（作物遗传育种专业论文）玉米籽粒油分QTL定位及其效应分析.pdf

摘要 高油玉米是人3 s 宦, j 造的一种高附加值玉米新类型。它的籽粒不仅含油量和总能量水平高，而 且蛋白质品质优良。因此，高油玉米的研究与开发越来越受到关注。玉米籽粒的肯油量受微效多 基冈控制，传统的高油玉米育种主要通过个体表型进行选择，周期长，费时费力，育种效率不高。 分子标记技术及理论的发展，可在全基冈组的水平上将数量性状的微效多基因效虑分解为单基因 的效应进行0 t l 定席并研究各位点的遗传效应。 本实验的目的是，在本实验室前期工作的基础上，以b y 8 0 4 与b 7 3 组配的2 9 8 个f 24 家系为 油分q t l 定位的材料，利用s s r 标记进一步优化了高油玉米遗传图谱。同时，利用f z 一家系进 行有三次重复的田间试验，采用复台区间作图法进行籽粒油分q t l 定位及效应分析，并对油分 q t l 与前期f 3 籽粒油分q t l 定值结果，及具有1 1 4 0 遗传背景为材料定位的籽粒油分q t l 进行 比较分析。对进一步开展分子标记辅助选择、籽粒油分q t l 的精细定位和油分基因的克隆具有 重要的指导意义。本实验还对b y 8 0 4 b 7 3 的r i l 群体籽粒油分与籽粒其他性状进行相关分析。 本研究的主要结果如下： 1 、用1 0 4 对s s r 引物对亲本b y 8 0 4 和b 7 3 进行多态性检测，获得3 4 个共显性标记位点， 占3 2 6 9 。利用m a p m a r k e r 3 0 作图软件将1 8 3 对s s r 标记划分为1 0 个连锁群，构建了一张总 长度为1 6 0 5 7 c m 的分子连锁图谱，相邻两标记间的平均距离为8 7 7 c m 。标记的添加，消除了原 图谱中第一、三、八染色体上的断点，减小了标记间的距离。 2 、采用复合区间作图法，定位了6 个影响玉米籽粒油分含量的q t l ，所解释的油分含量遗 传变异的幅度为4 3 4 1 3 i3 。部分显性和加性效应在籽粒油分含量的遗传中起着根重要的作 _ i 。其中，有2 个和4 个油分q t l 分别与宋秀芳研究中定位的f 2 、f 3 籽粒油分q t l 具有相同或 相似的染色体区段，分别占油分q t l 总数的3 3 和6 7 ；有5 个q t l 与具有i h o 遗传背景的油 分q t l 具有相同或相似的染色体区间。 3 、籽粒油分q t l o i l l ，位于第一染色体上两标记b n l 9 2 0 8 6 和u m c l l 2 2 之间，具有最大的l o d 值( 1 2 2 3 ) 所解释的遗传变异也晟大，为1 3 1 3 ，这与宋秀芳的研究结果一致，可以认为是一 个主效q t l ：o i l 4 1 位于第四染色体标记p h i 2 1 3 9 8 4 和p h i 0 9 6z 间，表现为加性效应，解释的表 型变异为1 0 1 4 ，也可能是一个主效q t l 。 4 、胚油分和胚比值对油分含量起决定作刖，可解释6 8 4 3 的油分变异。主成分分析表明， 胚重、胚体积、百粒重及籽粒体积对油分含量也有一定程度的影响。 关键词：高油玉米s s r 标记遗传图谱0 t l 定位籽粒油分含量 a b s t r a c t h i g h o lm a i z ei sa na r t i f i c i a ln e wt y p eo f m a i z ew i t hh i g he x t r av a l u e i t sk e r n e lh a sn o to n l yh i g h c o n c e n t r a t i o no fo i la n dt o t a le n e r g y , b u ta l s oe x e c e l l e n tq u a l i t yp r o t e i n t h u s ，t h ed e v e l o p m e n to f h i g h o i lm a i z eh a sb e e np a i d m o r ea n dm o r ea t t e n t i o n s i n c eo i lc o n c e n t r a t i o ni nm a i z eg r a i ni s c o n t r o l l e db ym u l t i g e n e s ，t r a d i t i o n a lh i g h o i lc o r nb r e e d i n gh a sl o we f f i c i e n c yb a s e do ni n d i v i d u a l s e l e c t i o nf o rp h e n o r y p e w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rm a r k e rt e c h n o l o g y , q u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s c o u l db em a p p e dt oa n a l y z ei nw h o l eg e n o m e t h eo b j e c t i v e so ft h i s s t u d yw e r e t o o p t i m i z eg e n e t i cm a pb ys s rm a r k e r s ，i d e n t i f yo i l c o n c e n t r a t i o nq t la n de v a l u a t et h e s eq t le f f e c t su s i n gc o m p o s i t ei n t e r v a lm a p p i n gu s i n g2 9 8 b y 8 0 4 x b 7 3f 2 ：4f a m i l i e sw h i c hh a st h r e er e p l i c a t i o no ff i e l de x p e r i m e n t t h e s er e s u l t sw i l ld og r e a t h e l pt of i n em a p p i n gf o rq t la s s o c i a t e dw i t hk e r n e lo i l c o n t e n ta n dm a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o ni n h i 曲- o i lm a i z eb r e e d i n g t h es t u d ya l s oa n a l y z e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e no i la n dr e l a t e dt r a i t si nk e r n e l t h em a j o rr e s u l t si nt h i ss t u d ya r ea sf o l l o w s ： 1 1 0 4s s rp r i m e r sw e r ee m p l o y e dt os c r e e np o l y m o r p h i s mb e t w e e nt w op a r e n t s ，b y 8 0 4a n db 7 3 o n l y3 4m a r k e r s ( 3 2 6 9 ) w e r ec o d o m i n a n ts e g r e g a t i o n u l t i m a t e l y , 1 8 3s s rm a r k e r sw e r ea s s i g n e d t o1 0l i n k a g eg r o u p s at o t a ll e n g t ho f t h el i n k a g em a pe q u a l st o1 6 0 5 7c m ，w i t ha na v e r a g ei n t e r v a lo f 8 7 7c m 2 s i xq t lw e r es i g n i f i c a n t l ya s s o c i a t e dw i t hk e r n e lo i lc o n c e n t r a t i o n t h ep h e n o t y p i cv a r i a t i o n e x p l a i n e db yas i n g l eq t lr a n g e df r o m43 4t o l3 13 e f f e c to fp a r t i a ld o m i n a n c ea sw e l la sa d d i t i v e a p p e a r st op l a yi m p o r t a n tr o l e si nc o n t r o l l i n gk e r n e lo i lc o n c e n t r a t i o n at o t a lo f t w oq t la n df o u rq t l w e r ec o n s i s t e n tw i t hq 丁li nf 2a n df 3 ，a c c o u n t i n gf o r3 3 a n d6 7 r e s p e c t i v e l y o f s i xq t lf o ro i li n t h i ss t u d y , f i v eq t lh a dt h es a m eo rs i m i l a rc o n f i d e n c ei n t e r v a l st ot h o s eq t lf o ro i lc o n c e n t r a t i o ni n e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l sw i t hd i f f e r e n tg e n e t i cb a c k g r o u n di np r e c i o u ss t u d y 3 o n eo f o i lq t l ，o i l c i ，l o c a t e do nc h r o m o s o m e1a n dl i n k e dt of l a n k i n gm a r k e r s ，b n l 9 2 0 8 6a n d u n l c l l 2 2 ，h a d t h eg r e a t l o dv a l u eo f l 2 2 3 ，a l s oe x p l a i n e d l 3 1 3 o f p h e n o t y p i cv a r i a t i o n i ts e e m s t o b ea n i m p o a a n t m a j o r q t l o i l 4 1l o c a t e do nc h r o m o s o m e la n d l i n k e d t o f l a n k i n g m a r k e r s ，p h i 2 1 3 9 8 4 a n dp h i 0 9 6 ，s h o w e da d d i t i v ee f f e c t , e x p l a i n e d1 0 1 4 o fp h e n o t y p i cv a r i a t i o n ，w h i c hm a ya l s ob ea m a j o r0 1 l 4 e m b r y oo i lc o n c e n t n i o na n dt h er a t i oo fe m b r y ow e t g h tt oe n d o s p e r mw e i g h tp l a y e dac r u c i a l r o l et ok e r n e lo i lc o n c e n t r a t i o n a n de x p l a i n e d6 8 4 3 p h e n o l y p i cv a r i a t i o n a c c o r d i n gt op r i n c i p l e c o m p o n e n ta n a l y s i s ，e m b r y ow e i g h t 、e m b r y ov o l u m e 、1 0 0 - k e m e lw e i g h ta n dk e r n e lv o l u m ea l s o a f f e c t e dk e r n e lo i lc o n c e n t r a t i o ni ns o m ee x t e n t k e yw o r d s ：h i g h - o i lm a i z e s s rm a r k e r g e n e t i cm a pq t lm a p p i n g k e r n e lo i c o n c e n t r a t i o n u 独创性声明 v 7 7 4 4 7 3 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特另j j d h 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：昌鸯清时间：m d j 年月憎日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：s 鹰荷 时胁 伽。、r 年月加日 导师签名 张 1 植物基因组研究 1 1 结构基因组及功能基因组 第一童文献综述 “基冈组”( g e n o m e ) 词出现于约8 0 年前，指一种生物的全套基因和染色体。“基因 h 学”( g e n o m i c s ) 一词则是t h o m a s 和r o d e r i c k 在1 9 8 6 年提出的，当时是指基因组的作图、测序 及分析的学科，并把这个词作为一个新杂志的名称。在过去的十多年中，“基因组学”一词已被 大多数人所接受，但内涵却有所变化。因此，基因组学分成了两个分支，一个是结构基圜组学， 以构建生物的遗传图谱、物理图谱和转录本图谱及其全序列测序为主；另一个是功能基因组学， 利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息，通过在基因组或系统水平上全面分析、推测和验 证基因功能( 包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等) ，使得生物学研究从对单基 因或蛋白质的研究转向对多个基因或蛋白质同时进行系统研究。功能基因组学的研究包括基因功 能发现、基因表达分析及突变检测，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算 机分析技术。植物基因组学是研究植物基冈组内基因与遗传信息如何有机结合并如何决定其功能 的一门学科。它打破了以往在单个基因水平上进行研究的模式，以基因组的结构、表达和相互作 用为目标的一个崭新的领域。随着人类基冈组计划、植物基因组计划和微生物基因组计划的丰硕 成果的出现，生物科学的研究已进人后基因组时代。基田组学的研究也从结构基冈组学转向功能 基因组学研究。拟南芥基因组和水稻基因组全基因组测序= 樗的完成，标志着植物科学迸人一个 崭新的时代，大大加快了植物功能基因组的研究步伐。植物功能基因组研究是利用植物全基因组 序列的信息，通过发展和应用系统基因组水平的实验方法来研究和鉴别基因组序列的作用，研究 基冈组结构和组织与植物功能在细胞、有机体和进化上的关系以及基因与基因间的调控关系。研 究方向从单个基因转向整个生物体的全部基因系统。同时，植物功能基因组研究还将从表达时间、 部位和表达水平三个方面对目的基因在植物中的精细调控进行系统研究。 研究基因功能最有效的个方法是观察基因敲除或超表达后在细胞和整体水平上产生的表 型变化，这就需要选择一个有效的模式基因组。拟南芥在绿色植物中基因组最小( 1 4 0 m b ) ，是 用于植物基囚组研究的一个最佳模式植物。拟南芥是叔子叶植物的模式植物，水稻( 4 5 0 m b ) 是 单子叶植物的模式植物。除了拟南芥和水稻之外，还有一些植物根据他们的特征也可以作为某一 研究领域的模式植物( k a i s e r ，2 0 0 0 ) ；例如：玉米可以作为研究遗传学的模式植物：烟草可以作 为研究细胞培养的模式植物：番茄可以作为研究果实生物学的模式植物；豆科植物苜蓿( m e d i c a 2 0 t r a n e a t u l a ) 可以作为研究植物固氮作用的模式植物等等( n a me ta 1 ，1 9 9 9 ) 。冈为绿色开花植物 的基因组之间具有相似性，所以对模式植物功能基因组的研究将有助于整个植物基因组学的研究 ( p e m i r 如2 0 0 0 ) 。 中国农业人学硕上学位论文 第一章文献综述 1 2 比较基因组研究 比较基因组学是基于基因组图谱和测序基础之上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来 了解基因的功能、表达机理和物种的进化的学科。研究方法包括比较基因组作图和比较生物信息 学。后者为把不同基因组当作一个整体遗传系统分析和处理提供相应的算法和软件。比较基因组 作图( c o m p a r a t i v em a p p i n g ) 主要是利用相同的遗传标记( 主要足分子标记、基因的c d n a 克隆 和基因组克隆) 在相关物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布 特点，揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同或相似性，并由此对相关物种的基 因组结构和起源进化进行分析。通过玉米和高粱，小麦、大麦和黑麦，玉米、小麦和水稻，小麦、 水稻、玉米和小麦，粟与水稻等比较基因组作图研究( d e v o se ta 1 ，2 0 0 0 ) 发现，尽管这些作物亲 缘关系远近、基因组大小、染色体数目各不相同，但它们之间在标记探针的同源性、拷贝数及连 锁顺序上都，f ! ：有很人程度的保守性。由此可见染色体共线性片段和基因间的同源性广泛存在。比 较作图的研究意义在于：第一，根据不同种的基因纽基因及其排列顺序的高度保守特点绘制的比 较图，可以研究和探明它们的进化线索。对水稻、小麦、玉米、谷子、甘蔗及高粱等6 种主要禾 本科物种的比较基因组研究表明，这些禾本科植物基冈组的保守性可归结到水稻基冈组的1 9 个 连锁区段上，由这1 9 个区段最终构建出了禾本科原始祖先的染色体图( m o o r ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 。这 对重要禾本科作物的遗传育种具有重要的理论指导意义。可见，比较基因组研究已使得传统的植 物遗传学突破了物种的框架限定，发展成了新的系统遗传学。第一二，解读基因组序列，即通过同 源性比较来推测未知基因的功能。p e l l e g r i n i 等( 1 9 9 9 ) 研究发现，在长期的进化过程中，具有 相同或相关功能的蛋白质以某种特定的形式演化，最后在形成的新的物种中，蛋白质的功能要么 保存下来，要么丢失。根据这种进化上的系统性演变特点，通过对不同物种的蛋白质功能、氨基 酸以及相应的核苷酸序列的比较研究可咀推断未知蛋白质的功能，从而对生物的遗传本质达到更 深刻的了解。第三，比较基因组研究还可显著增加箨种植物中可供利用的遗传标记的数量，促进 基因作图。由于基因组小的植物物种有利于对直向同源基因( o r t h o l o g u sg e n e s ) 进行基于图谱的 克隆，一旦某些同源基因被克隆和测序，其信息可很快地_ 蚪j 于其它植物同源基冈的克隆。随着最 近一些生物的基因组全序列的获得，比较基因组研究也随之步入了一个新的时代。 2 分子标记技术的发展及其应用 2 1 分子标记的发展 2 1 1 分子标记的特点 分子标记是以植物遗传物质d n a 分子的多态性为基础的遗传标记，与表型标记、生理标记、 细胞形态标记、同工酶标记等传统的遗传标记相比，分子标记具有明显的优点：第一，分子标 记直接以生命最本质性的物质d n a 为检测对象，而传统标记一般以酶、蛋白质、特性、性状等 基因表达产物为检测对象；第一，分子标记检验的样品可以是含d n a 的任意器官、组织或细胞， 也不受环境条件的影响，结果准确，显示度高；第三，分子标记的数目可以是无限多的，而传统 标记的数目都有一定的限制。而且很多分子标记表现为共显性，能鉴别纯合基因型与杂合基因型， 2 提供完整的遗传信息( 贾纪增1 9 9 6 ) 。 2 1 2 分子标记的类型 广义的分子标记包括同上酶标记和d n a 标记两类，狭义的分子标记仅i 自 d n a 标记。d n a 分 予标记是指电泳后能以一定的方法检测到的反映基冈组某种变异特征的d n a 片段，是d n a 水平上 遗传多态性的直接反映。根据对d n a 多态性的检测手段，d n a 标记可分为四大类： 第一类是基f d n a 分子杂交的d n a 标记，主要指限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 。1 9 8 0 年，人类遗传学家b o t s t e i n 等首先提出用r f l p 构 建遗传连锁图，其基本技术原理是基于d n a 序列的变化引起酶切位点的改变，从而使两个酶切位 点问的d n a 片段长度发生变化。这种变化经酶切、杂交及放射自显影显示出不同的条带，据此 对所比较样本进行多态性分析。r f l p 作为分子标记有其独特优势。第一，r f l p 标记的等，i ：) ：基因 是共显性的，对选择隐性基因极为有利；第二，r f l p 标记反映基因型差异，无表型效应；第三， r f l p 标记之间相互独立，互不干扰。r f l p 在构建基因组连锁图谱上有重要应用作用，但多数 r f l p 位点信息含量较低，且费用昂贵，操作复杂，不适用于分折样本量较大的群体。 第二类是基于p c r 技术的d n a 标记。它义分为二类，一是使用随机引物进行扩增，主要指随 机扩增多态性d n a 技术( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) ；另一类标记是采用特定 引物或引物对扩增的标记，土要有s c a r ( s e q u e n c ec h a r a s t e r i z e d a m p l i f i e dr e g i o n ) ，s t s ( s e q u e n c e t a g g e ds i t e ) ，小卫星d n a ( m i n i s a t e l l i t ed n a ) ；微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) ，又称简单 重复系列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) ：i s s r ( i n t e rs i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 等。其中s t s 和s c a r 属于位点特异的p c r 标记方法，其它则属于多位点标记方法，检测的区域均与微p 星序列有关。 】9 9 0 年，w i l l i a m s 等和w e l s h 等共同提出一种新的分子标记技术r a p d ，它以p c r 技 术为基础，主要是利用人= _ _ = 随机合成的寡聚核苷酸单链( 般为1 0 个b p ) 为引物，以所研究的 基闪组d n a 为模板进行p c r 扩增。如果引物与某一片段的d n a 模扳具有且补的位置，就可以通过 级数方式大量的扩增出d n a 片段扩增的产物经琼脂糖胶电泳，经溴化已锭( e b ) 染色检测其 多态性。对于特定的引物来说，它同基阁组d n a 序列有特定的结合位点，扩增后会形成长短不同 的d n a 片段，每个片段代表了基因组上的特定位点。如果基因组在这些区域发生d n a 片段插入， 缺乏或碱基突变都可能造成特定结合位点分布发生变化，导致扩增产物长度的政变或产物的有 无，表现出扩t 曾d n a 片段的多态性，反应了不同个体基冈组d n a 相应区域的多态性( 解生勇，1 9 9 8 ： 郑敏等，1 9 9 9 ) 。r a p d 技术具有如下优点：第一，技术简单，操作简便，检测速度快；第二， 引物序列通用眭强，无需根据物种特异性分别设计引物；第三，成本较低，且所需d n a 样本量 较少。r a p d 技术的缺点土要在丁它是一个显性标记，不能鉴别杂台子和纯台子。此外，共迁移 及重复性差的问题也限制了r a p d 技术的应用( p e r e z t ，1 9 9 8 ) 。 p a r a n 和m i c h e l m o r e ( 1 9 9 3 ) 首次提出并使用了s c a r 。通过对多态性r a p d 产物测序的基 础上，在原r a p d 引物的3 与5 端延长1 4 个碱基设计成与原来的r a p d 片段末段互补的特异性 引物，利用两端各2 4 个碱基在特定的位点上进行特异性扩增d n a 片段。因此，它较r a p d 有许多 优点( k o n g ，2 0 0 1 ：p a m n ，1 9 9 3 ；w a n g jxe ta l ，2 0 0 0 ) ：第，引物较长有较高的退火温度，因此 具有高稳定性，重复性好；第二，具有将显性的r a p d 标记转化为共显性的s c a r 标记的可能性； 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 第三，如果是显性标记，则在检测中可以直接染色，而不需进行电泳检测；第四，s c a r 标记比 r a p d 标记信息量大；第五，易丁- 基因的克隆。因此，s c a r 标记克服了r a p d 标记的缺陷， 为基因定位与克隆、遗传图谱构建，奠定了试验基础( m u r a y a m ase ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 小1 1 旱d n a 是由1 0 7 0 碱基对的重复单位串联重复而成，一个小卫星长几十剑几千个b p 不 等。小卫星d n a 技术利用小卫星d n a 作探针，探测不同生物的甲星区，从而产生具有个体特征 和种属特异性的d n a 图谱。严华军( 1 9 9 6 ) 认为它实际是r f l p 分析的一种特殊类型。它使用 的是高拷贝的重复序列，一个探针一次就能同时检测十几个甚至几十个位点的变异性，与r f l p 相比，具有检测的基因组范围大，获得的信息量多等优点。日前，小卫星d n a 技术在研究品种 和品系间遗传纯度和遗传距离的测定、植物栽培种和野生种类间演化关系等方面显示了一定作 用。但是，该技术也存在一些缺点限制了它的广泛应用。第一，需要较高的技术水平和较多的用 量；第二，条带太多而且强弱及位置变化多端，不利于精确的遗传分析；第三，小卫星在染色体 上分布不均匀，主要存在于染色体的近末端区，因而检测位点还是有限( 张海英，2 0 0 1 ) 。 s t s 技术也是基于r f l p 发展起米的一类p c r 标记技术。它是通过对r f l p 标记使用的c d n a 克 隆进行测序，然后根据其序列设计一对引物，对基因组d n a 进行特异性扩增。由f 在c d n a 中内 部存在着插入、缺失等非表达区域，从而使得与两引物配对的区域形成多个不同扩增子，并表现 出扩增片段的多态性。 简单重复序列即微卫星，是由z i e t k i e w i c z 等( 】9 9 4 ) 建立的一种分子标记技术。微卫星d n a 是由2 - 6b p 的重复单位串联而成，一个微下星k 度一般小于1 0 0b p 。微卫星位点两侧的序列多是 相对保守的单拷贝序列，因此s s r 技术是根据两侧序列设计的对特异引物进行p c r 扩增，然后 通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，根据扩增产物跃短的变化显示不同基因型的个体在 每个s s r 位点上的多态性( l i t te ta l ，1 9 8 9 ；w e b e ra n d m a y ，1 9 8 9 ) 。s s r 技术具有其自身独特的 优点：第一，微卫星标记在基因组中分布广泛，揭示的多态陛十分丰富；第一，每一个微卫旱位 点具有多种等位形式；第二，微卫星标记是其显性的，并按照孟德尔方式分离；筇四，s s r 操作 简单，重复性好，且对样本d n a 的质与量要求均不高。囡此，在群体遗传多样性等研究中，s s r 技术发挥了重要作用。 第三类是基于p c r 与限制性酶切技术相结合的d n a 标记，主要指( a f l p a m p l i f i e df r a g m e n t l e n g t hp o l y a l o r p h i s m ) 和c a p s ( c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e ) 两类。其中a f l p 标记 方法是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增，而c a p s 是先扩增，再酶切扩增片段，检测酶切 片段的长度多态性。 荷兰科学家z a b e a u 和v o s 于1 9 9 3 年建立起a f l p 技术用r 检测d n a 多态性。a f l p 技术 是以限制性内切酶切割基因组d n a ，使切割片段与人工接头相连接，在与人工接头互补的一段 核苷酸序列3 端附加2 3 个选择性碱基作为引物，进行p c r 扩增，扩增片段经聚丙烯酰胺电 泳分离检测得到样本间差异。对于不同样本的基因组，可选择不同数目及不n g c 含量的选择性 碱基以调整a f l p 产物条带的特异性和数量。此外，在酶切操作中选取两种基因组中酶切位点数 不同的酶咀得到长度适宜的酶切片段。a f l p 技术融合了r a p d 与r f l p 两种技术的优越性，同 时克服r 二者各自的缺点：与r a p d 相比，其假阳性率大大降低，具有较立| 的重复性；较之r f l p 技术ta f l p 的操作则更为简单。因此，a f l p 已经成为构建高密度连锁图谱、基因定位、分子 育种、基因组多样性检测等领域的主要分子标记。a f l p 技术的不足主要表现在：对基因组d n a 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 质量要求较高，操作成本也相对较高，且所得到的分子标记多为显性标( m u e l l e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 第四类是基于单核苷酸多态性的d n a 标记。如s n p 标记，它是由基因缍l d n a 序列中某一特定 核_ 茴：酸位置上发生变化日l 起的遗传多态性。单核苷酸多态性是一种新兴的分子标记技术，比微卫 星标记密度更高( 刘万清，1 9 9 8 ；h a l u s h k ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。s n p s 在基因或基囚组中分布不均，表 现为肾转录区多丁- 转录区，转录区中同义突变多于非同义突变，推测为选择性压力造成。作为分 子标记，s n p s 具有以下优点：第一，s n p s 是二等位基因性的，便于自动化分析；第二，分布 广泛，高度稳定；第三，s n p s 是一种共显性标记。冈此，在复杂疾病分析、疾病基因精确定位及 药物基因组学等方面有着广泛的应用前景。随着愈来愈多的植物全基因组测序的开展，测序技术、 基因纽多态性检测和作图等技术的快速发展，为植物的s n p 分析及廊州提供了理论和技术支撑。 通过s n p 分析，可以解释个体表型差异；通过比较物种问s n p 的差异，可了解物种间亲属关系和 生物学信息。 2 2 分子标记技术的应用 2 2 1 遗传图谱的构建 遗传图谱是遗传学研究的重要内容，对育种和基因工程有重要的应用价值：也是基因组研究 中的重要环节，是基因定位与克隆乃至基因组结构与功能研究的基础。随着分子生物学特别是分 子标记技术的e 速发展，为构建高饱和的植物遗传连锁图谱和利用分子标记进行辅助育种奠定了 基础。近年米，遗传作图在许多作物中得到了迅速发展，西红柿、马铃薯、大豆、油菜、玉米、 水稻、小麦、大麦、燕麦和高粱等作物的遗传图谱相继建立( t a n k s l e y , 1 9 9 2 ；k e i m ，1 9 9 0 ；向道权， 2 0 0 1 ；y ue ta 1 ，1 9 9 7 ；n e l s o ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 。构建遗传图谱的步骤主要包括：( 1 ) 选择亲本系；( 2 ) 建立一个适合作图的群体； ( 3 ) 对群体中不同植株或品系的标记基因型进行分析；( 4 ) 标记问 连锁群的确立。其中建立一个适台作图的群体是作图成功的关键。 2 2 2 植物遗传多样性研究 对植物种质资源遗传多样性的全面了解，有益于正确制定遗传资源收集和原位保存的策略， 有助于鉴定植物遗传多样性中心等，对于拓宽遗传基础的育种策略十分重要。分子标记是检测种 质资源遗传多样性的有效下具。随着d n a 分子标记技术的日趋成熟为玉米自交系亲缘关系和遗传 多样性研究提供了新的手段和方法。近年来，利用r f l p 、s s r 和a f l p 标记技术对美国和欧洲玉 米自交系进行了人规模的遗传多样性分析。我国玉米自交系也得到了类似研究，但涉及到的材料 数量还不多( l iy ，e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。玉米地方品种和育种群体的遗传多样性评估玉米的地方品种和 育种群体是种质资源宝库中的重要组j j 兑部分，国内外也越米越重视针对这部分资源的遗传多样性 分析。例如g a u t h i e r 等( 2 0 0 2 ) 对4 8 8 份欧洲玉米群体进行了多样性和遗传关系的评估，发现东欧 群体遗传多样性最低，南欧群体遗传多样性最高，这可能与南欧是最先引入玉米的地区有关。 r e b o u r g 等( 2 0 0 3 ) 又对1 2 9 份欧洲地方品种和8 8 份美洲地方品种进行了遗传多样性分析，鉴定出 在不同时间或不同地点引入欧洲的不同美洲玉米类型。l a b a t e 等( 2 0 0 3 ) 对5 7 份美国地方品种( 包 括玉米带马齿、北方硬粒、南方马齿) 进t t s s r 分析，发现硬粒群体和马齿群体可_ 以明显分开， 中国农业大学硕上学位论文 第一章文献综述 i i 群体问的遗传距离与地理带或成熟区有相关性，而且系谱对遗传结构的影响最大。 2 2 3 品种的d h a 指纹图谱 指纹列谱是能够鉴定作物品种之间差异的电泳图谱，具有高度的个体特异性、环境的稳定性 及丰富的多态性。分子标记可用作d n a 指纹图谱，通过检测品种是否只具有该品种特有的标记 指纹片段，可以有效地鉴定品种真实性和纯度，以对种子质量进行监测，从而用于新品种登记和 鼎种知识产权保护；根据种质资源d n a 指纹的多态性，可以对育种材料的变异丰富度作出总体 评价。由于各品种的d n a 指纹差异可直接提供与目标性状有关的d n a 水平的信息，避免环境的干 扰从而能大大提高杂交育种中对亲本及后代理想单株的选择效率，为配制强优势杂交组合选择 亲本提供信息。s m i t h ( 】9 8 9 ) 用3 7 个优良自交系配制了3 1 0 5 杂交组合，用2 3 0 个r f l p 探针检测 这些玉米自交系，发现杂交种杂合位点的数目与产量的决定系数高达0 8 7 ，这个结果说明根据亲 本白交系基因位点的等位萍异预测杂种优势是非常准确的。孙致良等( 1 9 9 9 ) 对我国的1 2 个玉 米骨干自交系进行了r a p d 分析，获得了各个自交系的指纹图谱，通过聚类分析确定了1 2 个供试 臼交系的亲缘关系并分成t 3 个类群。高世斌等( 2 0 0 1 ) 用引物组台e c o r l a g g m s e l c a a 对 我国1 9 个玉米骨干自交系进行a f l p 指纹图谱。赵姝华等( 2 0 0 4 ) 采用r a p d 分子标记技术对2 8 份自交系进行了分析，获得各臼交系的d n a 指纹图谱，揭示玉米自交系之间的遗传多态性，分析 亲缘关系，在d n a 水平上揭示玉米自交系之间的真实关系，为进一步提高杂种优势利用水平提 供有益的信息、理论依据。 2 2 4 基因定位 基因定位一直是遗传学研究的重要范畴之一。质量性状通常受一个或少数几个主基冈控制， 不易受环境的影响。作物中许多重要的农学l 生状如抗病性、抗虫性、育性等都受主基因的控制。 对这些质量性状的基因进行定位，可在已知目标基冈位丁某一染色体或连锁群上的前提下，选择 该连锁群上下不同位置的标记与目标基因进行连锁分析。但该方法效率偏低，由此定位的目标基 阅与标记问的距离取决丁所用连锁图上的标记密度，也不适合尚无连锁图或连锁图饱和程度较低 的植物。近等基因系( n i l s ) 和分离群体分组分析法( b u l k e ds e g r e g a t i o na n a l y s i s ) 可以克服上 述局限性，是进行快速基因定位的有效方法。利用这些方法已定位了许多质量性状基因。例如礴茄 抗病毒病基( y o u n ge ta 1 ，1 9 8 8 ) 、水稻、r 矮秆基冈( l i a n g ，1 9 9 4 ) 、莴苣抗霜霉病基因( m i c h e i m o r e e ta 1 ，1 9 9 1 ) 、水稻抗瘿蠓基冈( m o h a ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 及水稻抗稻瘟病基因( 朱克煌等，1 9 9 4 ) 等。 世人多数重要农艺性状，如产量、品质、熟期等均表现数量性状的遗传特点，即受许多数量基因 座何( q u a n t i t a t i v et r a i tl o c i ，q t l ) 和环境因子的共同作用。数量遗传学以统计推理为基础，将控 制数量性状的多基因作为一个整体，通过数理统计量来剖析描述q t l 的遗传特征。这样无法确定 控制数量性状的q t l 的数日，也无法确定单个q t l 的遗传效应以及它们在染色体上的位置。d n a 分子标记技术及分子连锁图谱的迅猛发展，可以实现对单卟 q t l 的遗传效应的估计，从而应用于 分子标记辅助选择。目前进行q t l 定位的方法有单一标记定位法、区问作图法、复合区问作图 法等。 6 中国农业人学硕上学位论文 第一章文献综述 22 5 基于图谱的基因克隆 克隆基因的方法可以概括为两种“正向遗传学”( f o r w a r dg e n e t i c s ) 方法和“反向遗传 学“( r e v e r s eg e n e t l c s ) 方法。“正向遗传学”的方法是根据基风的蛋白质产物，利用重组d n a 技 术来克隆控制某一性状的基因，并进而从分子水平上对该性状进行深入研究。但是对于许多性状 尤其是重要农艺性状来说，由于其基因产物未知，冈而难以按止向遗传学的方法去分离相戍的基 因。“反向遗传学”的建立为克隆产物未知基因提供了新的途径( o r k i n ，1 9 8 6 ) ，这是在人类遗 传学研究中发展起来的成熟方法，图位克隆( m a p b a s e dc l o n i n g ) 或定位克隆( p o s i t i o n a lc l o n i n g ) 技术即属反向遗传学方法的一种，其基本程序包括：构建目标基因区域的高密度分子图谱，对目 标基因精细定位；确定目标基因区域的物理距离，以明确何时进行染色体步行向目标基因靠近； 构建大片段d n a 文库如y a c i b a c 库等，并以目标基因侧翼标记筛选大片段文库实现染色体步 行，如果侧翼标记与目标基因连锁十分紧密，有时甚至无需步行就可直接着陆到含目标基因的大 片段克隆上( t a n k s l e y ，e ta 1 ，1 9 9 5 ) ，然后对含目标基因的大片段克隆作亚克隆或直接筛选c o s m i d 文库和c d n a 文库，将目标基冈限定丁较小的d n a 片段上并进行序列分析，找出目标基因的开 放阅读框( o r f ) ，最后还必须通过功能互补试验或遗传转化对结果进行证实。 在植物上，a r o n d e l ，e ta l ( 1 9 9 2 ) 和g i r a u d a t ，e ta l ( 1 9 9 2 ) 较早报道利用图位克隆技术分离 了拟南芥菜的o m e g a 2 3 目肪酸脱氢酶基冈f 列2 3 和脱落酸不敏感基因a b l 3 。1 9 9 3 年m a r t i n 等报 道利用分子标记连锁图为导向克隆了第一个经典的基因对基因抗病基因番茄抗青枯病基因 p t o 。随着植物基因组计划的进一步实施与完成，越来越多的植物基因将通过图位克隆技术和 基于基因保守序列而设计的候选基因法( c a n d i d a t eg e n em e t h o d ) 得以克隆，同对也将有助于深入 了解植物基因组的组织与结构、基因组的进化、基因表达与调控以及植物发育和分化过程中的基 冈活动等。 2 ，2 6 在植物遗传育种上的应用 选择是育种中重要的环市之一。所谓的选择，是指在一个群体中选择符合要求的基因型。但 在传统育种中选择都是基于植株的表现型而非基因型。这种选择方法对质量性状而言一般是有效 的，而植物的许多性状属于数量性状，其表型受许多微效基因的控制，表现型与基因型之间缺乏 明确的对应关系，且易受环境的影响，因而选择效率往往较低。目前分子标记辅助选择正在成为 植物育种的有效工具。 质量性状标记辅助选择的方法包括前景选择和背景选择，在育种上主要应用于两方面。一方 向在基因转移的过程中跟踪、