（免疫学专业论文）atf4增强肝细胞癌对化疗药物的耐受性.pdf

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1 、a n n e x i n 帅i 染色和谷胱甘肽定量技术来分析a t f 4 在肝细胞癌耐药中的作用以及下游机制。最后，我们使用t u n e l 分析来检测a t f 4 在肝癌异种移植模型中对顺铂耐受性的作用。结果：我们发现在肝癌组织中有5 0 7 的标本为a t f 4 高表达。体外和体内实验都表明，a t f 4 基因沉默后，顺铂的细胞毒作用会明显升高。与此相一致的是，在肝癌细胞系中过表达a t f 4 ，肝癌细胞对顺铂的耐受性明显增强。另外，我们在沉默a t f 4 的肝癌细胞系中发现具有解毒作用的谷胱甘肽的合成明显减少。结论：我们的实验证明a t f 4 可以增强肝细胞癌对顺铂的耐受性，从而为a t f 4 可能成为肝癌治疗的潜在的分子靶点提供理论依据。关键词：a t f 4 肝细胞癌化疗顺铂a b s t r a c ta b s t r a c tb a c k g r o u n d ：a c t i v a t i n gt r a n s c r i p t i o nf a c t o r4 ( a t f 4 ) am e m b e ro ft h ea t f c r e bt r a n s c r i p t i o nf a c t o rf a m i l y , i so v e r e x p r e s s e di nv a r i o u st u m o rt i s s u e s i nr e c e n ty e a r s ，r e s e a r c h e sh a ds h o w nt h a ta t f 4w a su p r e g u l a t e da n di n d u c e db yt u m o rm i c r o e n v i r o n m e n t a lf a c t o r s ，s u c ha sa n o x i cs t r e s sa n de n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s ，a n da t f 4i n f l u e n c e dt h ep r o c e s s e so ft u m o rg r o w t h ，m e t a s t a s i sa n dd r u gr e s i s t a n c e h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ( h c c ) ，w i t hh i g hm o r t a l i t y , i st h ef i f t hm o s tm a l i g n a n tt u m o ri nw o r l d w i d ea n dd i f f i c u l tt oc u r e c u r r e n t l y , t h em a j o rt r e a t m e n tf o rh c ci sh e p a t e c t o m ya n dc h e m o t h e r a p ya n dh c cs h o w sah i g h e rr e s i s t a n c et oc h e m o t h e r a p y s ot oi d e n t i f yt h em o l e c u l eu s e df o rt a r g e t i n gt h e r a p i e sw i l lg r e a t e l yb e n e f i t et oc l i n i c a lp r a c t i c e o b j e c t i v e s ：t h ee f f e c t so fa t f 4o nd r u gr e s i s t a n c ei nh c ca r es t i l lu n k n o w n ,s ow ea s s u m et h a ta t f 4m a yb eap o t e n t i a lt h e r a p e u t i ct a r g e ti nh c ct r e a t m e n t w ec a nu s er n ai n t e r f e r e n c eb o t hi nv i t r oa n di nv i v oa n da t f 4o v e r e x p r e s s i o nt e c h n o l o g yt os t u d yt h ee f f e c to f a t f 4o nt h ec i s p l a t i nr e s i s t a n c ei nh c c m a t e r i a l sa n dm e t h o d s ：f i r s t l y , t h i se x p e r i m e n tu s e di r m n u n o h i s t o c h e m i s t r yt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fa t f 4i n6 7h c ct i s s u e sa n d10n o r m a ls a m p l e sf r o mt h et i s s u em i c r o a r r a y s e c o n d l y w es e tu pt h eo v e r e x p r e s s i o na n ds l i e n c eo fa t f 4s t a b l ec e l ll i n e s ，a n dt e s t e dt h ec i s p l a t i nc y t o t o x i c i t ya n dc i s p l a t i n i n d u c e da p o p t o s i so ft h e s ec e l ll i n e sb yw s t la n df l o wc y t o m e t r y w ef u r t h e ri n v e s t i g a t e dt h eb i o s y n t h e s i so fg l u t a t h i o n ei nt h ea t f 4k n o c k d o w nc e l l s f i n a l l y ，w ed e t e c t e dt h er o l eo fa t f 4o nc h e m o r e s i s t a n c et oc i s p l a t i ni nh c cx e n o g r a f it r a n s p l a n t a t i o nm o d e l sb yu s i n gt h et u n e la s s a y 。r e s u l t s ：w ef o u n dt h a ta t f 4w a so v e r e x p r e s s e di na b o u t5 0 7 p e r c e n th c ct i s s u e s k n o c k d o w no fa t f 4i n c r e a s e dt h ec i s p l a t i nc y t o t o x i c i t yi ni nv i t r oa n di nv i v oh c cm o d e l s ，w h i l eo v e r e x p r e s s i o no ft h i sm o l e c u l es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dt h es e n s i t i v i t yo fh c cc e l ll i n e st oc i s p l a t i n i na d d i t i o n , w ef o u n dt h a tt h es y n t h e s i so fg l u t a t h i o n er e d u c e di nk n o c k d o w no f a t f 4h c cc e l l s c o n c l u s i o n s ：w ed e m o n s t r a t e dt h a ta t f 4c a ni n c r e a s ec i s p l a t i nr e s i s t a n c eo fi ia b s t r a c th u m a nh c c ，a n di tm a y b eap r o m i s i n gp r o t e i nt a r g e tf o ra n t i h c cd r u gd e v e l o p i n g k e yw o r d s ：a t f 4 ，h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ，c h e m o t h e r a p y , c i s p l a t i ni i i目录目录第一章引言1第一节活化转录因子4 ( a t f 4 ) 的研究背景11 1 1a t f 4 的发现及命名l1 1 2a t f 4 的结构21 1 3a t f 4 的生物合成3第二节a t f 4 的生物学功能41 2 1a t f 4 在基因转录中的调节作用41 2 2a t f 4 在各种应激中的调节作用41 2 3a t f 4 的转基因学研究5第三节a t f 4 在肿瘤中的研究概况51 3 1a t f 4 与肿瘤的生长、浸润与转移的关系61 3 2a t f 4 与肿瘤凋亡的关系61 3 3a t f 4 在肿瘤化疗中的作用7第四节我们的实验71 4 1 本实验的目的与意义71 4 2 主要实验方法81 4 3 实验思路8第二章实验材料与仪器1o第一节实验材料1 02 1 1 实验细胞。l o2 1 2 试剂及其来源1 02 1 3 常用的试剂配方1o第二节主要仪器1 l第三章实验方法13第一节细胞培养1 33 1 1 细胞复苏1 33 1 2 细胞传代。1 33 1 3 细胞冻存1 3第二节a t f 4 过表达和基因沉默质粒的构建1 4t v目录3 2 1p c d n a 3 1 ( - ) - a t f 4 质粒的构建。1 43 2 2p s i n g l e t t s - a n t i - a t f 4 质粒的构建1 83 2 3 提取( 小提中量) 质粒。1 9第三节a t f 4 过表达和基因沉默稳定细胞系的建立2 03 3 1 质粒转染一2 03 3 2 加g 4 1 8 筛选阳性细胞2 1第四节免疫印迹的方法检测蛋白的表达2 l第五节流式细胞术检测蛋白表达2 4第七节免疫组织化学2 5第八节w s t - 1 检测顺铂对a t f 4 过表达和基因沉默细胞系的细胞毒作用2 73 8 1 梯度浓度的化疗药物顺铂刺激肝癌细胞。2 73 8 2w s t - 1 的测定2 7第九节流式细胞术对细胞凋亡的检测2 83 9 1 特定浓度的化疗药物顺铂刺激肝癌细胞。2 83 9 2 使用a n n e x i nv - f i t c 细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡情况2 8第十节n o d s c i d 小鼠异种移植肝癌以及化疗模型的建立2 8第十一节原位末端凋亡法检测n o d s c i d 小鼠肿瘤组织的凋亡情况2 93 1 1 1 获取肿瘤组织切片2 93 11 2 原位末端凋亡法检测分析3 0第十二节统计学处理3l第四章结果与分析3 3第一节a t f 4 蛋白的检测3 34 1 1 检测a t f 4 蛋白在人肝细胞癌组织芯片的表达3 34 1 2 检测a t f 4 蛋白在人肝癌细胞系中的表达3 4第二节a t f 4 过表达和基因敲除质粒的构建3 54 2 1p c d n a 3 1 ( ) a t f 4 质粒的构建3 54 2 2p s i n g l e t t s a n t i - a t f 4 质粒的构建3 6第三节a t f 4 过表达和基因敲除肝癌稳定细胞系的建立。3 74 3 1a t f 4 过表达的肝癌稳定细胞系的建立3 74 3 2a t f 4 基因敲除的肝癌稳定细胞系的建立：3 7v目录第四节过表达a t f 4 对顺铂在肝癌细胞系中作用的影响3 84 4 1 过表达a t f 4 减弱顺铂引起的对肝癌细胞的细胞毒作用3 84 4 2 过表达a t f 4 减弱顺铂导致的肝癌细胞的凋亡3 9第五节沉默a t f 4 对顺铂在肝癌细胞系中作用的影响4 04 5 1 沉默a t f 4 增强了顺铂对肝癌细胞的细胞毒作用4 04 5 2 沉默a t f 4 增强了顺铂导致的肝癌细胞的凋亡4 l第六节a t f 4 沉默后对细胞内谷胱甘肽合成的影响4 24 6 1 沉默a t f 4 减弱了谷胱甘肽的合成。4 24 6 2a t f 4 通过促进谷胱甘肽的合成进而增强肝癌细胞对顺铂的耐药性4 3第七节体内检测a t f 4 对肝癌耐药性的影响4 34 7 1 检测异种移植肿瘤接受化疗后a t f 4 对肿瘤人小的影响4 34 7 2a t f 4 降低肿瘤组织中顺铂引起的肿瘤细胞的凋亡4 5第五章讨论4 6第六章结论5 0参考文献51致谢5 6附录5 7个人简历6 1v i英汉缩略名词对照表缩略词a t f 4d d ps h r n am 眦c d n ad n t pp c rp b sf a c sp ii c 5 0i h ct u n e l英汉对照词缩略表英文全称a c t i v a t i n gt r a n s c r i p t i o n a lf a c t o r4c i s p l a t i ns m a l lh a i r p i n er n am e s s e n g e rr n ac o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i dd e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np h o s p h m e b u f f e rs a l i n ef l o wc y t o m e t r yp r o p i d i u mi o d i d et h eh a l fm a x i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o ni m m u n o h i s t o c h e m i s t r yt d t - m e d i a t e dd u t pn i c ke n dl a b e l i n gv i i中文全称活化转录因子4顺铂小发央i 矾a信使r n a反向转录脱氧核糖核酸三磷酸脱氧核( 糖核) 苷聚合酶链式反磷酸盐缓冲液流式细胞术碘化丙啶半数抑制浓度免疫组织化学原位末端标记法引言第一章引言第一节活化转录因子4 ( a t f 4 ) 的研究背景1 1 1a t f 4 的发现及命名1 1 1 1a t f 4 的发现a t f 4 ( a a c t i v a t i n gt t r a n s c r i p t i o nf a c t o r4 ) 是a t f c r e b 转录因子超家族成员之一。a t f c r e b 转录因子超家族具有碱性亮氨酸拉链结构，其通过碱性亮氨酸拉链结构域与d n a 结合，或者形成同源或异源二聚体行使其生物学功能【1 1 。a t f 在1 9 8 7 年被首次提出，是指那些结合在腺病毒早期启动子e 2 、e 3 和e 4 区域的蛋白，这些启动子的结合位点有着共同的保守序列“c g t c a 【2 1 。同年，一些c a m p 应答元件结合蛋白( c y c l i ca m pr e s p o n s ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ，c i 冱b ) 被报道，这些结合蛋白可以结合在生长激素抑制素的启动子的c a m p 反应元件( c y c l i ca m pr e s p o n s ee l e m e n tc r e ) 上【3 】。随后，a t f 的结合位点被定义为t g a c g t ( c a ) ( g a ) i 4 。与之相对应，c r e s 的保守序列为a c g t ，并且其可通过侧系的该碱基序列与不同的具有亮氨酸拉链结构的转录因子结合。这个核心序列也存在于缺氧应答元件( h y p o x i ar e s p o n s ee l e m e n t s ，h r e s ) 上，h r e s存在于一些缺氧调节基因如v e g f 的启动子中，从而调节这些基因的表达。1 1 1 2 a t f 4 的命名以及其家族成员最初人源的a t f 4 被分离出来的时候，其有不同的名称如：t a x c r e b 6 7 5 1 、c r e b 2 【6 1 。当然，鼠源的a t f 4 也有不同的名称：m a t f 4 1 7 1 、m t r 6 7 t 8 1 、c a t f 9 1 。由于鼠源a t f x 与a t f 4 有5 5 的同源性，从而被归为a t f 4 的亚群成员之一【l o l 。研究表明，与人源a t f 4 同源的蛋白也在存在于其他物种中，如果蝇属( d r o s o p h i l a ) 、雨虎属( a p l y s i a ) 和c e l e g a n s ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r ：c a a 9 3 7 5 7 ) ，但这种同源性主要局限于b z i p 区域。a t f c i 也b 家族成员除了a t f 4 还包括a t f l ( 又称t i 砸b 3 6 ) 、a t f 2 ( 又称c r e b p l ) 、a t f 3 、a t f 5 ( 又称a t f x ) 、a t f 6 、a t f 7 ，b a t f 、c r e b 31 4 ( 也又称a i b z i p 或a t c e l ) 、c r e b h 以及c r e b c r e m 亚组。这些成员由于在氨基酸序列上与a t f 4 有很大程度的同源性，都被归为a t f 4 的亚群成员【l o 】。1引言1 1 2a t f 4 的结构1 1 2 1a t f 4 的基因座位以及其m r n a 和蛋白的结构人类a t f 4 基因位于2 2 q 1 3 1 ，其基因座位在3 8 ，2 4 1 ，0 6 9 3 8 ，2 4 3 ，1 9 1 b p ，基因长度为2 1 2 2 b p t i l 】。人源的a t f 4m r n a 在起始密码子之前的5 u r t 区有三个短的开放阅读框( s h o r to p e nr e a d i n gf r a m e s ，u o r f ) 卜2 】，这些u o r f 对a t f 4 接受应激反应后调节下游基因的表达具有关键的作用。人源的a t f 4 蛋白由3 5 1 个氨基酸组成，在功能上包含可以形成同源或异源二聚体的序列、d n a 结合区域、以及维持a t f 4 蛋白稳定性的区域。在组成结构上包括一个靠近n 端的亮氨酸拉链区和一个c 端碱性亮氨酸拉链( b z i p ) 结构域( 见图1 1 ) 【1 2 1 。a t f 4 通过亮氨酸拉链形成同源或异源二聚体，以二聚体的形式结合特定的d n a 序列，参与多种基因的表达调控。z i p p e r b a s i cz i p p e r图1 1a t f 4 的结构1 1 2 2 a t f 4 的相互作用蛋白在真核生物中a t f 4 发生作用时多与其他蛋白形成二聚体比如：与a p 1 及c e b p 家族的成员蛋白形成异源二聚体( 如f o s 和j u n ) i s 】，或形成同源二聚体，a t f 4 的结合位点决定于与之相结合的蛋白。a t f 4 与其他蛋白的相互作用赋予了其多种多样的生物学功能。a t f 4 有多种相互作用蛋白，包括：s k i p 3 ( 一种人源激酶基因其在人类多发肿瘤中过度表达且受缺氧状态调节【1 3 】) 、( g p e l 结合蛋白：一种粒细胞集落刺激因子基因的c i s控制元件) 、r s k 2 ( 一种生长因子调节激酶1 4 - 1 5 1 ) 、h t l v l 反式作用子t a x 1 6 1 、1 3 t r c p ( 一种f b o x 蛋白，与蛋白酶体降解相关) 、s c fe 3 泛素连接酶的受体成份【l7 1 、n r f 2 ( 一种调节基因表达的因子，可通过抗氧化或解毒作用调节基因对酶的编码【1 8 】) 、z i p 激酶( 一种丝氨酸苏氨酸激酶，它介导细胞凋亡【1 9 】) 、s a t b 2( 一种核基质蛋白例) 、c h o p ( c e b p 同源蛋白【2 l 】) 、z h a n g f e i ( 一种亮氨酸拉链结构，参与疱疹病毒的侵染循环【2 2 】) 等，这些分子与a t f 4 相互作用，行使其特有的生物学功能。2引言1 1 3a t f 4 的生物合成a t f 4 是一种应激应答因子，其会被一些应激反应所上调表达。这些应激现象主要包括：缺氧【2 3 埘】、氨基酸饥饿、氧化应激【2 5 】、以及内质网应激。调控a t f 4的蛋白表达主要在以下几方面：转录调控、翻译水平的调控和翻译后调控。1 1 3 1a t f 4 的转录调控先前的文献报道，a t f 4 基因普遍存在于各种组织中，但是细胞处于不同的应激条件下可上调a t f 4m r n a 水平。在大鼠正常的成纤维细胞中，缺氧可使a t f 4m r n a 水平上调1 2 6 】。在人的乳腺癌细胞中，已证明h e r e g u l i np 1 ( h r g )可在翻译前诱导a t f 4 m r n a 合成【2 1 7 1 ，h r g 也可通过m a p k 途径的激活增强a t f 4 的转录活化能力。另有文献报道，氨基酸和葡萄糖剥夺也可诱导a t f 4 m r n a 2 8 j 的转录。另外，淋巴细胞中的钙离子载体【5 1 以及内皮细胞中的高半胱氨酸及溶血磷脂胆碱【2 9 1 ，均可增加a t f 4 的m r n a 。当然，也有研究者有不同的看法，a m e r ik 等人在人类乳腺癌细胞系m d a m b4 3 5 中发现含氧量正常和无氧状态下a t f 4m r n a 很接近，但是无氧条件下的a t f 4 蛋白量确比正常水平要高。他们还发现无氧状态下，蛋白酶体抑制剂可使a t f 4 蛋白上调【2 3 】。这些结果表明缺氧导致的a t f 4 的表达量上调可能是转录后水平调节的。1 1 3 2a t f 4 在翻译水平以及翻译后调控在真核细胞中，缺氧无氧以及内质网平衡状态的破坏引发一系列复杂的程序紊乱，从而通过内质网固有激酶( e n d o p l a s m i cr e t i c u l u mr e s i d e n tk i n a s ep e r k )蛋白激酶使真核生物翻译起始因子2 a ( e l f 2 a ) 磷酸化，磷酸化的e l f 2 a 降低大多数蛋白的表达水平来保护机体自身，但a t f 4 的表达量却是增加的 3 0 j ，增加后的a t f 4 可以调控下游基因的表达来进一步保护机体。a t f 4 蛋白的半衰期很短，只有3 0 6 0 m i n 。a t f 4 是由无氧( 0 1 0 2 ) 条件诱导，这种诱导主要是通过增强蛋白的稳定性实现的。目前，主要有两种机制参与a t f 4 蛋白的稳定性：( i ) 受s c f i t r c p 泛素激酶调节：a t f 4 的d s g x x ( x )s 序列被p t r c p 识别后，该基序中的丝氨酸被磷酸化并与1 3 t r c p 相互作用进而使蛋白酶体降解【1 7 】；在无氧状态下，a t f 4 得稳定得益于一小分子泛素样蛋白的修饰f 2 3 】。( i t ) 受组蛋白乙酰转移酶p 3 0 0 ( h a t p 3 0 0 ) 的调节。h a tp 3 0 0 则3引言通过抑制a t f 4 的泛素化来影响a t f 4 与1 3 t r c p 相互作用以及后来的降解过程来维持a t f 4 蛋白的稳定。第二节a t f 4 的生物学功能a t f 4 的生物学功能多种多样，目前仍在探索中。a t f 4 是一种保护基因，它可以保护处于多种应激状态的细胞；a t f 4 还是一种发育基因在骨骼、眼睛和造血功能发育中发挥作用；a t f 4 可作为一种转录调节子来调节下游基因的转录。近几年来还发现a t f 4 对参与肿瘤的发生、浸润和转移具有一定的作用，此外，有研究表明在不同的肿瘤细胞系中a t f 4 对其耐药性也起到不同的作用。1 2 1a t f 4 在基因转录中的调节作用a t f 4 是一种转录调节子。作为转录抑制子，a t f 4 可通过人脑啡肽启动子上的c r e 负调控其转录水平，从而抑制长期记忆；作为转录激活子，a t f 4 可以诱导表达r a n k l ( r e c e p t o ra c t i v a t o ro f n u c l e a rf a c t o r - k a p p abl i g a n d ) 、降钙素【3 l j 、e 选择蛋白【1 2 , 2 7 】、v e g f 3 2 1 、g a d d l 5 3 t 3 3 1 、g a d d 3 4 t 3 4 1 、天门冬酰胺合成酶 2 8 , 3 5 】、t r b 3 t 3 6 】等；除此之外，a t f 4 还可诱导与线粒体功能、氨基酸代谢以及氧化还原反应相关基因的表达。a t f 4 的这种超激活的特性主要取决于与其相互作用的蛋白。1 2 2a t f 4 在各种应激中的调节作用代谢应激( 葡萄糖和氨基酸饥饿) 、氧化应激和内质网应激( e rs t r e s s ) 等多种应激都可诱导a t f 4 的表达增加。a t f 4 为了补充氨基酸的缺乏和一些应激反应从而整合各种应激信号来调节下游基因的表达。比如：线粒体的功能基因( 线粒体蛋白酶同源物) 、氨基酸转运代谢基因( 天冬氨酸合成酶) 以及参与氧化还原反应的基因( n a d h 细胞色素b 5 还原酶同源物) 。代谢应激和内质网应激能激活p e r k 途径，p e r k 途径可抑制一些蛋白的表达，a t f 4 通过发挥负反馈调节作用使蛋白合成抑制作用短暂化，比如：a t f 4 诱导g a d d 3 4 ( g r o w t ha r r e s td n ad a m a g eg a d d 3 4 ，是使e i f 2 a 发生去磷酸化的磷酸酶复合物的组成成分之一) 的转录，从而使蛋白翻译继续进行。又如：在人肝癌细胞系h e p g 2 中，a t f 4 在内质网应激诱导的未折叠蛋白反应( u n f o l d e dp r o t e i nr e s p o n s e ，u p r ) 中发挥重要作用。a t f 4 可促进i g f b p - l ( i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r - b i n d i n gp r o t e i n - 1 ，4引言i g f b p 1 ) 的表达，而i g f b p 1 则减少蛋白合成，从而减轻内质网内蛋白加工的负担。但是如果应激持续存在，a t f 4 作用于g a d d l 5 3 靶基因，活化提前凋亡途径诱导细胞凋亡。1 2 3a t f 4 的转基因学研究通过a t f 4 转基因小鼠已经证明：a t f 4 在眼睛发育【3 7 1 、细胞增殖和造血功甜3 引、骨骼发育2 0 ，3 9 1 、繁殖【矧、长期记忆储存【4 1 1 等方面发挥着重要作用。所以a t f 4 缺陷的小鼠会表现出失明、低生育能力、贫血、骨质疏松等症状。在神经系统中，a t f 4 被氧化应激诱导会促发死亡应答反应。a t f 4 缺陷鼠在缺血发作模型中发生梗死的概率降低【4 2 1 。另外有研究证明，大脑伏核区a t f 4过度表达能减少情绪反应并出现抑郁样行为反应【4 3 】。过表达a t f 4 的转基因鼠表明，在乳腺上皮细胞中高表达a t f 4 会阻止其分化与增值。在乳腺的发育中会是一种凋亡前体因子。但是在一些组织中的功能却是相反的，关于这些会在下一小节中详细阐述。a t f 4 在成骨细胞的分化和骨质的形成中发挥着重要的作用，主要通过两种机制：a 、易化相关基因的表达；b 、增加成骨细胞中氨基酸的摄取【3 9 】。a t f 4缺陷的小鼠在整个生命中骨质都很低遭受严重的骨质疏松。a t f 4 与r u n x 2( r u n t - r e l a t e dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r2 ) 和t r a n s c r i p t i o nf a c t o ri i ag a m m a ( t f i i ag a m m a )共同作用促进成骨细胞特异性基因表达m 】。a t f 4 也是r s k 2 ( 与成骨细胞分化和功能有关) 的作用底物，a t f 4 和r s k 2 共同调节i 型胶原( 是骨基质的主要成分) 的合成。r s k 2 缺陷的小鼠提示a t f 4 是成骨细胞分化及发挥功能的关键调节子。经r s k 2 发生a t f 4 磷酸化的缺陷可使小鼠出现c o m n l o w r y 综合征的骨骼表型【39 。最新研究a t f 4 和f i a t 形成异源二聚体阻止f i a t 与d n a 的结合从而抑制成骨素基因的转录h 引。第三节a t f 4 在肿瘤中的研究概况a t f 4 在肿瘤中的作用仍不是十分明确，大多数研究者认为在多数肿瘤中，a t f 4 促进肿瘤生长、增加了肿瘤在缺氧条件下的耐受并且可以促进肿瘤血管生成因子的表达抑制细胞的凋亡，另外a t f 4 还可以增加肿瘤对化疗药物的耐受性。但是另外一些研究者也提出了不同的观点。5引言1 3 1a t f 4 与肿瘤的生长、浸润与转移的关系对于肿瘤而言，其生长面临的一个重要挑战就是缺氧，而a t f 4 是缺氧诱导基因，所以a t f 4 在肿瘤组织中的表达要高于正常组织，从而促进了肿瘤的生长。有转基因研究发现，a t f 4 小m e f s 比a t f 4 + + m e f s 对缺氧环境更加敏感，它会导致肿瘤细胞大量凋亡；在异种移植的小鼠肿瘤模型中，可见瘤体宏观形态上明显较小。新生血管的形成是肿瘤转移的重要标志，a t f 4 可以诱导血管生成因子( v e g r ) 和e 选择蛋白( e s e l e c t i n ) 的表达，而这两种蛋白均参与肿瘤的转移。研究表明，在人类乳腺癌细胞中，骨桥蛋白( o s t e o p o n t i n ，o p n ) 能激活a t f 4级联反应从而促进v e g f 在肿瘤进展和新生血管形成中的作用1 4 6 1 ，内皮细胞中e s e l e c t i n 的高表达能增加人乳腺癌细胞的转移和浸润能力h 7 1 。所以，阻断o p n调节信号网络( 包括a t f 4 ) 是抑制肿瘤新生血管生成的一种策略，或许也为恶性乳腺肿瘤的治疗开辟一条有效的途径。另有研究报道，在肿瘤细胞中，消除放化疗副作用的阿米福汀可以通过激活e l f 2 a a t f 4 途径来上调v e g f a 的表达【48 | ，这会给肿瘤的临床治疗带来一定的困难。a t f 4 也在肿瘤骨转移中发挥一定作用。a t f 4 可以稳定成骨细胞特异性聚集，进而诱导其特异性基因的表达，另外，a t f 4 可以诱导成骨细胞特异性基因在非成骨细胞中特异性表达。最新研究表明，n f k b 的配体激活子( r e c e p t o ra c t i v a t o ro f n u c l e a rf a c t o r - k a p p abr a n k ) 及其配体( r a n k l ) 在介导肿瘤破坏骨质方面起到决定性作用，而a t f 4 可能会调节r a n k l r a n k l 体系。所以，a t f 4在肿瘤的骨转移中发挥着正相关的作用。m i e l n i c k i 等人研究表明在成纤维细胞中a t f 4 过度表达能减少r a s 原癌基因在转移细胞中的易位表达能力【4 引，因此a t f 4 在抑制肿瘤转移中发挥一定的作用。所以，a t f 4 在肿瘤转移过程中的作用需更深入的研究。1 3 2a t f 4 与肿瘤凋亡的关系在一些应激环境下，a t f 4 可以诱导多种应激应答基因的表达，从而使肿瘤在缺氧的环境下存活。但在应激环境过长的条件下，非折叠蛋白会超过一定得阈值，受损细胞会启动凋亡程序。a t f 4 增加p r o a p o p t o t i c 转录因子g a d d l 5 3 c h o p 的转录 2 5 】。g a d d l 5 3 与e r 应激诱导的凋亡有特别关系【5 0 蜘】。来源于g a d d l 5 3 d e f c i e n t 小鼠的m e f s ( m o u s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t s ) 对内质6引言网诱导的凋亡表现出耐受性【5 2 1 。另外，塞来考昔( c e l e c o x i b ，一种非甾体类抗炎药物) 能够诱导人类消化道肿瘤凋亡机制，而a t f 4 能抑制这种药物引起的肿瘤凋亡。c e l e c o x i b 通过增加细胞内c a 2 + 浓度活化a t f 4 途径上调1 5 0 一k d ao x y g e n r e g u l a t e dp r o t e i n( o r p l 5 0 ) ，o r p l 5 0 的表达能维护肿瘤在缺氧条件下存活。a t f 4 还可以通过胞内c a 2 + 浓度依赖途径上调o r p l 5 0 的表达，从而抑制c e l e c o x i b 诱导的肿瘤凋亡1 5 3 1 。1 3 3a t f 4 在肿瘤化疗中的作用顺铂是多种实体肿瘤化疗的有效药物，但是肿瘤对顺铂的耐药性是当今肿瘤治疗的主要困难。2 0 0 3 年，k i m i t o s h ik o h n o 等人报道了a t f 4 由d n a 损伤诱导，并且在耐药的肿瘤细胞系中高表达。其研究表明，a t f 4 的表达与肿瘤对顺铂的敏感性有密切相关关系( p = 0 0 1 ) 【5 4 1 。在2 0 0 7 年，这个课题组又有了进一步的研究成果，他们发现了生理节奏转录因子( c l o c k ) 和顺铂的耐药性具有密切的关系，a t f 4 是c l o c k 的直接靶基因，两者共同参与影响多种肿瘤细胞系对化疗药物的耐受性【5 5 1 。然而与在实体肿瘤中a t f 4 对耐药性的影响不同，在多发性骨髓瘤中，a t f 4的高表达却能增强药物的化疗效果。在研究b o r t e z o m i b ( 为一种蛋白酶抑制剂，是临床上治疗多发性骨髓瘤的常用药物) 抗药性机制中发现，a t f 4 及其他转录因子( 如a t f 3 、a t f 5 、c - j u n ，j u n d 和c a s p a s e 3 ) 的高表达却增加了多发性骨髓瘤细胞对b o r t e z o m i b 诱导凋亡的敏感性【5 引。所以a t f 4 对肿瘤化疗的影响还有待于进一步研究。第四节我们的实验1 4 1 本实验的目的与意义a t f 4 蛋白在肿瘤组织中的表达要高于正常组织中，在肿瘤微环境中，a t f 4与新生血管生成和低氧耐受相关。在有关肿瘤化疗的研究中，a t f 4 对药物的敏感性有一定的影响，而且在不同的肿瘤类型中作用不尽相同。一系列的研究表明，a t f 4 有望成为肿瘤治疗新的潜在的靶点。肝癌是我国第二大肿瘤，治疗困难而且死亡率相对较高。肝癌对多种化疗7引言药物均呈现出耐药性，先前的研究已经表明a t f 4 对不同肿瘤的耐药性有不同的影响。在本项研究中，我们计划在体内外分别设计实验探讨a t f 4 对肝癌耐药的影响，本方面的研究将为针对于a t f 4 的临床药物研发提供一定的理论依据。1 4 2 主要实验方法迄今为止，有关a t f 4 对肿瘤耐药的影响尚不明确。在我们的实验中，从体外、体内两个层面来研究a t f 4 对肝癌耐药的影响。在体外实验中，采用h e p g 2 和s m m c 7 7 2 1 两种人类肝癌细胞系建立a t f 4过表达和基因沉默稳定细胞系，通过细胞毒性实验，凋亡实验等来研究a t f 4 对顺铂在肝癌中敏感性的影响。除此之外，我们还检测了在沉默a t f 4 后的s m m c 7 7 2 1 细胞系中的谷胱甘肽的合成功能。在体内实验中，我们采用皮下注射沉默a t f 4 的s m m c 7 7 21 稳定细胞系，观察肿瘤大小和采用t u n e l 方法检测注射顺铂后的肿瘤组织的凋亡情况来进一步证实a t f 4 在肝癌耐药中的作用。1 4 3 实验思路首先，我们检测人肝癌组织和正常肝组织以及肝癌肿瘤细胞系中的a t f 4 的表达情况，确定在大部分肝癌组织中以及两种肝癌细胞系中都有a t