（作物遗传育种专业论文）甘薯（Ipomoea+batatasL）β胡萝卜素合成途径系列酶基因的克隆及相关研究.pdf

摘要 天然d 一胡萝卜素对人体的健康有重要的作用它有很强的抗氧化性， 可降低多种癌症特别是肺癌的发病率，据研究，食用d 一胡萝卜素含量高 的天然食物的人群比食用d 一胡萝卜素含量低的食物的人群患肺癌的可 能性低7 倍：同时它又是重要的营养素，可做为v 原，在体内可根据需 要转化为y “随着科学消费意识的增强，高d 一胡萝卜素含量的天然食品 越来越受到人们的青昧 胡萝卜素、赤霉素，叶绿素、和醌类等物质的共同前体是g g p p ( 犍牛 儿基犍牛儿基焦磷酸) ，g g p p 普遍存在于高等植物中d 一胡萝卜素的生 物合成以g g p p 为起点，经八氢番茄红素合成酶( p s y ) ，八氢番茄红素脱 氢酶( p d s ) 、i ：一胡萝卜素脱氢酶( z d s ) 和番茄红素d 一环化酶( l y c - b ) 4 个酶的缩合、脱氢和环化，生成了o 一胡萝卜素 红心甘薯含有丰富的d 一胡萝卜素为能获得具有自主知识产权的d 一 胡萝卜紊生物合成系列酶基因，改良水稻等作物的品质，进行了克隆甘 薯d 一胡萝卜素生物合成系列酶基因和相关研究，主要结果如下： 1 研究改良了甘薯块根总r n a 提取的方法，分离到高质量的甘薯块 根总r n a ，逆转录成e d n a 后，从中克隆了o 一胡萝卜素合成途径4 个系列 酶基因的保守序列 ， 经过试验，获得了一种分离甘薯块根总r n a 的方法，排除了块根中大 量次生物质的干扰，分离到了高质量的红心甘薯金山7 2 块根总r n a 以 总r n a 逆转录的e d n a 为模板，用扩增同源序列的简并引物，p c r 扩增出 了甘薯d 一胡萝卜素生物合成4 个系列酶基因p s y , p d s ，z d s ， y c - b 的保守 序列 2 获得了甘薯d 一胡萝卜素合成途径4 个酶全长e d n a 采用e d n a 末端快速扩增( r a c e ) 技术获得了甘薯d 一胡萝卜素生物合 成途径4 个系列酶的c d n a 序列，结果如下： ( 1 ) p s y ：全长c d n a 共1 5 0 0 b p ，包含一个13 1 4 b p 的o r f ，编码4 3 8 个氨基酸残基，推导的氨基酸序列与辣椒，番茄和甜橙p s y 同源性分别 达7 8 、7 6 和7 5 还从甘薯基因组d n a 中用p c r 方法克隆到了全长p s y 基因，总长2 0 8 2 b p ，有三个内含子，长度分别为9 8 b p 、1 3 3 b p 与3 5 9 b p ( 2 ) p a l s ：全长c d n a 共2 1 8 5 b p ，包含一个1 7 1 9 b p 的o r f ，编码5 7 2 个氨基酸残基，推导的氨基酸序列与番茄、辣椒和苦瓜的p d s 同泓洼分 别达8 3 、8 2 、和8 0 i v ( 3 ) z d s ：全长c d n a 共2 0 5 7 b p ，包含一个1 7 7 3 b p 的o r f ，编码5 9 1 个氨基酸残基，推导的氨基酸序列与辣椒番茄和向日葵的z d s 同源性 分别达8 5 ，8 5 和8 4 ( 4 ) 1 ，c - 抚全长e d n a 共1 8 4 4 b p ，包含一个1 5 0 3 b p 的o r f ，编码5 0 1 个氨基酸残基，推导的氨基酸序列与烟草、番茄和辣椒的l y c - b 同源性 分剐达8 2 、8 3 j l 和8 3 3 分别构建了甘薯d 一胡萝卜素合成4 个系列酶基因的植物表达载体， 转化烟草，获得了转基因植株 为鉴定基因功能，将克隆到的四个系列酶基因，分别构建到带有3 5 s 启动子和t - n o s 终止子表达盒的载体p c a m b i a 2 3 0 0 - p t 上，获得了植物表 达栽体p c a m b i a 2 3 0 0 p t - p s y ，p c a m b i a 2 3 0 0 p t l i 凼，p c a m b i a 2 3 0 0 p t - z d s 和p c a m b i a 2 3 0 0 p t - i y c ，用冻融法分别导入农杆菌后，用农杆菌介导法转 化烟草用含1 0 0 m g l - 1 k a n 的筛选培养基筛选后，提取抗值株基因组 d n a ，用p c r 法进行鉴定，获得了转甘薯p s y 的烟草1 5 株，转甘薯p d s 的烟草1 2 株，转甘薯z d s 的烟草6 株，转甘薯加一6 的烟草1 8 株 4 研究了甘薯d 一胡萝卜素合成4 个系列酶基因在甘薯块根中的差 异表达与d 一胡萝卜素含量的关系 以本研究克隆的4 个甘薯d 一胡萝卜素合成系列酶基因的傣守序列为 模板，随机引物法用d i g 标记了四个基因的探针。提取甘薯金山5 7 和金 山7 2 生育前期和后期的块根总r n a ，进行斑点杂交，检测各基因的相对 表达强度，同期提取并用h p l c 测定块根d 一胡萝卜素含量： ( 1 ) 金山5 7 在生育后期四个基因，特别是p s y , 表达比前期弱，相对 应地，生育后期d 一胡萝卜素含量为2 0 1 6 m g g ，也比前期1 0 0 9 6 m g g 。1 低，仅为前期的2 0 左右 ( 2 ) 金山7 2 生育后期各基因的表达强于生育前期，后期d 一胡萝卜素含 量为5 0 6 8 8 m g g ，比前期3 8 1 1 2 m g g q 高 ( 3 ) 两品种相比较，整个生育时期，金山7 2d 一胡萝卜素合成四个酶基 因的表达强度大大强于金山5 7 ，全山7 2 块根d 一胡萝卜素含量也显著高 于金山5 7 关键词：甘薯；6 一胡萝卜素；基因克隆；转化；斑点杂交；八氢番茄红 素合成酶；八氢番茄红素脱氢酶；i ：一胡萝卜素脱氢酶；番茄红素d 一环 化酶 v c l o n i n ga n ds t u d yo ng e n e sf o ra llm e m b e r o fp - c a r o t e n ( b i o sm t h e t i c ) a t h w ainenzymeso f- c a r o t e n eb i o s y n t h e t l cp a t h w a y1 np s w e e t p o t a t o ( z p o m o e ab at at a s d a b s t r a c t i n a r t i f i c i a lb - c a r o t e n ei sv e r yi m p o r t a n tf o rt h eh e a l t ho f o u rb o d y b - c a r o t e n es h o w si t ss t r o n ga b i li t yo fa n t i o x i d a t i o n ， s oi tc a nd e c r e a s et h ei n c i d e n c eo fv a r i e t i e so fc a n c e r s ， e s p e c i a ll yl u n gc a n c e r i tw a sr e p o r t e dt h a tt h o s ew h oe a tf o o d s c o n t a i n i n gm o r ei n a r t i f i c i a l b - c a r o t e n ed e c r e a s e do fr i s ko f s u f f e r i n g c a n c e r sb ys e v e nt i m e st h a nt h o s ew h oe a tf o o d s c o n t a i n i n gl o wb c a r o t e n e ；a sv i t a m i nap r e c u r s o r 。b c a r o t e n ei s a l s oa ni m p o r t a n tn u t r i e n tc o m p o n e n t a st h ec o n s c i o u s n e s so f s c i e n t i f i cc o n s u m p t i o ni sw i d e l ya c c e p t e d ，m o r ea n dm o r ep e o p l e a r ef a v o ro fi n a r t i f i c i a lf o o dw i t hh i g hb - c a r o t e n ec o n t e n t c a r o t e n e ，g i b b e r e lli n ，c h l o r o p h y lla n dq u i n o n es h a r et h e s a m ep r e c u r s o r ( 掘p p ( g e r a n y l g e r a n y lp y r o p h o s p h a t e ) ，t h eb c a r o t e n e i sf o r m e df r o m g g p pt h r o u g hc o n d e n s a t i o n ，d e s a t u r a t i o na n d c y c l a t i o nc a t a l y z e db yp h y t o e n es y n t h a s e ，p h y t o e n ed e s a t u r a s ea n d l y c o p e n eb e t a - c y c l a s e ，r e s p e c t i v e l y t h et u b e r o u sr o o t so fs w e e t p o t a t ow i t hr e d - o r a n g ef l e s h c o n t a i nh i g hb c a r o t e n ec o n t e n t i no r d e rt oo b t a i np r o p e r t y r i g h to f t h eg e n e sf o re n z y m e so f9 一c a r o t e n eb i o s y n t h e t i ci n s w e e t p o t a t oa n da v a i l a b l ef o ri m p r o v i n gc r o p sq u a l i t ys u c ha sr i c e ， t h eg e n e sf o re n z y m e so fb c a r o t e n eb i o s y n t h e t i ci ns w e e t p o t a t o w e r ec l o n e da n dr e l e v a n ts t u d i e sw e r ec a r r i e do u t ，r e s u l t sa r ea s f o l l o w i n g ： 1 a ni m p r o v e dm e t h o df o rr n ais o la tio nf r o mt u b e r o u sr o o tsw a s p r o p o s e da n dt o t a lr n aw i t hh i g hq u a l i t yw a si s o l a t e d ，d i s m i s s i n g t h ein t e r f e r eo fs e c o n d a r yc o m p o u n d t h ec o n s e n s u ss e q u e n c e so f f o u rg e n e so fb c a r o t e n eb io s y n t h e ticp a t h w a y ，p s y , p d s , z d sa n d l y c - b , w e r ec l o n e db yp c rf r o mt h ec d n ar e v e r s e t r a n s c r i p t e df r o m t h ei 州a 2 t h ec o m p le t es e q u e n c e so ff o u rg e n e sf o re n z y m e so ft h e 9 一c a r o t e n eb i o s y n t h e t i cp a t h w a yw e r eo b t a i n e db yr a c et e c h n i q u e ， t h e r ea r e ： ( 1 ) p s y = t h ec o m p l e t es e q u e n c eo fp s y c o n s i s t so f1 5 0 0 b p ，w h i c h h a sa no p e nr e a d i n gf r a m eo f1 3 1 4 b pa n de n c o d e sap r o t e i no f4 3 8 v i a m i n oa c i d sw i t hac a l c u l a t e dm o l e c u l a rw e i g h to f4 9 k d s e q u e n c e a n a l y s i ss h o w st h a tt h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c es h a r e7 8 ， 7 6 a n d7 5 id e n tit yw i t ht h a to fp s yo fc a p s i c u m 翻n u u i 玩 l y c o p e r m c o ne s c u l e n t u ma n dc i t r u su n s h i d ，r e s p e c t i v e l y t h e c o m p l e t es e q u e n c eo fp s yg e n ea l s oh a db e e nc l o n e df r o mt h eg e n o m e d n ao fs w e e t p o t a t o ，w h i c hi s2 0 8 2 b pi nl e n g t h ，i n c l u d i n g3i n t r o n s c o n s i s to f9 8 b p ，1 3 3 b pa n d3 5 9 b p ，r e s p e c t i v e l y ( 2 ) p d s = t h ec o m p l e t es e q u e n c eo fp d sc o n s i s t so f2 1 8 5 b p ，w h i c h h a sa no p e nr e a d i n gf r a m eo f1 7 1 9 b pa n de n c o d e sap r o t e i no f5 7 2 a m i n oa c i d sw i t hac a l c u l a t e dm o l e c u l a rw e i g h to f6 4 k d s e q u e n c e a n a ly siss h o w st h a tt h ed e d u c e da m in oa cids e q u e n c es h a r e8 3 ， 8 2 a n d8 0 i d e n t i t yw i t h t h a to f 础9o f l y c o p e r s i c o n e s c u l e nt u m , c a p s i c u ma n n u u 喝g o m o r d i c ac h a r a nt i av a l a b b r ev i at a , r e s p e c t i v e l y ( 3 ) z d s ：t h ec o m p l e t es e q u e n c eo fz d sc o n s i s t so f2 0 5 7 b p w h i c h h a sa no p e nr e a d i n gf r a m eo f1 7 7 3 b pa n de n c o d e sap r o t e i no f5 9 1 a m i n oa c i d sw i t hac a l c u l a t e dm o l e c u l a rw e i g h to f6 5 l ( d s e q u e n c e a n a l y s i ss h o w st h a tt h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c es h a r e8 5 ， 8 5 a n d8 4 i d e n t i t yw i t ht h a to f - c a r o t e n ed e s a t u r a s eo f c a p s i c u ma n n u u r 皿l y c o p e r s i c o ne s c u e nt u 喝h e l i a nt h u s8 n n u u s 厶r e s p e c t i v e l y ( 4 ) 加：t h ec o m p l e t es e q u e n c eo f y cc o n s is t so f1 8 4 4 b p 。w h i c h h a sa no p e nr e a d i n gf r a m eo f1 5 0 3 b pa n de n c o d e sap r o t e i no f5 0 1 a m i n oa c i d sw it hac a l c u l a t e dm o l e c u l a rw e i g h to f5 6 k d s e q u e n c e a n a l y s i ss h o w st h a tt h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c es h a r e8 2 ， 8 3 a n d8 3 i d e n t i t yw i t hb - c y c l a s ed e s a t u r a s eo f 朋c o t i a n a t a b a c u n 写l y c o p e r s i c o ne s c u e n t u m , c a p s i c u ma n n u u 皿r e s p e c t i v e l y 3 i no r d e rt oi d e n t i f yt h ef u n c t i o no ft h ec l o n e dg e n e s 。e a c h o ft h ec o d i n gr e g i o no ff o u rc l o n e dg e n ew a si n s e r t e di n t ot h ep l a n t e x p r e s s i o nv e c t o rp c a m b i a 2 3 0 0 p t a tt h es i t eb e t w e e nt h e 3 5 s p r o m o t e r a n d t n o s ，t h e f o u rp l a n t e x p r e s s i o nv e c t o r s 。 p c a m b i a 2 3 0 0 p t p s y p c a m b i a 2 3 0 0 p t - p d s p c a m b i a 2 3 0 0 p t - z d s a n d p c a m b i a 2 3 0 0 p t l y c ， w e r e o b t a i n e d t h e nt h e s ev e c t o r s w e r e t r a n s f e r e di n t oa g r o b a c t e r i u ml f ；a 4 4 0 4 ，t h e nt r a n s f e r r e di n t o t o b a c c o ( 朋c o t i a n a t a b a c u m l ) b ya g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o nm e t h o d t h ep l a n t l e t sw e r es c r e e n e do nt h ec u l t u r e c o n t a i n i n gk a n a m y c i n r e s u l t so fp c rf r o mt h eg e n o m ed n ai s o l a t e d f r o ma n t i 。k a n a m y c i np l a n t l e t ss h o w e dt h a tt h ef o u rg e n e sw e r e i n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m e so ft r a n s f o r m e dp l a n t s ，r e s p e c t i v e l y v 4 i s o l a t e dt o t a lr n af r o mt h et u b e r o u sr o o t so fs w e e t p o t a t o o fj i n s h a n5 7a n dj i n s h a n 7 2a tt h ee a r l ya n dl a t ed e v e l o p m e n t a l s t a g e s ，r e s p e c t i v e l y ，d e t e c t e dt h em r n ao ft h ef o u rg e n e se n c o d i n g k e ye n z y m e so f t h e b c a r o t e n eb i o s y n t h e s i sb yd o tb l o tu s i n g p r o b e sl a b e l e dw i t hd i g ，t h ep r o b e sw e r et h ep c rp r o d u c t sf r o mt h e c l o n e dc o n s e n s u ss e q u e n c e so ff o u rg e n e se n c o d i n gk e ye n z y m e so f 9 - c a r o t e n eb i o s y n t h e t i cp a t h w a y b c a r o t e n ew a sd i s t i l l e df r o m t h et u b e r o u sr o o t so fl i n s h a n 5 7a n dj i n s h a n 7 2a tt h ee a r l ya n dl a t e d e v e l o p i n gs t a g e s ，a n dw e r em e a s u r e db yh p l c t h er e s u l t sa r ea s f o l l o w i n g ： ( 1 ) t h ee x p r e s si o no f e a c h o ft h ef o u rg e n e sa tl a t e d e v e l o p m e n t a ls t a g ew e r ew e a k e rt h a nt h a to fe a r l yd e v e l o p m e n t a l s t a g ei nj i n s h a n 5 7 s u b s e q u e n t l y ，t h ec o n t e n to fb c a r o t e n ei n t u b e r o u sr o o t sa tl a t ed e v e l o p m e n t a ls t a g ew a s1 0 0 9 6 m g g ，l o w e r t h a nt h a to fe a r l yd e v e l o p m e n t a ls t a g e ，2 0 1 6 m g g 一1 ( 2 ) t h ee x p r e s s i o no fe a c ho f t h ef o u rg e n e sa tl a t e d e v e l o p m e n t a ls t a g ew e r es t r o n g e rt h a nt h a to fe a r l yd e v e l o p m e n t a l s t a g ei nj i n s h a n 7 2 ，s u b s e q u e n t l y ，t h ec o n t e n to fb c a r o t e n ei n t u b e r o u sr o o t sa tl a t ed e v e l o p m e n t a ls t a g ew a s5 0 6 8 8 m g g ，h i g h e r t h a nt h a to fe a r l yd e v e l o p m e n t a ls t a g e ，3 8 i1 2 m g g - 1 ( 3 ) c o m p a r a t i v e l y ，t h ee x p r e s so fe a c ho f t h ef o u r g e n e si n j i n s h a n 7 2w e r es t r o n g e rt h a nt h a ti nj i n s h a n5 7t h r o u g h o u tt h e d e v e l o p m e n t a lp e r i o d s ，t h ec o n t e n to fb - c a r o t e n ei nt h et u b e r o u s r o o t so fj i n s h a n 7 2w a sh i g h e rt h a nt h a t o fj i n s h a n5 7 k e yw o r d s ：s w e e t p o t a t o ( i p o m o e ab a t a t a s d ；b - c a r o t e n e ；g e n e c l o n e lt r a n s f o r m a t i o n ；d o tb l o t ；p h y t o e n es y n t h a s e ； p h y t o e n ed e s a t u r a s e ； 一c a r o t e n ed e s a t u r a s e ；l y c o p e n e b c y c l a s e 附表与附田清单： 第一幸： 图i - 1 高等植物中d 一胡萝卜素生物合成途径图解5 田1 2 基因克隆与鉴定技术路线图1 3 田1 - 3 基因表达研究与d 一胡萝卜素含量澍定技术路线图1 第二幸： 田2 - 1 用四种方法提取的总r n a i 琼脂糖凝肢电泳2 4 图2 - 2 甘薯朋稞守序列电泳图与同潭挂检索图2 5 图2 - 3 甘暑卿保守序列及其蝙码的氨基酸序列2 5 图2 - 4 甘薯加保守序列电泳图与同潭性检索2 6 田2 - 5 甘薯，出保守序列及其编码的氨基酸序列2 7 图2 - 6 甘薯z 出保守序列电泳，棱酸序列同溽性检索图2 7 图2 - 7 甘薯z 出保守序列及其蝙码的氨基酸序列2 8 图2 - 8 甘薯枷而保守序列及其编码的氨基酸2 8 图2 - 9 甘薯加而保守序列电泳与同源性检索2 9 表2 - i 常用p c r 体系：一2 2 表2 - 2 四种方法提取的r n a 的0 d 值与得率比较2 5 ， 第三章： 图3 - 1r a c e 技术流程图3 7 图3 - 2 甘薯p s y c d n a 全长及其推导的氨基酸序列4 0 图3 - 3 甘薯p s y 全长e d n a 电泳棱酸及推导的氨基t t y f 乡, j 同源性检索4 0 图3 - 4 甘薯p s y 与其它作物的p s i 多重比较与系统进化树4 2 图3 - 5 甘薯p s y 的c d d 搜索结果4 3 图3 - 6 甘薯p s y 基因的内舍子结构4 4 图3 - 7 甘暑础c d n a 的全长及推导的氨基酸序列4 7 固3 - 8 甘薯础全长e d n a 电泳牲酸及其推导的氨基酸同源性检索4 7 田3 _ 9 甘薯p d s 与其它作物的p d s 多重比较与系统进化树1 9 图3 - 1 0 甘薯p d s 的c d d 搜索结果5 0 图3 - 1 1 甘薯z d $ c d n a 的全长夏推导的氨基酸序列5 2 田3 - 1 2 甘薯z d s 全长e d n a 电泳，按酸及其推导的氨基酸序列同源性检索5 2 田3 - 1 3 甘薯z d s 与其它作物的z d s 多重比较与系统进化树5 5 图3 - 1 4 甘薯z d s 的c d d 搜索结果5 6 田3 - 1 5 枷而c d n a 的全长及推导的氨基酸序列5 7 图3 - 1 6 甘薯1 ，c - b 全长c d n a 电泳棱酸及其推导的氨基酸序列同涿性检索5 8 图3 - 1 7 甘薯l y c 与其它作物的l y c 多重比较与系统进化树6 0 田3 - 1 8 甘薯l y c 的c d d 搜索结i 巳6 l 表3 - 1r a c 瞰术的第一次p c r 体系3 6 表3 - 2 甘薯p s y 蛋白的氨基酸序列的功能结构域分析3 表3 - 3 甘薯p d s 蛋白的鼻d 基酸序列的功能结构城分析5 0 第四章： 图4 - i 植物表速成体i ，c a m b i a 2 3 0 0 p t - o s y 构建流程7 0 图4 - 2 植物表达巍体p c a m b i a 2 3 0 0 p t - p d s 构建漉程7 l 图4 - 3 植物表达成体p c 岫i 2 3 0 0 限础构建漉程7 2 图4 - - 4 植物表达我体p c a m b i a 2 3 0 0 p t - i ，c 构建流程7 3 图4 - 5p 2 3 0 0 m p 缈的p c r 与酶切鉴定7 6 图4 - 6p 2 3 0 0 m 肿的p c r 与酶切鉴定7 7 图4 - 7p 2 3 0 0 限础的p c r 鉴定7 7 图4 - 8p 2 3 0 0 p t - l ，c 的p c r 与酶切鉴定7 8 图4 - 9 转基因烟草的抗性芽，抗性植株与p c r 鉴定8 0 第五幸： 图5 - 1d 一胡萝卜素标准品色谱图8 9 图5 - 21 5 一胡萝卜素标准品标准曲线图一9 0 图5 - 3 金山5 7 生育前后期d 一胡萝卜素与番茄红素的液相色谱图9 0 图5 - 4 金山7 2 生育前，后期d 一胡萝卜素与番茄红素含量的液相色谱图9 l 图5 - 5 甘薯金& 5 7 ( 淡黄心) 与金山7 2 ( 红心) 薯肉魔色9 2 图5 - 6 探针标记效率测定9 3 图5 - 7 甘暑d 一胡萝卜素合成4 个系列酶基因在甘薯金& 5 7 与金d q 7 2 生育前、后期 的斑点杂交结果9 3 图5 - 8 甘薯金d a 7 2 块根与海芋果实的亚显微结构。示b 一胡萝卜素( 可能) 的 贮藏结构9 7 表5 - 1 标记的探针与对照稀释表上8 7 表5 - 2 甘薯金山5 7 与金, j a 7 2 生育前、后期p 一胡萝卜素含量9 1 附录：o 一胡萝卜素合成4 个酶基因保守序列与5 和3 端序列测序田1 2 4 x 缩略表 r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d e n d s c d n a 末端快速扩增技术 八氢番茄红素合成酶 八氢番茄红素脱氢酶 一胡萝卜素脱氢酶 番茄红素b 一环化酶 八氢番茄红素合成酶基因 八氢番茄红素脱氢酶基因 一胡萝卜素脱氢酶基因 番茄红素b 一环化酶基因 ( a m p i c i l i n ) 氨苄青霉素 ( 6 - b e n z y l a d e n i n e ) 6 一苄基嘌呤 ( b a s ep a i r ) 碱基对 ( c a r b e n i c i l l i n ) 羧苄青霉素 ( c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ) 十六烷基三甲基溴化胺 ( d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e ) 焦碳酸二乙脂 ( d i g o x i g e n i n ) 地高辛 ( e t h i d i u mb r o m i d e ) 溴化乙锭 ( e t h y l e n e d i a m i n e t e t r e e c e t i ca c i d ) 乙二胺四乙酸 ( i n d o l e 一3 一a c e t i ca c i d ) 吲哚乙酸 ( i s o p r o p y l 一卜t h i o 一8 一d - g a l a c t o s i d e )异丙基b - d - 半乳糖苷 ( k a n a m y c i n ) 卡那霉素 ( n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d ) 奈乙酸 ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) 开放阅读框 ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 聚合酶链式反应 水不溶性聚乙烯毗咯烷酮 ( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ) c d n a 末端快速扩增 ( r i f a m p i c i n ) 利福平 ( r e v e r s et r a n s c r i p t a s e ) 逆转录酶 ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) 十二脘基磺酸钠 ( s o d i u mc h l o r i d e s o d i u mc i t r a t e ( b u f f e r ) ) ( t r i s a c e t a t e b u f f e r ) ( t h e 脚u sa q u t i c u sd n ap o l y m e r a s e ) ( t r is e 1 ) t ab u f f e r ) ( t r i sh y d r o c h l o r i d e ) ( 5 - b r u m o 一4 一c h l o r o - 3 - i n d o l y l f - d - 三羟甲基氨基甲烷 5 一溴- 4 - 氯- 3 - 哼i 哚 x i 薹|科瞒粥一嬲础加枷椰涨如曲咖眦眦ffj叭m腓|莹嗽咖|曼盯哪蹴眦呦他慨m 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文；是在指导教师的指导下 通过我的努力取得的成果，并且是自己撰写的尽我所知，除了丈中作 了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写 过的研究成果与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明 确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承 担应有的责任 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：飞霸，奠新坟 日期：of 三 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规 定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以 公布i e 删j x - 部或部分内容。可以采用影印，缩印或其他复制手段保存 论文 保密，在二年后解密可适用本授权书 不保密，本论文属于不保密 口 e l 期：哆石2 - 日瓤啦石夕 文 名乏 签铲 笔莎 锻誓 作 ： 丈 名 论 签，笔 业 亲毕师 教 位导学指 福建农林大学博士学位论文 第一章研究概述与研究意义 本章摘要 类胡萝卜素家族庞大，共有6 0 0 多种，d 一胡萝卜素是其中最重要的 一员天然d 一胡萝卜素对人体健康具有重要的作用它有很强的抗氧化 性，可降低多种癌症特别是肺癌的发病率，同时它还是重要的营养素，在 体内可根据需要转化为v ，多余的d 一胡萝卜素不会产生副作用另外， d 一胡萝卜素还是一种优良的天然色素，广泛应用于医药、食品，化妆品 等领域d 一胡萝卜素的合成以g g p p 为前体，经p s y ，p i ) s ，z 1 ) s 和l y c - b 四 个酶逐步缩合，脱氢和环化。最终生成具两个紫罗酮环的d 一胡萝卜素 在许多植物和微生物中，d 一胡萝卜素合成的相关基因已得到克隆，有关 o 一胡萝卜素合成的基因工程也取得了很大进展根据有关研究的现状与 发展趋势，提出了本研究的内容、意义和技术路线 关键词：d 一胡萝卜素；保健功能；基因克隆；基因工程 1 p 一胡萝卜紊的功能 1 18 一胡萝卜素的一般性质 类胡萝卜素通常是指c 。的碳氢化合物( 胡萝卜素) 和它们的氨化衍生 物( 叶黄素) 两大类色素的总称，自然界中的类胡萝卜紊约有六百多种( 陶 俊等，2 0 0 2 ) d 一胡萝卜紊是类胡萝卜素家族最重要的一员，动物体内不 能从头合成d 一胡萝卜素，必须从食物中摄取，是动物体所盛需的( 赵红霞 等，2 0 0 2 ) 天然d 一胡萝卜素为深紫红色或红色晶体，熔点1 8 1 - 1 8 2 溶于二硫化碳，苯、氯仿，略溶于乙醚、石油醚、已烷及植物油，微溶于 甲醇、乙醇，不溶于水、酸、碱稀溶液显黄色，对空气、热、光敏感， 在溶液中格外敏感在空气中易氧化变为无色、无活性的氧化产物维生 素a 的环结构与o 一胡萝卜素的两个环结构相同，因此一分子d 一胡萝卜素 可以加水断裂为2 分子的维生素a 人体摄入d 一胡萝卜紊后，在肠道内 通过一个氧化酶催化加水分解反应，断裂为两个分子的维生素a ( 全反式 维生素a ) ，不同的胡萝卜紊转化为维生素a 的效率并不一致，d 一胡萝卜 素效率最高，a 一胡萝卜素与y 一胡萝卜素仅为d 一胡萝卜素的一半或更低 d 一胡萝卜素有各种顺反异构体，例如：全反式一d 一胡萝卜素 ( a l l - t r a n s d c a r o t e n e ) ；9 一顺式一d 一胡萝卜素( 9 - c i s - d - c a r o t e n e ) ； 1 3 一顺式一d 一胡萝卜素( 1 3 - c i s - d - c a r o t e n e ) 目前化学合成法还无法合 福建农林大学博士学位论文 成顺式异构体，天然d 一胡萝卜紊含有接近4 0 的顺式异构体。而顺式异 构体己被临床证明其抗癌、抗心血管疾病以及保健功能远远高于全反式异 构体( 中国医药资讯网，h t