（内科学专业论文）trx及txnip在溃疡性结肠炎患者中的表达及作用机制的研究.pdf

目录 中文摘要1 英文摘要4 研究论文n 及t 烈i p 在溃疡性结肠炎患者中的表达及作用机制的研究 前言8刖舌芍 材料和方法9 结果1 4 附图1 6 附表1 9 讨论2 2 结论2 5 参考文献2 6 综述硫氧还蛋白和硫氧还蛋白相互作用蛋白与消化系统疾病2 9 致谢3 8 个人简历3 9 中文摘要 t r x 及t x n i p 在溃疡性结肠炎患者中的表达及 作用机制的研究 摘要 溃疡性结肠炎( u l c e r a t i v ec o l i t i s ，u c ) 是常见的消化内科疾病之一， 其发病率在国内外均有逐年上升的趋势。u c 可发生于任何年龄，病变主 要累及结肠组织的黏膜层与黏膜下层。临床以腹泻、腹痛及黏液脓血便为 主要表现，病情轻重不等，多呈反复发作。u c 的病因迄今尚未完全明确， 临床治疗方面仍很棘手。目前认为，u c 的发病与免疫、遗传、环境、细 菌移位等多种因素有关，氧化应激时产生的大量的氧化物( 主要是氧自由 基) 是参与u c 发病的一个重要原因，机体活性氧的形成和抗氧化系统的 失衡在u c 的组织损伤中起着重要的作用，并与其活动密切相关。 硫氧还蛋白( “o r e d o x i n ，t i ) 系统是一组氧化还原敏感的多功能 小分子蛋白系统，在人体多种组织及细胞中均有表达，并行使着多种功能， 它能够调节细胞氧化还原状态以对抗氧化应激，激活转录因子如核转录因 子( 肌c l e a r f a c t o r k a p p a b ，n f 1 c b ) 和转录激活蛋白1 ( a c t i v a t o r p r o t e i n 1 ，a p 1 ) 促进细胞的生长与增殖以及与凋亡信号调节激酶1 ( a p o p t o s i s s i g n a l r e g u l a t i n g1 ( i n a s e1 ，a s k 一1 ) 作用抑制细胞凋亡等。硫氧还蛋白相 互作用蛋白( t h i o r e d o x i ni n t e r a c t i n gp r o t e i n ，t x n i p ) 是硫氧还蛋白的结 合蛋白之一，通过抑制硫氧还蛋白系统的功能而发挥介导氧化应激、对抗 细胞增殖及诱导细胞凋亡等作用，是硫氧还蛋白系统功能和表达的负性调 节因子。t r x 及t ) ( n i p 在氧化应激中均发挥着重要的作用，是机体维持 氧化还原平衡的重要因子。关于t i 及t x n i p 在u c 中的研究目前国内 外鲜有报道。 目的：本课题通过检测u c 患者血清及结肠组织中t r x 及t x n i p 的 表达，分析这两种氧化应激因子与u c 病情严重程度的相关性，探讨其在 u c 发生发展中可能的作用机制，从而为u c 的治疗提供新的靶点与方向。 方法：收集2 9 例经临床表现、肠镜及病理证实为u c 患者的外周静 脉血及结肠粘膜活检组织做为病例组，另收集2 5 例正常人的外周静脉血 及结肠黏膜活检组织做为对照组。按照s o u t h e r l a n dd a i 评分标准对患者 中文摘要 进行评分，并将患者分为轻中度活动组、重度活动组。其中轻中度活动组 1 7 例，重度活动组1 2 例，各组间在年龄及性别等方面无统计学差异( p o 0 5 ) 。采用免疫组织化学染色方法对结肠组织中t r x 及t x n i p 的表 达进行检测。采用酶联免疫检测技术( e l i s a ) 对血清中t i 及t x n i p 的表达水平进行检测。根据检测结果，对t r x 、t 删i p 与u c 患者病情 严重程度的相关性以及t i 与t x n i p 之间表达的相关性进行统计学分 析。 结果： l 血清学检测结果显示 1 1 血清中t r x 在u c 组的表达较正常对照组明显升高( p o 0 5 ) ；t i 在各组中的表达水平为：正常对照组 轻中度活动组 o 0 5 ) ，重度活动组和正常对 照组及轻中度活动组之间均有明显差异( p o 0 5 ) 。 1 2 血清中t 删i p 在u c 组的表达较正常对照组明显升高( p o 0 5 ) ； t x n i p 在各组中的表达水平为：正常对照组 轻中度活动组 o 0 5 ) ，重度活动组和正 常对照组及轻中度活动组之间均有明显差异( p o 0 5 ) 。 2 免疫组织化学染色显示 2 1 结肠组织中t r x 在u c 组的表达较正常对照组明显升高( p o 0 5 ) ； t i 在各组中的表达水平为：正常对照组 轻中度活动组 重度活动组， 各组间的表达均有明显差异( p 重度活动组， 各组间的表达均有明显差异( p o 0 5 ) 。 3 相关性分析 3 1 血清中t i 的表达与u c 患者病情的严重程度呈正相关，相关系数 为o 4 2 1 ( p o 0 5 ) ；t x n i p 的表达与u c 患者病情的严重程度呈正相关， 相关系数为o 4 3 9 ( p o 0 5 ) 。 3 2 结肠组织中t l 的表达与u c 患者病情的严重程度呈正相关，相关 系数为o 9 4 0 ( p o 0 5 ) ；t x n i p 的表达与u c 患者病情的严重程度呈负相 关，相关系数为一o 9 4 0 ( p o 0 5 ) 。 3 0 ( p o 0 5 ) ；在结肠组织中t r x 和t x n i p 表达水平具有相关性，相关系 数为o 5 5 1 ( p 0 0 5 ) b yt h ei m 枷n o h i s t o c h e m i s 仃ya s s a y ， t h ee x p r e s s i o no ft r xa n dt x n i pi nt h ec 0 1 0 nm u c o s aw e r es t l l d i e dt h e s e l l j mt r xa n dt x n i pw e r ee x a m i n e db ye l i s a t 1 1 es t a t i s t i c a la n a l y s i sw a s c a 币e do u tt oa n a l y z et h ec o 玎e l a t i o nb e 觚e e nt w of a c t o r s ( t r xa n dt x n i p ) a n dt h es e v e r i 够o fs y m p t o m so fu ca n dt h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt i 乇xa n d t x n i p r e s u l t s ： ls e r o l o g i c a l t e s tr e s u l t ss h o w e d 1 1t h es e m ml e v e lo ft r xi nu cw a ss i g n i f i c a i l t l yh i g h e rt h a nt h a ti n n o 珊a lc o n t r o l s ( p o 0 5 ) a m o n gt h eg r o u p s ，t h ee ) 【p r e s s i o no ft r xw a st h a t ： n o m a lc o n t r 0 1 s m i l dt om o d e r a t e - a c t i v i 够 o 0 5 ) b u t ，t h es i g n i f i c a n td i f r e r e n c ew a sf o u n da m o n gs e v e r e a c t i v i 坝m i l dt om o d e r a t e a c t i v i t ya n dn o 姗a lc o n t r o l s ( p o 0 5 ) 1 2t h es e r u m1 e v e lo ft x n i pi nu cw a ss i g n i 6 c a n t l yh i 曲e rt h a nt h a ti n n o n n a lc o n t r o l s ( p o 0 5 ) a m o n gt h eg r o u p s ，t 1 1 ee x p r e s s i o no ft x n i pw a s t h a t ：n o m a lc o m r o l s m i l dt om o d e r a t e a c t i v i t y o 0 5 ) b u t ，t h es i g n i f i c a n td i f r e r e n c ew a sf o u n da m o n g s e v e r e a c t i v i t y ，m i l dt om o d e r a t e a c t i v 时a n dn o n i l a lc o n t r o l s ( p o 0 5 ) 英文摘要 2i m m u n o h l s t o c h e m i s t 巧a s s a yr e s u l t ss h o w e d 2 1t h ee x p r e s s i o no ft r xi nt h ec o l o n i cm u c o s ao fp a t i e n t sw i t hu cw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nn o n n a lc o n t r o l s ( p o 0 5 ) a m o n gt h eg r o u p s ， t h ee x p r e s s i o no ft r xw a st h a t ：n o r m a lc o n t r o l s m i l dt om o ( 1 e r a t e - a c t i v i t y s e v e r e - a c t i v i t y t h es i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a sf o u n da m o n ge v e 巧t w og r o u p s ( p s e v e r e - a c t i v i 坝t h es i g n i f i c a l l td i 彘r e n c ew a sf o u n da m o n ge v e w 俩og r o u p s ( p o 0 5 ) 3c o l l r e l a t i o na n a l y s i s 3 1t h e r ei sap o s i t i v ec o n l a t i o nb e t w e e nt h es e r u ml e v e lo ft r xa n dt h e s e v e r i t yo fc l i n i c a ls 卿t o m so fu ca c t i v i t yt h ec o r r e l a t i n gf a c t o rw a so 4 2 1 ( p o 0 5 ) 3 2t h e r ei san e g a t i v ec o n e l a t i o nb e t w e e nt h es e r u ml e v e lo ft x n i pa n dt h e s e v e r i t yo fc l i n i c a ls y l l l p t o m so fu ca c t i v i 够t h ec o r r e l a t i n gf a c t o rw a so 4 3 9 ( p o 0 5 ) 3 3t h e r ew a sas i g n i f i c a n tc o l l r e l a t i o no ft r xa n dt x n i pi nt h es e r u mo fu c ( p 正常排便次 正常排便次 正常排便次 数1 2 次d数3 4 次d数5 次d 便血无少量明显以血为主 粘膜表现正常轻度易脆中度易脆重度易脆 医师评估正常轻中 重 注：总分为多项之和，q 分为症状缓解，3 5 分为轻度活动，6 1 0 分 为中度活动，1 1 1 2 分为重度活动。 2 主要仪器及试剂 2 1 主要仪器 l o p b 4 锘l j 冰机 l c 1 5 9 冰箱 海尔b c d 2 5 9 k 冰箱 中国上海海尔 青岛海尔集团 青岛海尔集团 负8 0 度超低温冰箱 y b l 2 生物组织包埋机 y t - 6 生物组织摊烤机 h m p 1 1 0 组织脱水机 l e i c ar m 2 2 4 5 石蜡切片机 e l x 8 0 0 酶标仪 c h k 2 f g s 显微镜 离心机 电热干燥箱d g b 2 0 水浴箱2 0 1 o 恒温水浴震荡器c u 6 0 0 移液器、染色缸、湿盒等 m o t i c 6 o 数码医学图象分析系统 2 2 主要试剂 日本s a n y 0 公司 孝感亚光医用电子技术研究所 孝感亚光医用电子技术研究所 德国w r a l l d o r f 公司 日本o l y m p u s 公司 莱卡上海分公司 德国b i o t e k 美国b e c k m a n 公司 上海光华仪器厂 天津泰斯特仪器有限公司 姜堰市医疗器械有限公司 北京中山有限公司 厦门麦克奥迪仪器仪表有限公司 人t i 定量e l i s a 试剂盒美国i 公司 人t x n i p 定量e l i s a 试剂盒美国r d 公司 以上试剂盒均包括9 6 孔微孔板、3 0 倍浓缩洗涤液、酶标试剂、酶标包被 板、样品稀释液、显色剂a 液、显色剂b 液、终止液、标准品、标准品 稀释液、封板模、密封袋。 鼠抗人的t r x 多克隆抗体上海瑞聪生物科技有限公司 鼠抗人的t 列i p 多克隆抗体上海瑞聪生物科技有限公司 s p 9 0 0 1 试剂盒北京中山生物技术有限公司 d a b 显色剂北京中山生物技术有限公司 3 试验方法 3 1 标本采集 3 1 1 血清：晨起空腹条件下取肘静脉血5 m l ，l o o or p m 离心2 0m i n ，分 离上清，于8 0 冰箱保存。测定时在室温下自溶。 3 1 2 组织取材：患者于常规肠道准备后行电子结肠镜检查，肠镜检查及 粘膜组织活检由消化内科医师操作。镜下观察结肠粘膜病变，取u c 患者 病变明显处结肠粘膜2 块。同法选取对照组患者正常结肠粘膜组织。所有 组织经生理盐水冲洗后，置于1 0 中性福尔马林固定液固定，4 冰箱保 研究论文 存。 3 2 结肠组织h e 染色 常规石蜡包埋，用切片机切成5 岬的连续切片，捞片后置于烤片机 烘烤2 0m i n ，使切片紧密黏附，按如下流程染色： 。3 2 1 切片常规脱腊至水：二甲苯i 、二甲苯i i ，各5m i n ，1 0 0 酒精i 、 1 0 0 酒精i i ，各1 0m i n ，9 5 酒精、9 0 酒精、8 0 酒精、7 0 酒精，各 1 0m i n ，蒸馏水洗1m i n ； 3 2 2 苏木精染色1m i n ，自来水冲洗3m i n ； 3 2 31 盐酸分化1m i n ，自来水冲洗3m i n ； 3 2 4 伊红染色2m i n ； 3 2 5 常规梯度酒精脱水：7 0 酒精、8 0 酒精、9 0 酒精、9 5 酒精，各 2m i n ，l o o 酒精i 、1 0 0 酒精i i ，各1 0m i n ； 3 2 6 二甲苯透明，中性树胶封片。 3 3 免疫组织化学染色( s p 法) 33 1 步骤 常规石蜡包埋，用切片机切成5 岬的连续切片，然后放入水浴箱中 展片，待组织充分舒展后，取4 片蜡带裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上， 6 8 烤片2 0m i n ，按如下流程染色： 3 3 1 1 切片常规脱蜡至水：二甲苯i 、二甲苯i i 、1 0 0 酒精i 、1 0 0 酒 精i i ，各1 0m i n ，9 5 酒精、9 0 酒精、8 0 酒精、7 0 酒精，各1 0m i n ， 蒸馏水冲洗1m i n ； 3 3 1 2o o l mp b s 清洗3 次，每次5m i n ； 3 3 1 3o 3 甲醇过氧化氢室温下孵育2 0m i n ； 3 3 1 4 蒸馏水清洗清洗3 次，每次5m i n ； 3 3 1 5o 1 m 枸橼酸缓冲液( p h6 o ) 微波炉内修复，9 8 维持2 0m i n ； 3 3 1 6 冷却至室温； 3 3 1 71 0 山羊血清，3 7 温箱湿盒内9 呼育3 0m i n ； 3 3 1 8 滤纸吸去多余血清，加入一抗( 稀释l ：1 0 0 ) ( 阴性对照用p b s 替代一抗，其余步骤相同) ； 3 3 1 9o 0 1 mp b s 清洗3 次，每次5m i n ； 3 3 1 1 0 滴加生物素化二抗( 山羊抗鼠) 工作液，3 7 温箱湿盒内孵育3 0 研究论文 m l n ： 3 3 1 1 1o o l mp b s 清洗3 次，每次5m i n ； 3 3 1 1 2 滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液，3 7 温箱湿盒内孵 育3 0m i n ； 3 3 1 1 3 o 0 1 mp b s 清洗3 次，每次5m i n ； 3 3 1 1 4d a b 显色2 5m i n ； 3 3 1 1 5 自来水充分冲洗，终止显色，苏木素复染细胞核； 3 3 1 1 6 梯度酒精脱水：7 0 、8 0 、9 0 酒精各5m i n ，9 5 酒精1 0m i n ， 1 0 0 酒精i 、i i 各15m i n ； 3 3 1 1 7 二甲苯i 、i i 、i i i 各1 5m i n 透明； 3 3 1 1 8 中性树胶封固； 3 3 2 结果判定 细胞内有棕黄色粗颗粒分布或棕黄色细腻颗粒弥漫分布者为阳性反 应。计数标准：所有标本均在m o t i cm e d6 o 数码医学图像分析系统内在 相同的放大倍数下，每个切片计数l o 个视野，以阳性细胞染色的平均光 密度值( o d ) 值来表示抗原表达量，该值越大，表明蛋白表达量越高。 3 4 血清e l i s a 法 3 4 1 操作步骤 3 4 1 1 标准品的稀释：小试管中每管各加入样品稀释液1 5 0 u 1 ，第一管加 标准品1 5 0 u l ，混匀后加样器吸出1 5 0 u l ，移至第二管。如此反复作对倍稀 释至第六管，最后，从第六管吸1 5 0 u l 弃去； 3 4 1 2 加样：分别设空白孔( 空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各 步操作相同) 、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样5 0 “l ， 待测样品孔中先加样品稀释液4 0 p 1 ，然后再加待测样品1 0 山( 样品最终 稀释度为5 倍) 。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻 晃动混匀； 3 4 1 3 温育：用封板膜封板后置3 7 温育3 0m i n ； 3 4 1 4 配液：将3 0 倍浓缩洗涤液用蒸馏水3 0 倍稀释后备用； 3 4 1 5 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静 置3 0 秒后弃去，如此重复5 次，拍干； 3 4 1 6 加酶：每孔加入酶标试剂5 0 山，空白孔除外； 研究论文 3 4 1 7 温育：操作3 4 1 3 ； ， 3 4 1 8 洗涤：操作同3 4 1 5 ； 3 4 i 9 显色：每孔先加入显色剂a5 0 p 1 ，再加入显色剂b5 0 “l ，轻轻震 荡混匀，3 7 避光显色1 5m i n ； 3 4 1 1 0 终止：每孔加终止液5 0 山，终止反应( 此时蓝色立转黄色) ； 3 4 1 1 1 测定：以空白孔调零，4 5 0 n m 波长依序测量各孔的吸光度( o d 值) 。 3 4 2 计算 以标准物的浓度为横坐标，o d 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲 线，根据样品的o d 值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即 为样品的实际浓度。 4 统计学处理 用s p s s1 6 o 软件，小样本资料不满足正态性的均用非参数秩和检验 及s p e a h l l a n 相关分析进行统计分析，p o 0 5 即认为有统计学意义。 结果 1 研究对象血清中细胞因子水平的变化 1 1u c 组患者血清中t i 的水平明显高于正常对照组( 9 6 3 6 7 0 8 7 ) ( p o 0 5 ) ；t i 的表达水平为：正常对照组 轻中度活动组 重度活动组 ( 7 0 8 7n m 1 7 2 5 2n 咖1 o 0 5 ) ，重度活动组和正常对照组及 轻中度活动组之间均有明显差异( p o 0 5 ) 。 1 2u c 组患者血清中t 列i p 的水平明显高于正常对照组( 1 5 7 7 8 惯 1 1 9 9 6 ) ( p o 0 5 ) ；表达依次为：正常对照组 轻中度活动组 重度活动组 ( 1 1 9 9 6n g m 1 1 2 1 7 0n m 1 o 0 5 ) ，重度活动组和正常对照 及轻中度活动组之间均有明显差异( p o 0 5 ) 。 2 研究对象结肠镜检查结果及病理特征 2 1 结肠镜检查可见：正常人结肠黏膜光滑完整，血管纹理清晰；轻中度 活动期u c 患者结肠黏膜充血水肿，伴有糜烂、浅溃疡形成，血管纹理不 研究论文 清，黏膜呈颗粒感，轻度质脆；重度活动期u c 患者结肠黏膜高度充血水 肿，伴有糜烂、溃疡形成，表面多覆有脓性或血性分泌物，血管纹理不清， 黏膜中度至重度质脆。 2 2 光学显微镜下可见：正常人结肠组织黏膜腺体排列整齐，上皮完整， 黏膜固有层可见少量炎性细胞浸润；u c 组患者结肠黏膜呈不同程度水肿、 糜烂、溃疡形成，腺体萎缩、坏死，结构破坏，杯状细胞减少或消失，大 量炎性细胞浸润，隐窝脓肿形成。 3 研究对象结肠粘膜中细胞因子的表达 3 1 免疫组织化学染色显示：t i 及t ) ( n i p 的表达均为胞浆着棕黄色， 在正常黏膜主要表达于上皮细胞及腺上皮细胞，u c 患者的结肠黏膜炎性 细胞大量浸润，伴有不同程度的组织结构破坏，t r x 及t i p 的表达位 置与正常黏膜一致，t r x 表达的阳性细胞较正常黏膜明显增多且染色较 深，t 烈i p 表达的阳性细胞较正常黏膜明显减少且染色较浅。 3 2u c 组结肠组织中t i 的表达较正常对照组明显升高( o 2 4 7 6 o 0 7 7 5 ) ( p o 0 5 ) ；t i 在各组中的表达水平为：正常对照组 轻中度活 动组 重度活动组( o 0 7 7 5 o 2 3 7 1 o 2 8 8 6 ) ，各组间的表达均有明显差 异( p 重度活动组( o 3 2 8 5 o 1 4 0 3 0 0 9 6 2 ) ，各组间的表达均有明显 差异( p o 0 5 ) 。 4 相关性分析 4 1 血清中t i 的表达与u c 患者病情的严重程度呈正相关，相关系数 为o 4 2 l ( p o 0 5 ) ；t 烈i p 的表达与u c 患者病情的严重程度呈正相关， 相关系数为o 4 3 9 ( p o 0 5 ) 。 4 2 结肠组织中t r x 的表达与u c 患者病情的严重程度呈正相关，相关 系数为o 9 4 0 ( p o 0 5 ) ；t x n i p 的表达与u c 患者病情的严重程度呈负相 关，相关系数为o 9 4 0 ( p o 0 5 ) 。 4 3 在血清中t i 和t x n i p 表达水平具有相关性，相关系数为o 9 3 0 ( p o 0 5 1 a b l e3c o m p a r i s o no f t h el e v e lo fc y t o l ( i n e si nt h eu ca n dt h en o m a lc o n t r o l s e m m ( m e d i a n ) g r o u p c a s e t r x ( n m 1 )t x n i p ( n m 1 ) u c1 79 6 3 6 a 1 5 7 7 8 a c o n t r 0 12 5 7 0 8 71 19 9 6 c o m p a r e sw i t ht h en o m a lc o n t r o l ： 8 p o 0 5 1 9 研究论文 t a b l e4c o m p 撕s o no ft h el e v e lo f 聊0 1 ( i n e si nt h es e m mo ft h er e s e a r c h c o m p a r e sw i t ht h es e v e r eg r o u p ：a p o 0 5 ；c o m p a r e s w i t ht h en o n n a lc o n t r o l ： b p o 0 5 t a b l e5c o m p 撕s o no ft h e1 e v e lo fc ”o k n e si nt l l eu ca n dt h en o m a lc o n t r o l c o m p a r e s w i t ht h en o 珊a lc o n t r 0 1 ： p o 0 5 t a b l e6c o m p a r i s o no ft h el e v e lo fc y t o l ( i n e si nm ec 0 1 0 n i cm u c o s ao ft h e c o i n p a r e sw i t ht h es e v e r eg r o u p ： a p o 0 5 ； c o m p a r e sw i t hm en o 咖a lc o n t r 0 1 ：b p o 0 5 1 a b l e8c o r r e l a t i o nb e t w e e nt r xa n dt x n i p f a c t o r rp ( s e m m ) t r x a n dt x n i po 9 3 0 8 o o o o ( c 0 1 0 n ) t i a n dt x n i p o 5 51 bo o ol p o s i t i v ec o r r e l a t i o n ： 8 p o 0 5 ； n e g a t i v ec o r r e l a t i o n ： b p o 0 5 2 1 研究论文 讨论 溃疡性结肠炎( u l c e r a t i v ec 0 1 i t i s ，u c ) 是一种病因尚不完全明确的慢 性非特异性炎症性疾病，病变由肠管远端向近端发展，可累及全结肠、直 肠，甚至回盲部肠粘膜。该病病程长，且易反复发作，并可伴有全身多器 官损伤。目前国内外尚没有对u c 确切的根治性治疗措施。u c 病因学的 研究一直都是研究热点，主要集中在免疫、遗传等方面。近年来研究发现， 氧化应激与u c 的发病密切相关【6 1 。在正常生理情况下，机体自身形成的 抗氧化防御系统能够防御正常生命活动中产生的活性氧( r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ，r o s ) 对组织和细胞的损伤。但是，当r o s 产生过量或机体抗 氧化系统与防御系统失衡时，就会产生氧化应激反应。大量的r o s 攻击 富含脂质的细胞膜，发生一系列的脂质过氧化反应，产生自由基，导致细 胞功能损伤，引起组织细胞的凋亡，这与多种炎性疾病的发生密切相关 【7 ，8 1 。机体活性氧的形成和抗氧化系统的失衡在u c 发生发展过程以及肠 粘膜组织中损伤起重要作用。当u c 发生时，患者血管内皮细胞和单核细 胞比正常人产生了更多的超氧阴离子，肠黏膜中吞噬细胞耗氧量也较前明 显增加，通过一系列反应，产生大量0 2 、o h 及脂质过氧化物，脂质过 氧化物的分解产物能够导致细胞和细胞器膜结构的损伤，诱导炎症介质释 放，从而损伤肠黏膜【l 】。氧自由基能够通过脂质过氧化反应产生前列腺素 样物质、白三烯等炎症介质，而这些炎症介质正是u c 时促使机体发生炎 症反应的重要因子【2 1 。p o l l 认为【9 】，活性氧的作用不仅能够导致u c 的肠 道损伤，还可能是其功能紊乱的原因。由此可见，u c 的发病与氧化应激 有着密切的关系。 t i 系统是一类普遍存在于机体各种细胞中的具有氧化还原活性的 小分子蛋白系统，t i 与t x n i p 在维持机体氧化还原平衡中发挥着重要 的作用【1 0 】。t r x 的氧化还原活性依赖于氨基酸序列中二硫键巯基( s 2 s h ) 结构，该结构位于保守序列c y s g l y - p r o c y s 中。在氧化条件下， c y s 3 2 和c y s 3 5 之间形成二硫键，该二硫键又能通过t r x r 催化n a d p h 供氢来发生还原【7 1 ，从而维持t r x 的还原状态。t i 氧化还原调节的功 能与二硫键和巯基这两个集团之间的互变密不可分【1 1 】。机体处于氧化应激 状态时，大量产生的0 2 、0 h 及脂质过氧化物均可诱导细胞中t r x 的表 激时，血清中t i 的表达明显升高，可以证明t i 是一种反应氧化应激 水平的指标。许多炎症相关性疾病中均能检测出t i 的表达上调。t a m a k i 等【l6 】通过实验证实，炎症性肠病患者血清中t r x 的水平明显高于正常对 照组，并与疾病的活动呈相关性。由此可以推测，血清t i 的表达升高 可能是机体对抗氧化应激的防御反应。 本实验采用e l i s a 检测发现，t i 在u c 组患者血清中表达上调，与 u c 病情的严重程度呈正相关( p o 0 5 ) ，并且重度活动组患者血清的t i 表达较轻中度活动组和正常对照组明显升高( p o 0 5 ) 。可能是 因为在u c 轻中度活动期，炎症反应主要局限于结肠粘膜中，或者因为患 者病程短，全身炎症反应尚小，机体内原有的t i 处于消耗状态，大量的 r o s 使得原有的还原型t r x 被氧化。氧化型的t r x 失去了灭活自由基的功 能及与a s k - l 等细胞因子结合的能力，随后激活位于下游的细胞凋亡程 序，导致组织细胞的凋亡和炎症反应的加剧。氧化型t i 又可被t i r 还 原。r o s 持续存在并不断增加，使得u c 患者病情加重，机体的氧化还原 平衡破坏，体内原有的还原型t i 消耗到一定程度后，不能继续抵抗r o s 研究论文 的持续刺激，机体代偿性分泌更多的还原型t r x ，因此t r x 在重度活动组 中表达明显增加。免疫组化结果显示，结肠黏膜组织中t i 的表达随着 u c 病情的加重而增加( p o 0 5 ) ，并与病情严重程度呈正相关，各组间的 差别均有统计学意义( p o 0 5 ) 。根据研究结果分析，t i 可能是结肠黏 膜抵御氧化应激损伤的重要因子之一。组织中t i 的表达水平反映了结肠 组织受到氧化应激损伤的程度。而血清中t i 的表达则反映了全身炎症反 应程度、氧化应激损伤的程度和抗氧化的能力。 t x n i p 是t i 的一种结合蛋白，是t i 功能和表达的负性调节因 子。具有介导氧化应激，促进细胞凋亡的作用【”】。正常生理条件下，t i 能够结合增殖相关基因( p r o l i f e r a t i o n a s s o c i a t e dg e n e ，p a g ) 及促凋亡基 因a s k 1 ，发挥抗凋亡促进细胞增殖的作用，而t x n i p 能够与p a g 和 a s k 1 竞争性结合t i ，使t r x 与p a g 和a s k 1 的结合能力下降，从 而降低了p a g 的促增殖的功能，恢复a s k 1 诱导细胞凋亡的功能【1 8 ，1 9 】。 各因子之间通过复杂的相互作用，维持着细胞的稳态。但是，当机体处于 高氧化状态时，这种相互抑制的氧化平衡关系就会遭到破坏，此时具有介 导氧化应激作用的t x n i p 表达升高，通过一系列反应，介导炎症的产生， 促进细胞的凋亡。r o n 曲i nz h o u 等【2 0 】研究发现，在h 2 0 2 过度表达时， t x n i p 能够从t i 中分离出来，并与n l r p 3 炎性小体结合，诱导细胞 炎症的发生。体外细胞实验【2 1 】研究发现，t i p 过表达能够介导氧化应 激发生，并且抑制了t i 的氧化还原活性。t a k a l l a s h i 等【2 2 用荧光定量 r t - p c r 检测出t x n i p 在u c 患者黏膜中上皮细胞的表达显着低于其在正 常组织中的表达，而原位杂交研究显示，伴随着炎症细胞的浸润，t x n i p 在u c 患者结肠粘膜的淋巴滤泡、固有层和黏膜下层表达增加，而在上皮 细胞表达减少，其认为原因可能有三点：1 病例选取皆为重型u c 患者， 结肠上皮破坏较严重，因此t x n i p 表达下调，可能非氧化应激因素导致； 2 免疫反应伴随着活跃的炎症反应及炎症细胞的大量增加，可能是粘膜下 层及固有层t i p 表达增加的原因；3 t x n i p 在体外试验中短暂的氧化 应激刺激下表达是上调的，可能与体内慢性炎症及持续的氧化应激刺激下 的表达是不同的。由此推断出，t i p 下调可能部分参与了u c 的发病机 制。 本实验中，结肠组织中t x n i p 的表达随着u c 病情的加重逐渐减少， 研究论文 与病情严重程度呈负相关( p o 0 5 ) ，此结果与t a k a d l a s h i 【2 2 】的研究一致。 但本实验t i p 仅在结肠组织粘膜层上皮细胞及腺上皮细胞中表达，未 发现在炎症细胞中表达。此定位检测与t a k a h a s h i 的检测结果有差异。 t a k a h a s h i 等【2 2 】应用i m p c r 及原位杂交技术从基因水平检测其表达，可 能是实验方法不同所致。u c 患者结肠组织中t x n i p 表达降低的具体机 制，本实验未能得到证实，考虑还可能与免疫反应等多种因素有关，而非 单的氧化应激原因，并且可能与u c 相关的结肠癌的发生有关。血清中 t x n i p 的表达随着u c 病情的加重逐渐升高，与病情严重程度呈正相关 ( p o 0 5 ) 。推测t 烈i p 的表达可能是u c 活动期患者体内氧化应激持续 存在的原因，并且与t i 的表达具有相关性。机体存在多种氧化与抗氧 化系统。u c 时，氧化与抗氧化之间相互抑制，相互竞争，加剧了疾病的 发展，同时，机体中相关的细胞因子被活化，免疫系统被启动，在细胞凋 亡、组织损伤中发挥了一定的作用。因此，血清中t x n i p 表达上调可能 是介导氧化应激、削弱t i 作用、诱导细胞凋亡、导致全身炎症反应的 重要原因。关于t x n i p 在u c 患者发病中的研究目前国内未见报道，国 外仅此一篇【2 2 1 ，其具体的作用机制目前尚不明确，考虑可能与多种未知的 因素有关，仍需今后进一步探究。 本次实验未检测临床常用的反映u c 活动性与严重程度的指标，如血 沉、血红蛋白、c 反应蛋白等，亦未考虑季节等外界因素对u c 疾病的影 响。另外，收集的病例较少，未能收集到缓解期病例，并且各组的病例数 均较少( 尤其轻度活动组的病例) ，未能反应出u c 发生发展的各个阶段 中各因子表达的不同。对此，我们将在今后的工作中加大样本量，进一步 应用w e s t e mb l o t 、p c r 等技术，从蛋白分子水平检测t r x 、t x n i p 及其 它细胞因子在u c 中的表达，探讨它们与u c 发病的关系，对u c 的发病 机制做更深入的研究。机体的氧化还原系统是个结构复杂关联甚广的体 系，氧化应激的诱因很多，相关因子种类繁多，且各因子之间联系紧密， 作用机制复杂。因此，很多未知的因素也参与到机体的氧化应激反应中， 需要从更多的角度去探讨这些因素与氧化应激以及u c 发病的关系，这也 是我们今后努力的方向。 研究论文 结 论 1 活动期u c 患者血清中及结肠组织中t r x 的表达随着病情的加重而升 高，与u c 患者病情的严重程度呈正相关，在定程度上可以反映疾病的 活动度。 2 活动期u c 患者血清中的t x n i p 的表达随着病情的加重而升高，与病 情严重程度呈正相关，结肠组织中t i p 的表达随着病情的加重而降低， 与病情严重程度呈负相关。 3t r x 及t x n i p 作为氧化应激的相关因子，可能通过氧化应激机制参与 了溃疡性结肠炎的发病，并在u c 发生发展过程中发挥着重要的作用。 4 监测t i 和t 烈i p 的表达水平对u c 患者的诊断及病情严重程度的评 估有重要意义。 参考文献 1m i l l e rj a n g l e sf m ，r e u t e rb k ，b o b