（免疫学专业论文）人man2c1转基因动物模型的建立及相关研究.pdf

冲国医学科学院中国协和医科大学研究生毕业论文 中文摘要 m a n 2 c 1 是本实验室克隆的c d n a 编码的1 个人q 甘露糖苷酶。我们原先称 它为6 a 8 旺一甘露糖苷酶。国际已命名此酶为m a l l t l o s i d a s e ，a l p h a ，c l a s s2 c ，m e m b e r1 【乒，0 口j 印f p n j 】，简称m a n 2 c l 。其相应的基因位于染色体1 5 q 1 1 q 1 3 。h u g 0 基因 命名委员会命名此基因为心_ 2 c 。m a n 2 c 1 的分子量在非糖基化情况下为。1 1 6 k d a 。 为研究m a n 2 c 1 的生物学意义，本实验室用反义技术抑制捌 旧c 基因在细胞 中的表达，观察到：人b 淋巴细胞瘤细胞株b j a b 发生肿胀样死亡；人t 淋巴瘤细 胞株j u r k a t 细胞间黏附增强，包括c d 5 4 和l f a 1 等不少黏附分子及与黏附相关的 分子的表达增强，细胞的骨架蛋白发生重排：e b 病毒转化的人b 细胞s k w 6 对抗 f a s 抗体诱导的凋亡发生抵抗；人鼻咽癌细胞株c n e - 2 l 2 的恶性生物学行为( 肿 瘤的生长和转移) 减弱，细胞间的黏附增强，细胞的e 钙黏蛋白表达增高，细胞的 端粒变短。 但是，要深入了解m a n 2 c 1 的生物学意义，除了进一步研究删 堙c 基因表 达对多种细胞生物学行为的影响外，还必须在整体水平作研究。这包括制备转基因 动物和基因敲除动物。本硕士论文工作的目的是制备转人刎2 c j 基因小鼠。我构 建了表达载体p i r e s 2 e g f p m a n 2 c 1 ，荧光检测表明它转入细胞后能表达插入的 基因。为使基因整合入基因组的效率增高，把p i r e s 2 e g f p m a n 2 c l 切成线状。 转染细胞的实验表明，线性化对基因的表达没有影响。转基因小鼠在北京实验动物 中心制备。得到小鼠后，用基因组p c r 检测删2 c 基因整合入小鼠基因组的情 况。在北京实验动物中心提供的1 1 6 只小鼠中，共检测到8 只阳性小鼠。经配对繁 殖得到f 1 代小鼠。基因组p c r 检测见1 2 小鼠为阳性。阳性f 1 代小鼠合笼在f 2 代有。3 4 小鼠阳性。用r t - p c r 检测了捌 眩c 基因在转基因鼠尾部组织中的转录， 在7 个系的小鼠中有4 个为m a n 2 c 1m 心j a 阳性。为作w e s t c m 印迹检测，我在 原核细胞表达了m a n 2 c 1 分子的中的g l y c o _ h y d r o 一3 8 结构域蛋白，用它免疫小鼠， 制备了抗m a n 2 c 1 的单克隆抗体3 8 1 0 。用单克隆抗体3 8 1 0 作探针，取小鼠尾部 组织，提取蛋白质，w j s t e m 印迹检测见这4 个系的小鼠为阳性。这表明，我已成 ：主旦垦兰型堂堕! 里塑塑堕型查兰翌塞皇望些笙塞 功地制备了转枷2 c 基因小鼠。我对转心2 c 基因小鼠与对照小鼠的胸腺、 脾脏、骨髓及小肠作了组织学比较，未发现明显差异。我还比较了转捌 堙c 基因 小鼠与对照小鼠小肠上皮细胞的增殖情况，也未发现明显差异。 本论文工作还构建了p e g f p _ n 1 m a n 2 c 1 ，用转染实验分析了m a n 2 c 1 在细 胞中的定位。初步观察表明，m a n 2 c 1 定位于细胞的胞质中。另外，本论文工作还 用i r n a 技术抑制了小鼠m a n 2 c l 高表达的n i h 3 t 3 细胞中心2 c ，基因的表达， 为研究小鼠m a n 2 c 1 的生物学意义打下了一点基础。 关键词：旺一甘露糖苷酶，m a n 2 c 1 ，6 a 8c 【甘露糖苷酶，心 ，2 c j 基因，转基因小 鼠，单克隆抗体，细胞内定位，i 砌q a - 中国医学科学院中国协和医科大学研究生毕业论文 a bs t r a c t m a n 2 c 1i sah u m a na l p h a - m a n n o s i d a s ec n c o d e db yac d n ac l o n e di no u r l a b ， w h i c hw e o r i g i n a l l y c a l l e d6 a 8a l p h a m a 衄o s i d a s e t h i s e n z y m e h a sb e e n i m e m a t i o n a l l yn a t l l e dm a n n o s i d a s e ，a l p h a ， c l a s s2 c ，m e m b e r1 【胁m os 印f e 邶】， a b b r e v i a t e da sm a n 2 c 1 t h er e l e v a n tg e n el o c a t e sa tc l l r o m o s o m e1 5 q l l - 1 3 c o m m i t t e eo fh u m a i lg e n en o m e n c l a t u r e ( h u g o ) h a sn 锄e dm eg e n e 纠2 c m a n 2 c 1h a sar n o i e c u l a rw e i g h to f 1 1 6k d ai nd e g l y c o s y l a t i o ns t a t e i nt h cs t u d yo ft h eb i o l o g i c a ls i g n m c a n c eo fm a n 2 c 1 ，a i l t i s e n s et e c h n i q u eh a s b e e nu s e dt os p e c m c a l l yi i l h i b i te x p r e s s i o no f 删2 c g e n ei no u r l a b o r a t o 珥w e o b s e r v e d1 ) t h a ti n h i b i t i o no f 且z 4 2 c g e n ee x p r e s s i o nc u j s e do n c o s i s l i k ed e a t ho f b j a bc e l l s ；2 ) t h a ti n h i b i t i o no f 铂 ，2 c jg e n ee x p r e s s i o nr e s u l t e di ne n h a l l c e da d h e s i o n b 咖e e nj u r k a ttc e l l sa n db 咖e e nj m k a ttc e ua n dr a j ibc e l l ，e n h a n c e de x p r e s s i o no f an u m b e ro fa d h e s i o nm 0 1 e c u l e si n c l u d i n gc d 5 4a i l dl f a l ，a 1 1 dr e a r r a l l g e m e mo f c y t o s k e l e t o n ；a n d3 ) t h a ti 出b i t i o no f 删加c jg e n ee x p r e s s i o nr e s u l t e di na r e s i s t a l l c e o fe bv i r u s t r a n 8 f o r m e dh u m a nbc e ns k w 6t oa p o p t o s i si n d u c e db ya n t i f a sm a b ；4 ) m a ti n h i b i t i o no f 删 2 c jg e n ee x p r e s s i o nr e s u l t e di nr e d u c e dg r o 叭ha n d m e t a s t a s i so f h u m a nn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o mc n e - 2 l 2 ，e i l l l a n c e da d h e s i o nb e t w e e nt h ec a i l c e r c e l l s ，e n h a n c e de x p r e s s i o no f e c a d h a r i n ，a 1 1 ds h o n e n i n go f t e l o m e r e1 e n g t hi nn l ec a l l c e r c e l l h o w e v e r ，t ob e t t e ru n d e r s t a n d i n gt h eb i o l o g i c a ls i g n m c a i l c e o fm a n 2 c 1 ，i n a d d i t i o nt oi n v e s t i g a t em ee 色c to f 铂2 c g e n ee x p r e s s i o no nv a r i o u st y p e so fc e l l s ， s t u d ym u s tb ep e r f o 肌e do na i l i m a ll e v e l t h a ti st op r e p a r e 纠2 c 仃：m s g e n i cm i c e a 1 1 d 心 ，2 c jg e n ek n o c k o mm i c e t h ep u r p o s eo fm ym e s i si s t op r e p a r e 捌加c ， t r a n s g e n i cm i c e in r s tc o n s t r u c t e dar e c o m b i n 鼬l te x p r e s s i o nv a c t o rp i r e s 2 一e g f p m a n 2 c 1 t h a t n u o r e s c e n c ew a se m i t t e df r o mp i r e s 2 - e g f p m a n 2 c l t r a n s f e c t e dc e l l si n d i c a t e dt h e 删 2 c ，i n s e r t e di nt h ep l a s m i dc o u i dn _ a n s c r i b et op r o d u c eh 厦a n 2 c 1 i no r d e rt o e ：! 里堕兰壁堂堕! 璺塑塑堕型查堂竺塞生里些丝苎 i m p r o v et h ee 肺c i e n c yo fi n t e 掣a t i o no f 纠2 c jg e n ei n t ot h eg e n o m i cd n ao fm i c e ， t h ep i r e s 2 一e g f p m a n 2 c lw a s d i g e s t e di m ol i n e a rd n a 1 t a n s f e c t i o nt e s ts h o w e dn o n e g a t i v ei n n u e n c eo ft h cl i n e a l i z a t i o no ne x p r e s s i o no f 心 r 2 c g e n e n a i l s g e n i cm i c e w e f ep f 印a r e di nb e i j i n ge x p e r i m e n 诅la n i m a lc e n t e lt h ei n t e 譬r a t i o n o fh u m a n 心加c g e n ei nt h eh o s tg e n o m i cd n aw a se x a m i n e db ym e a i l so fg e n o m i cp c r o u t o fl i6m i c ep r o v i d e db yt h ec e n t e r ，8w e r ep o s i t i v e g e n o m i cp c rf o rh u m a n 利 ，2 c ， d e m o n s t r a t e dp o s i t i v em i c ei n l 2f 1m i c ea n d 3 4i nf 2m i c e i u 二p c rf o rh u m a l l m a n 2 c 1m r n ad e m o n s t r a t c dp o s i t i v ei n40 u to f7m i c ew h i c hw e r ep o s 描v ei nm e g e n o m i cp c r f o fw e s t e mb l o ta n a l ) ，s i s ，id e v e l o p e dam a br c a c t i v et om a n 2 c1 p r o t e i n t h ec d n a 丘a g m a c m e n c o d i r 培t h e 酉y c o h y d r o 一3 8d o m a i nw a sp c re m p l 俯e d f b m6 a 8c d n a t h er e l e v a n tp r o t e i nw a se x p r e s s e d 血p r o k a r y o c ) r t e s a 鼠e rb e i n g p u r m c a t i o n ，t 1 1 ep r o t e i nw a su s e df o ri m m u n i z a t i o no fm i c e am a bc a l l e d3 8 1 0w a s d e v e l o p e dr a c t i v et oh 啪a nm a n 2 c 1 w e s t e mb l o ta i l a l y s i sp e r f o m e do nt h ep r o t e l n s e x t r a c t e d 矗o mm o u s et a i ls h o w e dm a n 2 c 1e x p r c s s i o np o s i t i v ei nt h e4m a n 2 c 1 m r n ap o s i t i v em i c e t h ed a t ai n d i c a t eas u c c e s si nd e v e l o p m e mo fh u m a n 删 口c t r a r l s g e n i cm i c e ie x 锄i n e dt b eh i s t 0 1 0 9 i c a lp h e n o t y p eo f m et r a n s g e n i cm i c eo nt h y m u s ， s p l e e n ，b o n em a r r o w 觚ds m a l li i l t c s t i i l e ia l s oa i l a l y z e dt h ep r o l i f e r a t i o ns t a t eo fm e e p i h e l i a ic e l si ns m a l li n t e s t i n e n oc h a n g ew a sf o u n di nb o t h 也ee x a m i n a t i o n si n c o m p a “s o nt on o m l a lc o n t m i i n a d d i t i o n ，ie x 锄i n e dt h e1 0 c a l i z a t i o no fm a n 2 c li nc d i su s i n gp l a s m i d p e g f p n 1 t h ed a t ai m p l yt l 】a tt 1 1 eh u m a nm a n 2 c 1i s1 0 c a l i z e da tt h ec ”o p 】a s m i n o r d e rt os t u d yt h eb i o i o g i c a ls i 嘶f i c a n c eo fm o u s em a n 2 c 1 ，e x p r e s s i o no fm o u s e 州 口c ，g e n ew a si n h i b i t e di nn i h 一3 t 3c e nb yi r n at e c h n j q u e t h ec e l lw i t hi n h i b i t e d e x p r e s s i o no f m o u s e 捌j 2 c jg e n ew 0 1 l l db eh e l p f l l l t ot h es t u d yi nt 1 1 ef u t u r e k e yw o r d s ：a l p h a m a n n o s i d a s e ，m a n 2 c 1 ，6 a 80 【一m 籼o s i d a s e ， 硝2 c g e n e t r a n s g e n i cm i c e ，m a b ，i n t r a c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n ，i r = n a 6 - 中国医学科学院中国协和医科大学研究生毕业论文 刖舌 人6 a 8c 【- 甘露糖苷酶是我们实验室克隆的c d n a ( g e n b a i l k 登记号a f 0 4 4 4 1 4 ) 编码的【1 】。此c d n a 长31 2 3b p ，编码产生的旺一甘露糖苷酶长1 0 4 0a a ，分子量在去 糖基化状态下为6k d a 。6 a 8 甘露糖苷酶己被国际命名为m a l l n o s i d a s e ，a l p h a ， c l a s s2 c ，m e m b e r1 【如州os 印f e h s 】，简称m a n 2 c 1 。其相应的基因位于染色体 1 5 q 1 1 一q 1 3 。其g e n e i d 为4 1 2 3 。基因长1 2 8 0 9 b p ，内含1 6 个外显子和1 5 个内含子。 h u g o 基因命名委员会命名此基因为删2 c j 。 一甘露糖苷酶是一类糖苷酶，它催化末端非还原性的0 【d 甘露糖的水解。旺一甘 露糖苷酶参与细胞内新生蛋白质的- 糖基化作用，也降解成熟糖蛋白。蛋白质在细 胞核糖体中翻译出来后，要经受多种翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、乙酰化、甲 基化等。其中的糖基化过程十分复杂。根据糖基化位点的不同，蛋白质的糖基化有 _ 糖基化和0 一糖基化之分。新合成蛋白质的n 糖基化起始于内质网( e r ) 的腔面， 最终在高尔基体中完成【2 】。新生的蛋白质一穿过内质网膜，1 个寡聚糖转移复合物 就把与脂相连的前体寡糖转移并连接到蛋白质的a s n x s e 以1 1 r 序列子中的天冬氨 酸上，糖基化的修饰就此开始。有两大类酶糖酰基转移酶和糖苷酶催化- 糖基化 过程 3 】。此寡聚糖链中的3 个葡萄糖被葡萄糖苷酶i 和i i 剪切掉【4 】。寡聚糖链中部 分甘露糖在内质网中被该处的甘露糖苷酶剪切掉。成熟过程中的糖蛋白进入高尔 基体，高尔基体中的洳甘露糖苷酶i 和i i 进一步修剪糖蛋白中的甘露糖。随后， 各种糖酰基转移酶把各相应的单糖运送到分支糖链的末端，各种糖苷酶又不断剪切 分支糖链末端的糖，从而产生出组成和结构十分复杂的- 聚糖。成熟的糖蛋白在向 细胞各部位运送途中，溶酶体和胞质中的似甘露糖苷酶也会进一步对其- 聚糖作修 饰。蛋白质的_ 聚糖有高甘露糖型( h i 曲m 眦o s e - t y p e ) 、杂合型( h y b r i d t y p e ) 和复 杂型( c o m p l “一t y p e ) 。蛋白质的糖基化，包括- 糖基化，影响蛋白质的折叠、透送、 定位、表达、抗原性和稳定性等生物学性质，从而影响所在细胞的生物学行为【5 】。 糖酰基转移酶具有底物专一性，目前发现的已有2 0 0 多个【6 。糖苷酶则依据其 所剪切的糖的种类而分为葡萄糖苷酶、甘露糖苷酶、半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶等。 甘露糖苷酶又依据它们所催化水解的键位构型的不同分为一甘露糖苷酶和p 一甘露糖 ：! 璺垦堂型堂堕主里塑塑匡登查兰堑塞竺兰些笙兰 苷酶。一甘露糖苷酶有多种形式，基于生化性质的不同、催化机制的不同、及分子 中保守的氨基酸序列的不同，c 一甘露糖苷酶又分成i 类和i i 类两大类 7 。i 类一 甘露糖苷酶分子中有g l y c o _ h y d r o j 7 保守序列【8 ，分子量4 9 7 3k d a ，特异地剪切 a l ，2 甘露糖苷键，其活性需要c a 2 + ，其催化作用易被d m n j ( d e o x y m a n 眦o m 玎l y c i n ) 和k i f ( k i f l m e n s i n e ) 抑制【9 】。i i 类- 甘露糖苷酶分子中有9 1 y c o j y d r 0 3 8 保守序 列，分子量1 1 0 1 3 5k d a ，剪切c 1 ，2 一，1 ，3 一，a 1 ，6 一甘露糖苷键，其活性也许需要二 价离子，其催化作用易被s w a i n s o n i n e 等抑制 1 0 】。依据序列的不同，i i 类a 一甘露糖 苷酶又分成3 类_ a 、b 和c 。它们被分别命名为m a n 2 a 、m a n 2 b 和m a n 2 c 。在 人，已发现并被命名的m a n 2 a 酶有m a n 2 a 1 ( g o l g i m a n n o s i d a s ei i ) 和m a n 2 a 2 ( g 0 1 9 id 。m a 衄o s i d a s ei i x ) ，己发现并被命名的m a n 2 b 酶有m a n 2 8 1 ( 1 y s o s o m a l 仪- m a n n o s i d a s e ) 和m a n 2 8 2 ( ah u m a nh o m o l o g l l eo ft h ep o r c i n e1 3 5k d a 0 【d _ m a n n o s i d a s e ) ，已发现并被命名的m a n 2 c 酶只有h 4 a n 2 c 1 ( 6 a 8o 【一甘露糖苷 酶) 。 为研究c 【甘露糖菅酶的生物学意义，人们起初采用化学抑制物来抑制细胞中的 伍一甘露糖苷酶，如1 ，4 一d i d e o x y 一1 ，4 一i m i n o - d m a n n o l 、s w a i n s o n i n e 、d m n j 和k i f 等【1 1 ， 1 2 1 。但是，化学抑制物的作用是非特异的，如s w a i n s o n i n e 对几乎所有i i 类旺一甘露 糖苷酶均有抑制作用【1 3 】，而且化学抑制物应用到临床还会有副作用，如s w a i n s o n i n e 会引起糖类在组织中的积累( 如溶酶体储留) ，尽管在不同组织存在着区别 1 4 。 s w a i n s o n i n e 还会在蓄养家畜引起风草病【1 5 】。因此，很难用化学抑制物来研究某个 具体的c 【甘露糖苷酶的生物学意义。鉴于有用反义技术抑制某个酶( 如次黄嘌呤鸟 嘌呤磷酸核糖转移酶) 以研究该酶的生物学意义的报道 1 6 】，本实验室用反义技术 特异地抑制细胞中俐2 c 基因的表达，以研究m a n 2 c 1 表达抑制对细胞生物学 行为的影响。值甘露糖苷酶的表达具有组织特异性【1 7 】，而且还随发育时期而变化 1 8 1 。例如，c 【甘露糖苷酶i a 表达在各时期是稳定的，而a - 甘露糖苷酶i b 在小鼠 发育1 0 5 天到1 4 5 天表达较高 1 9 。可以设想，抑制某- 甘露糖苷酶的表达或活性 对不同细胞的影响是不同的。因此，我们在多种细胞研究了m a n 2 c 1 的生物学意 义，观察到：在人b 淋巴细胞瘤细胞株b j a b ，刎 r 2 c 基【司表达抑制导致细胞发 生肿胀样死亡 2 0 】；在人t 淋巴瘤细胞株j “锄，删a 口c j 基因表达抑制导致细胞 ：! 里垦兰型堂堕! 里堡塑垦型查兰! 塞生兰、业笙墨 间黏附增强，包括c d 5 4 和l f a 1 等不少黏附分子及与黏附相关的分子的表达增强， 细胞的骨架蛋白发生重排 2 1 ；在e b ( e p s t e i n b a r r ) 病毒转化的人b 细胞s k w 6 ， 枷2 c j 基因表达抑制导致细胞对抗。f a s 抗体诱导的凋亡发生抵抗【2 2 ；在入鼻咽 癌细胞株c n e 一2 l 2 ，心2 c 基因表达抑制导致细胞的恶性生物学行为( 肿瘤的生 长和转移) 减弱，细胞间的黏附性增强，细胞的e _ 钙黏蛋白表达增高 2 3 ，还导致 细胞的端粒变短 2 4 】。 但是，细胞水平的研究对了解某个蛋白，包括某个c 【一甘露糖苷酶的生物学意义 是十分局限的，尚须在整体水平作深入的研究。舭甘露糖菅酶遗传缺陷患者给我们 提供了研究旺甘露糖苷酶生物学意义的天然的人体模型【2 5 。二型红细胞性贫血或 h e m p a s ( h e r e d i t a r ye r 沁r o b i a s t i cm u l t i n u c l e a r 时w m lp o s i t i v ea c l d i 6 e ds e n 】n 1l y s i s t e s t ) 是一种罕见的遗传性贫血症。生化分析发现它是由于高尔基体甘露糖苷酶i i 缺陷导致红细胞表面糖蛋白糖基化缺陷 2 6 】。也有学者建立了基因敲除0 【一甘露糖苷 酶缺陷小鼠。小鼠高尔基体吐甘露糖苷酶i i 基因缺陷在表型上和人的a 甘露糖菅 酶遗传缺陷有很多地方相似【2 7 】，而且突变小鼠在糖基化发生变化之后表现出系统 性的自身免疫异常。在小鼠的a 甘露糖苷酶i i x 基因( 【) 被敲除后，m x 缺陷雄 鼠不育，输精管内生精细胞明显减少，精细胞未能和睾丸滋养细胞黏附 2 8 。这一 结果提示一甘露糖苷酶i k 在精子发生过程中起到了重要作用。本研究的目的是制 各删a 狄一的转基因小鼠。如果删i j = 2 口的转基因小鼠能成功除制各，就能通过 分析转删2 c j 基因对小鼠的表型影响以特异地研究m a n 2 c l 的功能，还可研究 m a n 2 c 1 对如肿瘤生长、对抗原的免疫应答、及对感染的抵抗等的影响。 ：! 旦墼兰型兰堕! 里堡塑堕型查兰! 窒竺兰! ! 望塞 材料与方法 一、材料 1 菌株和质粒 大肠杆菌d h 5 。l ( 遗传型j 妒e 4 4 自j 棵1 7 旭c a le d a l a 9 6 ) 和b l 2 i ( d e 3 ) 保 存于本实验室。质粒p e t _ 3 0 a 、p i r e s 2 - e g f p 、p e g f p n 1 亦保存于本实验室。质 粒p x s n i n u 6 和p v s v o 等由本研究所宫环博士惠赠。 2 细胞系 c o s 。7 ( 非洲绿猴肾细胞) 、h e l a ( 人子宫颈癌细胞) 、j u r k a t ( 人外周血淋巴t 细胞) 、3 d 5 ( e b 病毒转化的人b 淋巴细胞) 及n i h 一3 t 3 冻存于本实验室。g p - 2 9 3 ( 人胚胎肾细胞) 由本研究所官环博士惠赠。m e l ( 鼠红白血病细胞) 、m e l d 1 9 、 l 1 2 1 0 ( 鼠淋巴系自血病细胞) 、b 1 6 ( 鼠和黑色素瘤细胞) 、m f c ( 鼠胃癌细胞) 和c 1 2 7 ( 鼠乳腺癌细胞) 等由本研究所杨峰博士惠赠。s p 2 ，0 ( 鼠骨髓瘤细胞) 细 胞为陈实平老师所赠。 3 实验动物 4 6 周龄b a l b 肛雌性小鼠购自医科院实验动物研究所。近交系，适合与s p 2 o 细胞融合制各单抗。 i c r ( c d l ) 小鼠购自北京市实验动物中心，远交系，繁殖力强，可用于转基 凼实验。 限制性内切酶及其它修饰酶类 实验所用的限制性内切酶分别购自t a k a r a 公司、n e we g l a n db i o l a b s 公司和 p r o m e g a 公司。t 4d n ap o l y m e r a s e 购自1 擞a r a 公司。1 1 a q d n a p 。l y m e m s e 为华美 p r o m e g a 公司。t 4 d n a p 。i ，r m e r a s e 购自1 姒a r a 公司。t h q d n a p 。l y m e m s e 为华美 1 0 ：! 璺垦茎型兰堕! 璺堡塑堕型查兰婴窒生兰些丝苎 材料与方法 一、材料 1 。菌株和质粒 大肠杆菌d h 5 q ( 遗传型j 妒e 4 4 触讯1 7 胛以1p 陇丛1 舒矿a 9 6 ) 和b l 2 1 ( d e 3 ) 保 存于本实验室。质粒p e t 3 0 a 、p i r e s 2 e g f p 、p e g f p n 1 亦保存于本实验室。质 粒p x s n m u 6 和p v s v g 等由本研究所富环博士惠赠。 2 细胞系 c o s 。7 ( 非洲绿猴肾细胞) 、h e l a ( 人子宫颈癌细胞) 、j u r k a t ( 人外周血淋巴t 细胞) 、3 d 5 ( e b 病毒转化的人b 淋巴细胞) 及n i h 3 t 3 冻存于本实验室。g p 2 9 3 ( 人胚胎肾细胞) 由本研究所宫环博士惠赠。m e l ( 鼠红白血病细胞) 、m e l d 1 9 、 l 1 2 1 0 ( 鼠淋巴系白血病细胞) 、b 1 6 ( 鼠和黑色素瘤细胞) 、m f c ( 鼠胃癌细胞) 和c 1 2 7 ( 鼠乳腺癌细胞) 等由本研究所杨峰博士惠赠。s p 2 0 ( 鼠骨髓瘤细胞) 细 胞为陈实平老师所赠。 3 实验动物 4 6 周龄b a l b ，c 雌性小鼠购自医科院实验动物研究所。近交系，适合与s p 2 o 细胞融合制备单抗。 i c r ( c d l ) 小鼠购自北京市实验动物中心，远交系，繁殖力强，可用于转基 因实验。 限制性内切酶及其它修饰酶类 实验所用的限制性内切酶分别购自t a k a r a 公司、n e we n g l a n db i 0 1 a b s 公司和 p r o m e g a 公司。t 4d n ap o i y m e r a s e 购自1 、a k a r a 公司。t a qd n a p o l y m e m s e 为华美 中国医学科学院中国协和医科大学研究生毕业论文 公司产品。r n a s e a 购自p r o m e g a 公司。p m t c i n a s e k 为m e r c k 公司产品。 5 抗体 i r p 标记的兔抗小鼠i g g 十i 酬购自j a c k s o n 公司。 6 其它主要试剂及试剂盒 胎牛血清( f e t a lb o v i n es e r m ，f b s ) 和i m d m 培养基为美国g i b c o 公司产品。 r p m i1 6 4 0 培养基、o p t i m e m 无血清培养基和d m e m 培养基为h y c l o n e 公司产品。 5 0 p e g 为德国b o e h i n g e rm a i l i l l l e i m 公司产品。h a 、h t 、8 a 、甲基纤维素、丙 烯酰胺、n ，n 甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、t e m e d 、s d s 、d m s o 、c f a 、i f a 和尿素为美国s i g m a 公司产品。p v d f 膜购自m i l l i p o r e 公司。t r y p s i n 产自d i f c o 公 司。快速杂交液产自c l o c e c h 公司。t r i z o l 抽提液、s u p e r s c r i p ti ir n a s e h 。r e v e r s e n a n s c r i p t a s e 反转录试剂盒为i n v i 仰g e n e 公司产品。p c r 及胶纯化回收试剂盒为 p r o m e g a 公司产品。d n a 分子量m a r k e r 产自t a k a r a 公司和本研究所。蛋白和 预染蛋白m a r k e r 为n e b 公司产品。w e s t e mb 1 0 t t i n gl u m i n a lr e a g e n t 为p i e r c e 产品。l i p o f e c t 锄i n e2 0 0 0 购自i n v i t r o g e n e 公司。探针标记试剂盒为p r o m e g a 公司 产品。b c a p m t e i n a s s a yk i t 为p i e r c e 产品。所用引物由北京三博远志公司合成。培 养用平皿和培养板为c o s t a r 公司和b d 公司所产。离心管和p c r 管购自a x y g e n 公 司。r o c h ei s o s 订i pm o u s em a bi s o t y p i n gk i t 为罗氏公司产品。 7 主要仪器 高速低温离心机分别为h e t t i c h 公司和h e r a e u s 公司所产； 紫外交联仪( g sg e n el i l l k e r ) 为b i o r a d 公司产品； 纯水制各器为m i l l i p o r e 公司产品； 细胞培养箱为q u e u e 公司产品； p c r 热循环仪( d 咐a t h e r m a lc y c l e r ) 为德国b i o m e t r a 公司产品 倒置荧光显微镜分别为0 l y m p u s 和n i k o n 公司产品； ：主旦垦堂型堂堕! 垦塑塑匡型查堂竺窒生兰些丝兰 倒置显微镜由重庆光学仪器厂生产，配n i k o n 数码相机： 激光共聚焦扫描显微镜为德国莱卡公司产品： 6 8 0 型酶标仪为b i o r a d 产品： d y y _ i i i 一7 b 转移电泳仪为六一仪器厂生产； s h z 一8 2 型恒温振荡器由江苏太仓医疗器械厂生产； 台式8 2 8 型p h i s e 测试仪为美国o r i o n 公司产品； e k - 1 2 0 电子天平为日本a a n d d 公司产品。 8 放射性核素 【0 l 3 2 p d c t p ，比活性为3 0 0 0 m c i ，m m o l ，为北京亚辉公司产品 二、方法 1 质粒的构建 1 1 酶切反应 在反应体系中加入相应的1 0 x 缓冲液。按照1 峙d n a 需1 1 0u 的用量加入内 切酶，内切酶的体积不得大于总体积的十分之一。用去离子水补足体系总量。如需 长时间消化，还需加入适量的b s a ，以稳定内切酶的活性。 1 - 2d n a 片段回收 欲回收的d n a 片段经低浓度( 0 7 5 ) 琼脂糖凝胶电泳分离后，按照试剂盒的说 明书操作，切下所需片段所在的凝胶( 胶的体积尽量的小) 。加入等体积的溶解液， 置7 0 。c1 0m l n ，每隔2 分钟涡旋混匀一次，待凝胶完全溶解。上柱，1 2 0 0 0 r p m 室 温离心lm i n 。用洗涤液洗涤柱子2 次后，离心甩干柱子，加入适当体积的去离子 水。离心收集液体，琼脂糖凝胶电泳鉴定质量，确定回收效率。 - 中国医学科学院中国协和医科大学研究生毕业论文 1 3d n a 片段3 凸端的削平 于e p p e n d o r f 管中依次加入d n a 0 2 5 g 、2m m d n t p si l 、任意一种酶切缓 冲液( 1 0 x ) 2 l l ，加去离子水至1 9 牡l 。然后，加入1 2u 的t 4 噬菌体d n a 聚合 酶。置2 5 温育1 5m i n 。再于7 5 加热1 0m i n ，使t 4 噬菌体d n a 聚合酶灭活。 经d n a 电泳定量后，直接进行连接反应，或一2 0 保存【2 9 】。 1 4 载体的脱磷酸让 载体矮粒经内切酶酶切质可直接进行脱磷酸化处理。酶切反应体系为4 0l l l 。经 电泳检测酶切完全后，加入1 0 c i a p ( 牛小肠碱性磷酸酶) 缓冲液5 “l 、去离子水 4u l 和适量c i a p ，进行脱磷酸反应。 c i a p 的用量依载体5 端磷酸的摩尔数及末端性质而定。对于5 突出的末端， 每1 0 0p m o l e s5 末端磷酸需l uc i a p ；对于5 凹进或平末端，每2p m o l e s5 末端磷 酸需l uc i a p 。一般2 l g 量5k b 的线性化质粒d l q a 中约有i 4p m o l e s5 末端磷酸。 反应条件：1 ) 5 。突出末端：加入c l 蝴后于3 7 反应3 0m i n ，再加另一小份 c i a p ( 加入量依d n a 量两定) ，继续反应3 0m 溉5 凹进或平末端：加入c i a p 后于3 7 反应1 5m i n 。5 6 反应1 5m i n ，加另一小份c i a p ( 加入量依d n a 量而 定) ，再于3 7 反应1 5m i n ，5 6 反应1 5m i n 。 反应结束后，加3 0 0 山c i a p 反应终止液( 1 0m m t r i s h c lp h7 5 ，lm m e d l a p h7 5 ，2 0 0m m n a c l ，0 5 s d s ) 。依次用酚、酚，氯仿和氯仿抽提，加0 5 倍体积7 m 醋酸铵和2 倍体积酒糟沉淀，室温晾干，溶于适量t e 缓冲液中【3 0 】。 l ，5 连接反应 用适当的内切酶酶切载体和插入片段。d 1 a 片段回收后行电泳，比较二者的 浓度。按载体与插入片段之比为l ：4 6 ( 或更多的片断) 将二者加入到连接反应体系 中，加入l o 连接缓冲液1 川，聿卜水至l o 弘l 。取出1 肚l 作连接前对照，然后加入1 u t 4d n a 连接酶( 平末端连接加入5u t 4d n a 连接酶) ，置1 6 水浴过夜，或室温 - 中国医学科学院中国协和医科大学研究生毕业论文 连接4h 。平末端连接在2 0 一2 2 进行。之后转化大肠杆菌感受态细胞。 1 6 感受态大肠杆菌细胞制备 将宿主菌的单菌落接种到5m 1l b 培养基中，于3 7 振摇过夜。次日取l 5 0 体积的过夜菌液，接种于5 0 1 0 0 “l b 培养基中。于3 7 振摇，待菌液0 d 6 0 0 接 近o 3 0 4 时，于4 、4 0 0 0r p m 离心1 0 m i n 。收集菌体。取原菌液体积的1 5 体积 预冷的o 1mc a c l 2 溶液，轻轻加至菌体中，于冰浴上轻轻摇动离心管，使菌体缓 慢散开。置冰浴中2 0m i n 。4 离心，弃上清。重复上一次操作。同样条件下离心， 收集菌体后，向菌体中加1 5 0 体积预冷的c a c l 2 ，混匀，静置于冰浴中1 2h 后用于 转化。感受态细胞于4 保存1 周仍可维持较高效率，或加入1 5 体积的甘油冻存 于7 0 f 3 1 。 1 7 转化 取新鲜制备的感受态细胞溶液1 0 0m ，置于1 5m l 的e p p e n d o r f 管中。加入5 l 连接反应液，轻轻混匀，冰上静置3 0m i n 。然后置于4 2 水浴中热休克9 0s e c 。加 入0 5m ll b 培养基，3 7 振摇4 0m i n 。然后接种于含抗菌素的l b 平板上，3 7 温箱培养1 0 1 2h 后观察菌落生长情况 3 2 】。 1 8 质粒d n a 的小量制备 置过夜培养的转化细菌液于1 5 m l e p p e n d o r f 管中，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0s e c 。倾 出上清，加入1 0 0 山溶液i ( 2 5m mt r i s h c l ，p h8 0 1 0m me d t a ，p h8 0 5 0m m s u c r o s e ) ，振荡混匀。再加入2 0 0 山溶液i i ( o 2 n n a 0 h 1 s d s ) ，混匀后室温变 性5m i n 。加入1 5 0 l 溶液i i i ( 3m k a c ，p h 4 6 ) ，混匀、以中和5m i n 。1 2 0 0 0r p m 离心5m i n 。转移上清至另1 个e p p e n d o r f 管中，加lm l 无水乙醇，一2 0 静置5m i n 。 1 2 0 0 0r p m 离心5m i n 分钟。弃上清。用7 0 乙醇洗沉淀1 次，