f日期：j 哆石 弘田一厶 福建农林大学硕士学位论文耐储藏水稻脂肪酶基因的遗传学分析及定位 摘要 水稻种胚的脂肪酶( l i p a s e ) 是稻谷储存性脂类水解氧化过程中第一个参与反应的酶， 其活性大小是导致稻谷储藏过程中陈化的主要原因之一，种胚脂肪酶活性低可以延缓稻谷的 陈化变质，提高水稻品种的耐储藏特性。本研究对两个供试材料p t 柚( 高脂肪酶活性) 和w ( 低脂肪酶活性) 及其f 2 群体，进行脂肪酶活性的定量测定和遗传学分析，并结合s s r 分子 标记。对控制脂肪酶活性的基因进行了初步定位，最后应用人工老化实验的方法对材料耐储 性进行评价。结果如下： 1 种胚脂肪酶酶活的精确定量测定与遗传学分析 运用脂肪酸比色法定量测定供试双亲及其r 群体种胚脂肪酶活性，经x2 测验，f ：群体基 因型分布符合1 ：2 ：1 的盂德尔分离比，表明脂肪酶活性高低是由一对单基因控制的，脂肪 酶活性低为隐性性状。 2 种胚低脂肪酶活性基因的定位 以f z 群体为定位群体，结合s s r 分子标记将低脂肪酶活性基因定位在水稻第3 染色体上， 与s s r 标记跏7 和1 珈2 3 2 之间的遗传距离分别为1 4 8 c m 和4 o c m ，暂命名为l l a ( 1 0 wl i p a s e a c t i v i t y ) 。 3 种胚脂肪酶活性与种子耐储性的相关性分析 采用人工老化的方法，以种子发芽率和老化指数评价琵亲本及其f z 群体的耐储藏特性， 结合所测定的脂肪酶活力数据进行相关性分析。结果表明，随着老化时间的延长，脂肪酶活 性高的材料，发芽率降低迅速，老化指数增加很快，而脂肪酶活性较低的材料，老化指数变 化相对较慢，即脂肪酶活性低的材料较耐储藏。经1 0 、2 0 天处理后的种子老化指数与种胚脂 肪酶活性的相关系数分别为r = o 6 1 6 5 # ，r = o 4 7 0 3 。，说明老化指数和脂肪酶活性呈显著正相 关。 关键词水稻；脂肪酶活力定量分析；遗传学分析；s s r ；基因定位；耐储性 塑壁奎苎盔兰堡主兰垡垒塞 壁笪堕查塑塑堕堕茎里竺丝堡兰坌堑墨塞垡 a b s t r a c t b e i n gt h ef i r s te n z y m ed u r i n gt h el i p i dh y d r o l y s i sa n do x i d a t i o n , l i p a s ew a so n eo ft h em a i n f a c t o rl e a d i n gt or i c ea g i n gd u r i n gr i c es t o r a g e t h el o wa c t i v i t yo fl i p a s ei nr i c ee m b r y o sw o u l d h e l pa l l e v i a t es e e d sa g i n ga n di m p r o v et h es t o r a g es t a b i l i t yo fr i c eb r e e d b a s e do nt w op a r e n t s p t 4 6w h i c hb e l o n g i n gt oh i g hi i p a s ea c t i v i t ya n dv q v p 2 0w h i c hb e l o n g i n gt ol o wl i p a s ea c t i v i t y , a n d t h e i rf 2p o p u l a t i o n , t h i sr e s e a r c hw a sc a r d e do u tb yt h ea c c u r a t ea n dg e n e t i ca n a l y s i so fl i p a s e a c t i v i t y m o r e o v e r , t h eg e n ef o rc o n t r o la c t i v i t yo fl i p a s ew a sm a p p e dw i t hs s rm a r k e r s f i n a l l y , t h e s i g n i f i c a n c e o fr i c es t o r a b i l i t yw a sa p p r a i s e dd u r i n ga r t i f i c i a l l ya c c e l e r a t i n ga g i n g e x p e r i m e n t s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 a c c u r a t e m e n s u r a t i o n a n d g e n e t i c a n a l y s i s o f l i p a s e a c t i v i t y o f r i c ee m b r y o s e m b r y o sl i p a s ea c t i v i t yo f t w op a r e n t sa n dt h e i rf 2p o p u l a t i o nw a sm e a s u r e dw i t hf a t t ya c i d c o l o f i m e t r ym e t h o d b a s e do nd a t ao ft h e i rl i p a s ea c t i v i t ya n dft e s t h e d i s t r i b u t i o no ff 2 g e n o t y p e sw a s1 ：2 ：la c c o r d i n gt om e n d e l i a nr u l e s 。d e m o n s t r a t e dt h a tt h ea c t i v i t yo f l i p a s ew a s c o n t r o l l e db yas i n g l eg e n ea n dt r a i to f l o wl i p a s ea c t i v i t yw a sa r e c e s s i v ew a i t 2 m a p p i n go f g e n ef o rl o wl i p a s ea c t i v i t yi nr i c ee m b r y o s w i t hf 2p o p u l a t i o nb e t w e e np 1 ka n dw p 2 0 ，t h eg e n eo fl o wl i p a s ea c t i v i t yw a sm a p p e di n t h e3 r dc h r o m o s o m eo f f i c eb yb u l k - s e g r e g a t i o na n a l y s i s f u r t h e r m o r e t h ed i s t a n c ew a s1 4 8c m 、 4 o c mw i t hm a r k e rr m 7 、r m 2 3 2 ，r e s p e c t i v e l y t h e r e f o r e ，t h i sg e n ew a st e m p o r a r i l yd e s i g n a t e d a s a ( 1 0 wl i p a s ea c t i v i t y ) 3 c o r r e l a t i o na n a l y s i sb e t w e e nl i p a s ea c t i v i t yi ne m b r y o sa n dd u r a b l es t o r a g e c h a r a c t e r i s t i c so fs e e 血 s t o r a b i l i t yo f t w op a r e n t sa n dt h e i rf 2p o p u l a t i o nw e r ea p p r a i s e dw i t ht h e i rg r e r m i n a t i o nr a t e a n da g i n gi n d e xb ya r t i f i c i a l l ya c c e l e r a t i n ga g i n ge x p e r i m e n t s c o r r e l a t i o na n a l y s i sw a sc o n d u c t e d c o m b i n i n ga g i n gi n d e xa n dd a t ao f t h e i rl i p a s ea c t i v i t y t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts e e dg e r m i n a t i o n r a t eo fh i g hl i p a s ea c t i v i t ym m e r i a i sw a sn o to n l yd e c r e a s e dr a p i d l yw i t hi n c r e a s i n go fa g i n g t i m e b l l ta l s ot h e i ra o n gi n d e xw a si m p r o v e dq u i c k l y b u tt h ea g i n gi n d e xo fl o wl i p a s ea c t i v i t y m a t e r i a l sw a sc h a n g e ds l o w l y ，n a m e l y , t h el o wl i p a s ea c t i v i t ym a t e r i a l sh a db e t t e rd u r a b l es t o r a g e c h a r a c t e r i s t i c s a f t e r1 0a n d2 0d a y sf o ra r t i f i c i a l l ya c c e l e r a t i n ga o n 舀t b ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t w e r er - - 0 6 1 6 5 “a n dr f f i o 4 7 0 3 ”b e t w e e nt h el i p a s ea c t i v i t ya n da g m gi n d e x , r e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t sd m o n s t r a t e dt h a ts t a b l ep o s i t i v ec o r r e l a t i o nw a sb e t ) r e e na g i n gi n d e xa n dt h el i p a s e k e y w o r d sr i c e ：a c c u r a t ea n a l y s i s o f l i p a s ea c t i v i t y ；s s r ：g e n e m a p p i n g ；s t o r a b i l i t y 2 福建农林大学硕士学位论文耐储藏水稻脂肪酶基因的遗传学分析及定位 前言 由于科技的进步和社会的相对稳定，人口急剧膨胀，导致食物消费总量的急剧上升，在 食物需求不断上升的同时，世界粮食种植面积却愈来愈受到限制，世界面临着严峻的粮食安 全问题。对发展中国家来说粮食已成为制约发展的重要战略资源，粮食安全作为战略问题， 是关系到国家政治稳定和经济发展的大事。长期以来，国家、地方粮食储备在以丰补歉、平 抑粮食价格等方面起了积极的作用，为我国社会稳定、经济发展和世界的和平做出了积极的 贡献。 水稻是我国最重要的粮食作物之一，对我国的经济发展和人民生活具有极其重要的意 义，稻谷即水稻的种子是主要的食用部分。我国是水稻生产古国和世界上最大的稻米生产国。 目前，在我国三大主要粮食作物( 水稻，小麦、玉米) 中，水稻不论是播种面积还是产量都 位居第一。我国水稻常年种植面积约3 0 0 0 万公顷，占全国谷物种植面积的3 0 ，世界水稻 种植面积的2 0 ；稻谷总产量近2 0 0 0 0 万吨，占全国粮食总产的4 0 ，世界稻谷总产的3 5 ；稻谷平均单产6 2 1 2 吨公顷，是单产最高的粮食作物。我国既是水稻生产大国又是稻 米消费大国，全国有6 0 以上人口以稻米为主食，水稻担当着我国粮食安全的第一重任，而 粮食储备又是其中重要的一环。因此稻谷的耐储藏特性是影响国家粮食储备能力的关键。 1 选育耐储藏水稻的意义 稻谷在一般储藏条件下第二年开始陈化变质，在高温高湿地区稻谷储藏发生陈化时间 则更短。随着储藏过程中温度和湿度的加大，陈化速度也会逐渐加快，严重影响稻米品质。 稻谷品质的下降，其商品性也随之降低，再加上霉变、仓储害虫危害等影响，严重威胁粮食 安全。同样，作为种质储存的水稻种子也因陈化等原因在储存过程中劣变，使种子生活力下 降，发芽力变差甚至丧失，这都给国家造成重大经济损失。 据农业部统计，每年因为陈化问题造成的损失占稻谷总产量的3 左右，占稻谷库存总 量的1 0 左右，每年损失粮食近5 0 亿千克。因此陈化稻谷，不论其食用价值还是种用价值 都显著下降，给国家造成大量的人力、物力损失。 国家储备粮一般采用分散分批、定期推陈储新、轮流更新的方法，虽然可以延缓稻米储 藏期间的陈化，可是这些方法都具有很大的局限性，需要消耗大量的能源和资料。同时由于 我国粮食生产以小农分户经营为主，每年我国生产的粮食约8 0 分散在农户中，其中稻谷 是农村储备的主要粮种，所以通过改善储藏条件，如修建气调库或低温库、选择合适的包装 材料和微波处理种子等( s h a r pe ta l ，1 9 8 6 ) ，不适宜中国这样一个以农户为单位进行储藏的 国家。 水稻种子的储藏特性虽然受种子发育、成熟、储藏条件以及种子加工等多重因素的影响， 但遗传因素是最根本的。利用水稻自身的遗传因素，从遗传上，从根本上解决稻谷陈化问题， 选育寿命长、抗老化、抗仓虫的耐储藏品种，筛选与水稻耐储藏相关的基因解决稻米陈化变 质问题，降低粮食储藏中的损失和减少人力物力的投入，是一条经济有效的途径，有着广阔 的前景，是一项利国利民的伟大事业。 3 福建农林大学硕士学位论文耐储藏水稻脂肪酶基因的遗传学分析及定位 2 水稻种胚脂肪酶 稻谷的陈化是其衰老的必然结果，它不仅与水稻自身品种、种子发育有关，还与环境 因素以及加工处理等因素的影响有关，是一种不可逆的生理过程。关于稻谷陈化变质原因的 说法现在比较认可的是脂质代谢理论。近年来的许多研究表明，稻谷储藏期间脂肪的降解是 导致其品质下降并产生陈味的主要原因之一，其中脂肪酶( 三酰甘油酯水解酶，l i p a s e ，e c 3 1 1 3 ) 是脂质降解的关键酶( f g o f f m a n ，2 0 0 3 ；y a s t u n a t s u ，1 9 6 4 ) ，它是脂质代谢中第 一个参与反应的酶，一般认为它对脂肪的转化速率起着调控的作用。脂肪酶活性高，水解产 生的游离脂肪酸就多，因而种子中游离脂肪酸的增加是一直伴随着种子陈化变质的。脂肪水 解产生的不饱和脂肪酸亚油酸和亚麻酸能促进下游脂肪氧化酶自我活化和膜脂过氧化作用， 产生醛、酮等挥发性物质和氢过氧化物，及其衍生物和自由基，这些物质，对蛋白质、膜结 构、细胞组织以及d n a 造成破坏，降低稻谷的储藏时间，加速稻谷老化。同时部分有害成分 还与营养成份结合，使稻米的食用和营养价值也大为降低。 水稻种胚脂肪酶活性低，可以明显地阻止脂肪的水解进而减缓脂质的过氧化作用，减 缓储藏粮食氧化变质的速度，保持清新气味，进而延缓稻谷的陈化，提高品种的耐储性。自 然老化和人工加速老化实验结果也证实，脂肪酶活性低可明显延缓稻谷衰老过程。因此，研 究脂肪酶在稻谷陈化和衰老中的作用机制意义深远，深入研究水稻种胚脂肪酶的遗传学特性 和分子机制，对水稻耐储性的开发和耐储藏水稻新品种的选育具有重要的理论和实践意义。 2 i 脂肪酶研究进展 2 1 _ 1 脂肪酶简介 脂肪酶( 三酰甘油酯水解酶，l i p a s e s ，e c ，3 1 i 3 ) 广泛存在于植物、动物和微生物 中，是最早被研究的酶类之一。脂肪酶具有水解和合成脂肪的双重特性，底物包括天然油脂、 合成的三酰甘油酯以及脂肪酸酯。自1 8 3 4 年兔胰脂肪酶的活性报道至今，有关脂肪酶的研 究已有了上百年的历史；在1 8 5 4 年报道了胃脂肪酶活性：1 8 7 1 年报道植物种子脂肪酶；而 微生物脂肪酶则是在上世纪初才发现。动物和微生物脂肪酶的研究较细致，许多脂肪酶的非 亲水性已被用于合成医药。不同的脂肪酶具有不同的底物和位点特异性，广泛应用于食品、 化学、医药、化妆品、皮革和清洁剂等工业领域。目前脂肪酶已成为重要的工业用酶之一。 植物脂肪酶的研究及其应用相对而言有些滞后。 有关脂肪酶较确切的定义则是在2 0 世纪7 0 年代由b r o c k e r h o f f 等首先提出的，他将能 水解长链脂肪酸酯或水解油酸酯类的酶类定义为脂肪酶。由于发现该定义易引起脂肪酶和酯 酶的混淆，h u a n g 等( 1 9 8 4 ) 随即将定义修改为一类能催化特殊类型的酯键即三酰甘油酯的 酯键水解的酶：或者从催化作用的可逆性考虑将脂肪酶定义为与高级脂肪酸和丙三醇所形成 的三酰甘油酯的合成、转酯和分解有关的酶类；简而言之，脂肪酶是催化油酯水解的一类酶 的总称。 4 福建农林大学硕士学位论文耐储藏水稻脂肪酶基因的遗传学分析及定位 2 1 2 脂肪酶的酶学特性 脂肪酶是分解三酰甘油酯( t r i g l y c e r i d e ，t g ) 的水解酶类，被水解底物三酰甘油酯 的醇部分是丙三醇，酸部分为水不溶的1 2 碳以上的长链饱和或不饱和脂肪酸，水解反应发 生的部位是三酰甘油酯的酯键。其催化反应如下： 脂肪酶 三酰甘油酯+ 水二酰甘油酯+ 脂肪酸 其中的二酰甘油酯可被进一步水解为一酰甘油酯、甘油和游离脂肪酸。脂肪酶的一个最显著 的特点是它不同于其它多数水解酶的催化特性，即它催化的水解反应是一种非均相体系，水 溶性的酶在底物( 水不溶性) 和水的界面上催化底物反应，对水溶性底物不起催化作用。这种 界面上的催化作用机制仍不甚清楚，不能简单用m i c h a e l i s - m e n t e n 学说解释酶与底物间的反 应机制。y a h y a ( 1 9 9 8 ) 提出t h e 肪酶在油一水界面上定位的假设，提出了“超底物”的模型， 该模型能解释脂肪酶的一些行为，但还需要进一步的实验证明和修正。此外，脂肪酶兼具有 逆向催化甘油和游离脂肪酸合成甘油脂的活性。 脂肪酶根据脂肪酸碳链长度和作用的甘油羟基位点，即其底物专一性可分为三类：非专 一性脂肪酶、l ，3 一专一性脂肪酶、脂肪酸专一性脂肪酶。不同来源脂肪酶可催化同一反应， 但在相同反应条件下，催化效率不同。脂肪酶的底物专一性取决于酶分子结构，特别是酶活 性中心的结构。因此酶的来源不同，其结构差异使酶的底物专一性也不同。其底物专一性表 现在： ( 1 ) 脂肪酸专一性：是指酶对不同碳链长度和饱和度的脂肪酸表现出特殊反应性。不同来源 的脂肪酶水解甘油三酯的脂肪酸专一性有很大差异。这些酶对底物中不饱和脂肪酸的双键位 置也呈现不同反应的特性。 ( 2 ) 位置专一性：是指酶对底物甘油三酯中s ，一( 或3 ) 和s ，z 位酯键的识别和水解的反应特性。 ( 3 ) 立体专一性：一般是指酶对底物甘油三酯中立体对应结构的l 位和3 位酯键识别和选择性 水解。在有机相中酶促合成和酯交换时，酶对底物不同立体结构也表现出立体专一性。 脂肪酶还具有较高的稳定性。在非水系统内脂肪酶的稳定性提高，如果酶结合的水被除 去或被易于与水混溶的有机溶剂稀释，则酶一般会失去活性。但在不发生失活的条件下，只 要有微量的水及与之有关水的活度降低，就会大大降低酶热失活的速度。 绝大多数油料种子脂肪酶和一些真菌脂肪酶倾向于水解短链三酰甘油酯，因为脂肪酶反 应的重要特征是异相系统反应，即在油一水的界面上作用。短链脂肪酸由于具有较高的水溶 性，对三酰甘油酯乳液的脂相抑制效果较轻，而长链脂肪酸的倾脂性会抑制三酰甘油酯乳液 的脂相。从已知结构的几种脂肪酶来看，分子量在2 0 ，0 0 0 6 0 ，0 0 0 之间，脂肪酶作用在体 系的亲水一疏水界面层，这是区别于酯酶的一个特征。脂肪酶的催化部位含有亲核催化三联 体( s e r - h i s - a s p ) 或( s e r - h i s - g l u ) ，催化部位被埋在分子中，表面被相对疏水的氨基酸残基 形成的螺旋盖状结构覆盖，对三联体催化部位起保护作用。界面活化现象可提高催化部位附 近的疏水性，导致。螺旋再定向，从而暴露出催化部位；界面的存在，还可以使酶形成不完 福建农林大学硕士学位论文耐储藏水稻脂肪酶基因的遗传学分析及定位 全的水化层，这有利于疏水性底物的脂肪族侧链折叠到酶分子表面，使酶催化易于进行。 综上所述，脂肪酶可催化酯化、转酯、酯交换、对映体拆分等化学反应，具有化学选择 性和高度立体异构专一性，且具有较高稳定性和抑制水参与的副反应；反应的同时不需要辅 酶，反应条件温和，副产物少，只能在异相系统( 即油一水界面) 或有机相中进行；同时酶本 身不溶于有机溶剂，易于回收和利用，反应完毕后产物的分离纯化也较容易；尤其是它的立 体选择性催化特性，可完成用化学法难以进行的消旋化合物分离，不对称合成等。脂肪酶的 这些特性，使这一古老酶种有着崭新而广阔的发展前景。 2 1 3 脂肪酶活力检测方法 酶解反应通常比较复杂，容易受到多种因素的影响，如反应底物的种类及形态、稳定时 间、反应体系的酸度、温度等，因此反应一般不十分稳定，这些都决定了脂肪酶活力检测时 误差比较大因为脂肪酶这种独特的催化特性，使其活力测定具有以下特点：( 1 ) 方法的多 样性；( 2 ) 测量过程影响因素的复杂性；( 3 ) 酶活力定义的混乱性。 检测脂肪酶活力的方法有很多种，所使用的底物也很多，脂肪酶活力测定的方法按其检 测原理主要可分三类：( 1 ) 通过测定底物的减少来度量酶活的大小；( 2 ) 测定产物是否增加来 判断酶活的大小；( 3 ) 其他方法，如免疫学方法、荧光测定和电子传导等。人们一般根据不 同的目的选择合适的底物和方法。所以脂肪酶检测方法根据不同的底物又可分为两种：( 1 ) 以三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯和橄榄油作为测活底物时，通过检测反应释放的脂肪酸或甘 油来检测酶活力，因为脂肪酶酶活大小与其催化水解生成的脂肪酸或甘油的物质量成正比， 一般可利用比色反应或酸碱滴定等方法鉴定脂肪酶反应体系生成的脂肪酸量的多少；( 2 ) 用 乙酸对硝基苯酚酯和辛酸对硝基苯酚酯作为测活底物时，利用水解产生的具有颜色的对硝基 苯酚检测酶活力。但辛酸对硝基苯酚酯自水解的速度比较快，误差较大；乙酸对硝基苯酚酯 作为底物，自水解的速度比较缓慢，实验误差较小，所以实际操作中一般以它检测的活力作 为酶活力。 然而脂肪酶活力检测到目前为止还没有一种统一的检测手段，各生产厂家和科研部门通 常根据自己的实验条件和实际情况以及各自所制备脂肪酶的特性来制定出各自的产品检测 方法。但是确保活力检测的精确性和可比性十分重要，因为在利用脂肪酶进行科学实验和工 业生产中，其活力是一个非常重要的指标，具有很重要的参考价值。另外尽管有采用相同的 检测手段，但是由于检测活力数据的不稳定性，也常给科学实验和生产应用带来很大的不便。 吴跃进、张瑛等( 2 0 0 5 ) 在对几种常用的脂肪酶活力检测的方法进行了比较和研究之后，认 为采用以橄榄油作为反应底物，利用正确的乳化方法和检测手段( 脂肪酸和铜离子形成铜皂 在7 1 5 r i m 附近测定吸光度从而进行脂肪酶活力检测) ，不但可以获得较为稳定的脂肪酶活力 数据，而且条件简单，容易操作，可以推广。解决了少量样本脂肪酶精确定量，定性检测的 技术瓶颈。 6 福建农林大学硕士学位论文耐储藏水稻脂肪酶基因的遗传学分析及定位 2 l4 植物脂肪酶的研究进展 植物中的脂肪酶广泛存在于油料种子和谷物种子中，在燕麦、油菜、蓖麻、花生、亚麻、 大豆、稻谷、小麦、肉桂、木瓜、白胡椒和土豆中、桐油都有报道。植物脂肪酶的应用相对 来说要比动物和微生物脂肪酶来的落后，但是植物脂肪酶具有动物脂肪酶和微生物脂肪酶所 没有的可得性、低成本、易纯化及底物特异性。过去，脂肪酶的研究较多的在种子萌发的过 程中，储藏千种子中的脂肪酶研究一直鲜有报道，这可能与干种子中脂肪酶的检测难度有关。 不同植物的脂肪酶存在的位置是不同的，蓖麻种子脂肪酶附着在脂体的膜上，油菜种子脂肪 酶存在于脂质体中，稻谷中含有的脂肪酶以种皮、种胚及糊粉层中最多，而有研究表明在油 菜苗的不含脂肪的组织里也检测到了脂肪酶的存在( a n d r e a s ，1 9 9 6 ) 。 油料种子脂肪酶对种子脂肪尤其具有特异性，不同的油料种子脂肪酶具有不同的脂解作 用，v e r n o n i ag a l a m e n s i s 脂肪酶专一作用于巴比妥酸( i n c u b e ，1 9 9 5 ) ，c u p h e a 脂肪酶专 一作用于癸酸( s a h e l l y e r ，1 9 9 9 ) 。玉米、蓖麻子、油菜籽等植物种子的脂肪酶分别对三癸 酸和三亚麻酸甘油酯、三蓖麻醇酸甘油酯、廿二碳酸甘油酯有很高的水解活力( 李香春， 2 0 0 3 ) 。小麦胚脂肪酶和非洲豆脂肪酶主要作用于短链三酰甘油酯如三乙酸甘油酯或三丁酸 甘油酯。油菜种子脂肪酶对顺4 一和顺6 一不饱和脂肪酸没有活性( 娩j h i l l s ，1 9 9 0 ) 。燕麦种 子脂肪酶没有位置特异性，可水解初级和二级酯，释放油酸、反油酸、亚油酸、亚麻酸，而 与其催化特性相近的c a n d i d u m 脂肪酶却不能水解反油酸甘油酯。不同的植物脂肪酶还具有 不同的最适反应条件，例如蓖麻种子脂肪酶最适d h = 4 1 。 2 2 脂肪酶与水稻品种耐储性的关系 稻谷中脂类含量约为2 3 ，主要分布在稻谷的种胚、糊粉层和种皮中，是稻谷的重 要营养物质之一，且与维生素a 、d 、e 、f 、k 等共存，是其能量的主要存在形式。稻谷中含 有不同的脂肪酶同工酶，f u n a t s u ( 1 9 7 6 ) 首次从米糠中提取出脂肪酶粗酶，命名为 l i p a s e s - 1 ，后来s h a s t r y 等从该粗酶中又分离纯化出一种新的脂肪酶，称为l i p a s e s - 2 。 稻谷脂肪酶在1 2 1 5 的稻谷含水量时，最适温度3 5 4 0 ，最适p h t 8 ，具有位点专一 性，专门水解1 ，3 一位三酰甘油酯( 1 b ) 。 稻谷脂肪受稻谷的储藏影响。稻谷在氧气及高温条件下储藏以后，可引起脂肪酶与脂质 的直接接触，导致稻谷脂肪极易发生水解而后氧化，致使稻谷品质劣变。稻谷脂类的变化被 认为是导致稻谷陈化的最主要因素。这一过程首先需要脂肪酶的参与，因为它是脂肪分解代 谢中第一个参与反应的酶，也是稻米脂质降解过程中的第一限速酶。水稻种胚脂肪酶活力的 降低乃至丧失，能有效延缓储藏期间稻米中脂质、蛋白质、淀粉及维生素等主要成分的生理 变化，进而减缓稻米的陈化，提高品种的耐储性。 2 2 1 储存种子中脂肪的变化形式 脂肪即中性脂肪，是由1 分子甘油和3 分子脂肪酸脱水所形成的酯类化合物，又称甘油 三酯。甘油三酯是种子中的主要脂肪储存形式，也是能量的主要存在形式，可为种子发芽提 7 福建农林大学硕士学位论文耐储藏水稻脂肪酶基因的遗传学分析及定位 供能量和合成前体。作为高度还原的化合物，l g 油脂在体内完全氧化将产生3 7 k j ( 9 k c a l ) 的热量，远远大于l g 糖或蛋白质所产生的热量。脂肪酶是脂肪分解代谢中第一个参与反应 的酶，甘油脂类在脂肪酶作用下，水解释放出游离脂肪酸。稻谷的脂肪酸主要由亚油酸、亚 麻酸、油酸、软脂酸、硬脂酸和十四烷酸组成，其中亚油酸占5 0 9 6 左右。 粮食中油脂、脂肪酸在储存期间的变化途径有两种：一种氧化作用，油脂被氧化产生过 氧化物，不饱和脂肪酸被氧化产生羰基化合物，主要为醛、酮类物质。另一种是水解作用， 油脂受脂肪酶水解产生甘油与脂肪酸。正常水分的谷物两种解脂作用可以交替或同时发生 随着稻谷的储藏，脂肪分解，虽然其含量很低，但由于脂肪是高能量物质，比蛋白质、淀粉 具有更高的能量，呼吸作用中能散发出大量的热量，使稻谷粮堆发热，真菌滋生，加速老化。 同时稻谷在储藏过程中，游离脂肪酸含量增加，脂肪酸组成发生变化，脂肪酸进一步氧化分 解，使稻谷出现酸败，散发出哈喇味的陈米臭味，严重影响了稻谷的食用品质和营养品质； 还会使作为种质保存的种子发生老化，活力下降，影响起发芽率和苗期长势。 2 2 2 脂肪酶对稻谷储藏的影响 完整的稻谷中，脂肪酶位于内种皮，而脂肪位于糊粉层和胚中。在加工和储藏过程中， 这种物理分离被打破，脂肪酶与中性脂肪发生接触，导致三酰甘油酯( t g ) 水解产生游离脂肪 酸，尤其是亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸以及甘油，脂肪酸的进一步降解会产生一些小分 子物质，这一过程称为脂类酸败。脂类酸败使稻谷p h 降低，品质劣变，随着储藏温度升高， 水解和氧化加强，酸败加剧。图l 表明了酸败的类型。 酸败 氧化水解( 脂肪酶) 酶促氧化( l o x )非酶促氧化( 自动氧化) 图i 酸败的类型 f ig it y p e so fr a n c i d i t y ( b a r n e sa n dg a l l i a r d ，1 9 9 1 ) 稻谷中脂肪的水解造成的影响主要表现在以下几个方面：陈米臭、酸度增加，p h 降低， 脂肪酸易于氧化。储藏期间脂肪酸中的游离脂肪酸( f r e ef a t t ya c i d s 。f f a ) 还会发生累积 ( y a s u m a t s ue ta l ，1 9 6 4 ) 。f f a 中包括油酸( 3 6 3 8 ) ，亚油酸( 3 7 4 0 ) ，软脂酸( 1 7 2 0 ) ， 还有少量的硬脂酸和亚麻酸( 1 3 ) ，其中油酸、亚油酸、软脂酸属于不饱和脂肪酸( 周宝兰 等，1 9 8 5 刘保国，1 9 9 2 ；张向民等，1 9 8 7 ) 。储藏期问f f a 量的累积主要来自油酸和软脂酸 成分的增加，相反亚油酸和亚麻酸的成分则会减少( a i b a r ae ta l ，1 9 8 6 ；t a i r ae t a l 1 9 8 8 ； c h o u d h u r ye ta l ，1 9 8 0 ) 。游离脂肪酸进一步降解( 氧化酸败) ，不饱和脂肪酸亚油酸和亚麻 酸能促进下游脂肪氧化酶自我活化和膜脂过氧化作用，生成脂氢过氧化物，后者则再被脂氢 8 福建农林大学硕士学位论文耐储藏水稻脂肪酶基因的遗传学分析及定位 过氧化物裂解酶( h p l s ) 和脂氢过氧化物异构酶( h p i s ) 降解或自动氧化为具有挥发性的己醛、 戊醛、戊醇等碳基类低分子化合物和氢过氧化物，及其衍生物和自由基，散发出难闻的味道， 另一方面，由于产生的脂氢过氧化物、活性氧和自由基等具有高度的氧化活性，因此还可能 直接参与稻谷中的储藏蛋白等大分子的分子内和分子间二硫键氧化交联，影响它们的结构和 功能，同时也可能与氨基酸和维生素相结合，降低稻谷的食用和营养价值( 张向民等，1 9 9 8 ) 。 稻谷中有多种脂肪酶，包括磷酯酶、甘油酯酶和酯酶，分子量4 0l 【d ，最适p h 7 5 8 0 ， 最适温度3 7 ，作用于脂肪酸酯的1 ，3 一位点。磷酯酶包括作用于酯部分的磷酯酶a - 、磷酯 酶a 2 、磷酯酶b 和作用于磷酸部分的磷酯酶c 和磷酯酶d 。三酰甘油酯( t g ) 作为稻谷脂肪的 主要成分，以脂小体形式存在。t a k a n o ( 1 9 9 3 ) 提出以下脂肪酶作用下的脂肪降解机制：磷酯 酶d 分解脂小体膜的主要成分磷酸胆碱，脂小体丧失完整性，三酰甘油酯( t g ) 暴露并降解， 游离脂肪酸增加。产生的游离不饱和脂肪酸特别是亚油酸，极易在脂肪氧化酶的催化下氧化， 当游离脂肪酸含量超出5 以后，稻米品质发生劣变。 2 2 3 降低脂肪酶活性，解决米糠稳定化的方法 a i z o n o ( 1 9 7 1 ，1 9 7 6 ) 认为环境p h 的增加或降低会减弱脂肪酶活性，脂肪酶在天然状态 下的p h 为4 5 ，米糠的p h 必须低于4 0 来降低脂肪酶活性，即使在p h = 4 0 时，经过5 l 天 的储藏，游离脂肪酸仍然增加3 o 9 3 。脂肪酶是具有催化能力的蛋白质，利用蛋白质 的变性作用可以有效地抑制和钝化脂肪酶的活性，热灭活脂肪酶能有效减轻游离脂肪酸的增 加和氧化酸败。热处理抑制了脂肪酶活性或者使脂肪酶永久变性。 目前，国内外降低或消灭脂肪酶措施和方法大体都基于这一原理，主要分为物理法和化 学法。物理法利用高温使脂肪酶蛋白发生热变性使其活性逐渐丧失，有加热钝化法、微波钝 化法和电解质加热钝化法或者利用低温一1 6 一1 8 冷冻法。化学处理法就是向米糠中添加化 学试剂以改变脂肪酶的最适p h 值和最佳离子强度以达到钝化脂肪酶的目的。 h o f f p a u i r ( 1 9 4 7 ) 的研究表明快速灭活脂肪酶能控制游离脂肪酸含量低于5 ，高贵等 ( 2 0 0 2 ) 的实验也证实改变p h 值，使用乙醇蒸汽和湿热处理能灭活米糠脂肪酶，提高米糠 保存期。 然而上述方法一般都只是应用在米糠上，不能应用在有活力的稻种和需食用的稻米上。 而且有文献报道，稻胚中脂肪酶活最高而非米糠。由于稻谷的耐储藏特性是由其基因型决定 的，所以说遗传因素是最根本的，因此从水稻品种自身种胚的脂肪酶活性出发，选育脂肪酶 活性低的水稻品种，筛选与水稻脂肪酶活力有关的基因，应用基因工程的方法来达到降低脂 肪酶活力的目的，进而解决稻谷陈化变质问题无疑是一条更为经济有效的途径。 2 2 4 水稻脂肪酶耐储藏研究进展 长期以来，水稻等作物种子脂类与陈化的研究始终受到人们的关注，但是脂肪酶的作用 一直未得到重视。水稻脂肪酶的研究也仅仅局限于米糠稳定化和大米风味营养的问题。美国 路易斯安那州f a t e m e hme t ，a l ( 2 0 0 0 ) 研究指出：脂肪酶是米糠脂肪水解氧化的关键酶， 9 福建农林大学硕士学位论文 耐储藏水稻脂肪酶基因的遗传学分析及定位 其结果使得米糠的酸度增加和p h 值的降低。叶霞等( 2 0 0 4 ) 的研究也表明：稻谷中，游离 脂肪酸含量的增长速率与脂肪酶相对活力成正相关。 目前关于水稻脂肪酶在种子脂肪代谢中的作用机制等研究国内外鲜有报道。究其原因 主要是水稻种子脂肪酶含量和活性很低，缺少一种精确，灵敏的检测方法。吴跃进等( 2 0 0 5 ) 发明了种子脂肪酶定性检测的方法，解决了少量样品种子脂肪酶活性定性检测的问题，但仍 不能满足对品种闻个体和单株材料脂肪酶活性的差异筛选的需要。吴跃进等利用该项检测技 术在i r r i 、云南、贵州等水稻种质中筛选出一个脂肪酶活性较低的种质皖鉴2 0 9 0 ，该品种 在自然老化条件下储藏2 年以上发芽率仍高达9 8 5 。通过杂交、回交、组培以及生物技 术诱变对皖鉴2 0 9 0 进行改良，获得了脂肪酶活性较低且农艺性状较好的水稻新品系。 关于脂肪酶的分子研究在动物、微生物中较为广泛和深入。水稻的l i p a s e 基因研究报 道极少，相对水稻拟南芥l i p a s e 基因的研究要深入的多。k i m ，y o u n g h e e ( 2 0 0 1 ) 从水稻包括 米糠层的种皮c d n a 文库( o r y z as a t i v ac v d o n g j i n ) 中分离出一种编码脂肪酶的c d n a ，该 被克隆的脂肪酶c d n a 长1 4 6 9 b p ，编码3 6 1 个氨基酸残基。该序列与哺乳动物和微生物的 l i p a s e 序列没有广泛的同源性，但一些包括水稻和拟南芥l i p a s e 基因在内的植物l i p a s e 被发现与该基因相关，所推导的核苷酸序列水稻和拟南芥分别表现7 8 和5 2 的同源性。 s o u t h e r n 杂交结果表明：米糠脂肪酶基因为一单拷贝基因。通过s d s p a g e 电泳表明：米糠 脂肪酶d n a 分子量为4 1 k d 。王玉娟等( 2 0 0 6 ) 的研究从脂肪酶活性高低的近等基因系中选 取一对脂肪酶活性高低的材料进行r a p d 标记筛选出两条在脂肪酶活性低的品种中稳定地显 示特异多态性的引物s 1 3 0 2 、s 1 3 8 0 。对这两条多态性片段进行网收、克隆和测序，其中s c a r m 被成功地转化为s c a r 标记，为进一步的分子标记辅助选择和染色体步移克隆打下基础。 为了能深入研究水稻种胚脂肪酶的遗传特性和分子机制，需要一种大规模少样品的种胚 脂肪酶精确定量分析技术，并对水稻种胚脂肪酶进行更多类型标记的筛选如s s r 、a f l p 、r f l p 等，确定紧密连锁的分子标记，进一步定位与克隆脂肪酶活性基因。通过将传统检测与生物 工程技术开发新的检测耐储藏品种的新方法结合起来，相互