（免疫学专业论文）抗肿瘤海洋放线菌acma006菌株的筛选、鉴定及其活性物质的初步分离纯化.pdf

中文摘要抗肿瘤海洋放线菌a c m a 0 0 6 菌株的筛选、鉴定及其活性物质的初步分离纯化中文摘要目的：1 从海洋微生物中筛选出1 株或几株具有较强抗肿瘤活性的菌株。2 对筛选出的目的菌株进行分类、鉴定。3 。对目的菌株的培养条件进行优化，并初步分离纯化目的菌株发酵液中抗肿瘤活性物质，为活性物质结构鉴定和进二步利用奠定基础。方法：1 通过m t t 法从海洋微生物中筛选具有较强细胞毒活性的菌株，并检测目的菌株对正常细胞的毒性。2 采州圆形纸片法测定该菌株的抗菌活性。3 通过荧光染色法、d n a 琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪( a n n e x i nv f i t c p 1 ) 方法研究菌株发酵液诱导肿瘸细胞凋亡能力。4 通过形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分分析和1 6 s r d n a 序列测定，对活性菌株进行分类、鉴定。5 采刈单冈子实验和正交设计实验筛选活性菌株的最佳培养基配方；研究温度、种龄、通气量和发酵时间对该凶株的生长和产生抗肿瘤活性物质的影响。6 采川活性跟踪的方法对活性菌株发酵液中的活性物质进行初步分离纯化。结果：1 m t t 筛选结果显示，在供试的9 6 株海洋微生物菌株( 3 1 株海洋放线菌，6 3 株海洋细菌，2 株海洋真菌) 中。约1 3 的放线菌和3 的细菌发酵液具有细胞毒活性；其中放线菌a c m a 0 0 6 细胞毒性很强，且能抑制多种肿瘤细胞的生长。2 进一步研究表明：菌株a c m a 0 0 6 发酵液对人止常肝细胞l 0 2 的毒性较小，i d s o 约为2 2 0 0 ，对h e p g 2 细胞的毒性较人，i d 5 0 约为5 0 0 0 ；而且能够抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长。经菌株发酵液作用的h e p g 2 细胞，出现典型的凋亡细胞的形态学特征，部分细胞的核收缩、碎裂，形成凋亡小体；有明显的d n a 梯形凋亡条带( 1 a d d e rs h a p e ) ；并且，随着发酵液量的增加，h e p g 2 细胞凋亡率逐渐升高。3 经过形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分分析和1 6 s r d n a 序列测定，初步将菌株a c m a 0 0 6 鉴定为链霉菌属中苦伍尔链霉菌华盛顿砸种的一个新的分离菌株。4 通过单因子实验和正交实验发现放线菌a c m a 0 0 6 的最佳碳氮源浓度为：可溶性淀粉1 5 ，甘油1 5 ，胰蛋白胨0 5 ，酵母膏1 。菌株a c m a 0 0 6 的最适发酵条件为：温度2 8 ，种龄6 d ，15 0 m l 二角烧瓶中装液鼙为5 0 m l ，发酵时间8 d 。5 稳定性实验结果表明，发酵液中抗肿瘤活性物质的热稳定和碱性条件稳定性好，经5 0 c 1 0 0 。c 处理2 hj i 彳，或者在p h 7 - 1 0 时，发酵液活性没有明显改变；但p h 2 - 4 时，发酵液活性显著卜降。乙酸乙酯能够葶取到发酵液中人部分的抗肿瘤活性物质：经薄层层析发现乙酸乙酯相中共有6 种组分，其中3 个组分对h e p g 2 细胞有较强的毒性。结论：1 从9 6 株海洋微生物中筛选得到6 株具有细胞毒活性的菌株，其中放线菌a c m a 0 0 6 对肿瘤细胞的毒性很强，对止常细胞毒性较小。2 菌株a c m a 0 0 6 发酵液具有一定的抑菌活性，且能诱导肿瘤细胞发生凋亡。3 菌株a c m a 0 0 6 属于链霉菌属，是伍尔链霉菌华盛顿亚种的一个新的分离菌株。东南大学硕士学位论文4 培养基的成分和培养条件对菌株的生长和产生活性物质的能力会产生不同的影响，优化的培养基能够使菌株a c m a 0 0 6 生长和发酵液中的抗肿瘤活性物质的活性得到最佳发挥。5 从菌株a c m a 0 0 6 发酵液的乙酸乙酯萃取物中得到3 个对h e p g 2 细胞有较强毒性的组分，为活性物质结构鉴定和进一步研发奠定基础。关键词：海洋放线菌；筛选：抗肿瘤活性；菌种鉴定；发酵优化；分离纯化英文摘要sc r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o no ft h em a r i n ea c t i n o m y c e t ea c m a 0 0 6w i t ha n t i t u m o ra c t i v i t ya n dt h ep r e l i m i n a r yi s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft h ea c t i v es u b s t a n c eo ft h es t r a i na b s t r a c to b j e e t i v e ：1 t os c r e e ns t r a i n sw i t ha n t i t u m o ra c t i v i t yf r o mm a r i n em i c r o o r g a n i s m s 2 c l a s s i f ya n di d e n t i f yt h ea c t i v es t r a i n 3 r e s e a r c ho nt h ef a c t o r si n f l u e n c i n gt h eg m w t ho f t h es t r a i na c m a 0 0 6a n dt h ea n t i t u m o ra c t i v i t yo f t h ef e r m e n t a t i o nb r o t h i s o l a t ea n dp u r i f yt h es u b s t a n c e sw i t ha n t i t u m o ra c t i v i t yf r o mt h ef e r m e n t a t i o nb r o t ht oe s t a b l i s ht h ef o u n d a t i o nf o rt h ei d e n t i f i c a t i o no f t h es t m c t u r ea n df u r t h e ru t i l i z a t i o no f t h ea c t i v es u b s t a n c e s m e t h o d s ：1 as c r e e n i n gm o d e lo fm t ti su s e dt oi d e n t i f ya n t i t u m o ra c t i v em a t e r i a lf r o mm a r i n em i c r o o r g a n i s m s ，a n dt h ec y t o t o x i c i t yt ot h en o r m a lc e l l si sa l s od e t e c t e d 2 t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo ft h ea c t i v es t r a i ni sd e t e r m i n e db yp a p e rs t r i pm e t h o d 3 a p o p t o s i si n d u c e db yt h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho ft h ea c t i v es t r a i ni so b s e r v e db yf l u o r e s e e n c es t a i n i n g ，a g a r o s ee l e c t r o p h o r e s i sa n df l o wc y t o m e t r y 4 t h ea c t i v es t r a i ni si d e n t i f i e db yt h es t u d yi n c l u d i n gi t sm o r p h o l o g y ，p h y s i o l o g i e a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，c h e m o t a x o n o m y ，16 s r d n ag e n es e q u e n c e - b a s e dp h y i o g e n e t i ca n a l y s i s 5 e x p l o r et h eb e s tc u l t u r em e d i u mc o m p o s i t i o no ft h es t r a i nw h i c hh a sm o s th i g h e s ta n t i t u m o ra c t i v i t yt h r o u g ht h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n ta n do r t h o g o n a ie x p e r i m e n t o t h e rf a c t ss u c ha st e m p e r a t u r e ，t h ea g eo fs t r a i n ，v e n t i l a t o r yc a p a c i t ya n dt h et i m ef o rc u l t i v a t e di n f l u e n c i n gi t sg r o 、t ha n da c t i v i t yo ft h ef e r m e n t a t i o nb r o t hi ss t u d i e dt o o 6 p r e l i m i n a r yr e s e a r c ho ni s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft h es u b s t a n c e sg e n e r a t e db yt h ea c t i v es t r a i ni su n d e r t a k e nb ya c t i v i t yt r a c k i n g r e s u l t s ：1 t h er e s u l t ss h o wa b o u t13p e r c e n to fa c t i n o m y c e t e sa n d3p e r c e n to f b a c t e r i u mh a v ea n t i t u m o ra c t i v i t y ，e s p e c i a l l ym a r i n ea c t i n o m y c e t ea c m a 0 0 6 t h ea c t i n o m y c e t ea c m a 0 0 6c a nd e p r e s st h eg r o w t ho fd i f f e r e n tt u m o rc e l l s 2 t h ef u r t h e ra n a l y s i ss h o w st h a tt h ec y t o t o x i c i t yo ft h es t r a i na c m a 0 0 6t ot h en o r m a ll i v e rc e l ll 0 2i ss m a l l e rt h a nt h eh u m a nl i v e rc a n c e rc e l lh e p g 2 ，t h ei d s 0t ot h eh e p g 2c e l l si s5 0 0 0w h i l et h ei d 5 0t ot h el 0 2c e l l si s2 2 0 0 t h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho ft h es t r a i nc a l li n h i b i tt h eg r o w t ho ft h es t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n dt h eb a c i l l u ss u b t i l i s a f t e rp r o c e s s e db yt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h ，t h et y p i c a ls h a p eo fh e p g 2c e l l sa p o p t o s i si so b s e r v e db yt h ef l u o r e s c e n c es t a i n i n g t h ed n aa g a r o s ee l e c t r o p h o r e s i ss h o w e do b v i o u sd n al a d d e rp h e n o m e n o ni ne x p e r i m e n t a lg r o u p t h ef c mr e s u l t ss h o wt h a tt h ea p o p t o s i si si n d u c e db yt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h 3 t h es t r a i na c m a 0 0 6i si d e n t i f i e d 鹄o n en e ws t r a i no fs t r e p t o m y c e sc a v o u r e n s i ss u b s p w a s h i n g t o n e n s i sa c c o r d i n gt o16 s r d n ag e n es e q u e n c ea n a l y s i s ，a l o n gw i t ht h em o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a ln i东南大学硕士学位论文c h a r a c t e r i s t i c s 4 t h eb e s tc o n c e n t r a t i o no f c a r b o ns o u r c ea n dn i t r o g e ns o u r c er e s p e c t i v e l yi s ：s o l u b l es t a r c h1 5 ，g l y c e r o l1 5 ，t r y p t o n e0 5 y e a s te x t r a c tp a s t el t h r o u g ht h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n ta n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n sf o rt h eg r o w t ho f t h es t r a i na c m a 0 0 6a r ea sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r e2 8 c ，t h ea g eo ft h es t r a i n6 d ，t h el i q u i dv o l u m eo fc u l t u r em e d i u mi s5 0 m li n15 0 m lt r i a n g u l a rf l a s k , a n dt h et i m ef o rc u l t i v a t e di s8 d 5 t h ea n t i t u m o rs u b s t a n c e so f t h ef e r m e n t a t i o nb r o t hi ss t a b l eu n d e rp h 7 1 0a n dh e a t - r e s i s t a n t , b u ti t sa n t i t u m o ra c t i v i t yd e c r e a s eo b v i o u s l yu n d e rp h 2 4 t h ee t h y la c e t a t ec a l le x t r a c tm o s ts u b s t a n c e sw i t ha n f i t u m o ra c t i v i t yf r o mt h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho ft h es t r a i n b yu s i n gt l c ，6c o m p o u n d si n c l u d i n g3o fw h i c hh a v ec y t o t o x i c i t ya r eo b t a i n e di nt h ee t h y la c e t a t ee x t r a c t c o n c l u s i o n s ：1 6s t r a i n sw i t ha n t i t u m o ra c t i v i t ya r es c r e e n e df r o m9 6s t r a i n so fm a r i n em i c r o o r g a n i s m s 1o fw h i c hh a ss t r o n ga n t i t u m o ra c t i v i t y , a n di t sc y t o t o x i c i t yt on o r m a lc e l l si ss m a l l 2 t h es t r a i na c m a 0 0 6h a sa n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya n dt h ef e r m e n t a t i o nb r o t ho ft h es t r a i nc a ni n d u c et h ea p o p t o s i so ft h et u m o rc e l l s 3 t h es t r a i na c m a 0 0 6i sb e l o n g e dt ot h es t r e p t o m y c e s ，a n di ti si d e n t i f i e da so n en e ws t r a i no fs t r e p t o m y c e sc a v o u r e n s i ss u b s p w a s h i n g t o n e n s i s 4 t h ec o m p o n e n to fm e d i u ma n dt h ec u l t u r ec o n d i t i o n sh a sd i f f e r e n ti n f l u e n c et ot h eg r o w t ha n dt h ea b i l i t yf o rp r o d u c i n ga n t i t u m o ra c t i v i t y t h ec u l t u r em e d i u ma f t e ro p t i m i z e dc a ne n a b l et h es t r a i na c m a 0 0 6r e a c ht oh i g h e s ta n t i t u m o ra c t i v i t yu n d e rs u i t a b l ec o n d i t i o n s 5 3c o m p o u n d so b t a i n e df r o mt h ee t h y la c e t a t ee x t r a c th a v es t r o n gc y t o t o x i c i t y , w h i c he s t a b l i s ht h ef o u n d a t i o nf o rt h ei d e n t i f i c a t i o no ft h es t r u c t u r ea n df u r t h e ru t i l i z a t i o no ft h ea c t i v es u b s t a n c e s k e yw o r d s ：m a r i n ea c t i n o m y c e t e s ；s r e e n i n g ；a n t i t u m o ra c t i v i t y ；s t r a i ni d e n t i f i c a t i o n ；f e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o ni v符呼、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表简写英文中文aa b s o r b a n 吸光率b pb a s ep a i r碱皋对d m s od i m e t h y ls u l f o x i d e- 二甲皋弧砜d n t pd e o x y n u c l e o s i d e 嘶p h o s p h a t e三磷酸脱氧核苷gg r a m克m gm i l l i g r a m毫克m lm i l l i l i t e r毫升i x lm i c r o l i t e r微升m o lm o l e摩尔c mc e n t i m e t e r厘米l a mm i c r o m e t e r微米n mn a n o m e t e r纳米o do p t i c a ld e n s i t y光密度p b sp h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e磷酸缓冲液p c rp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反成d n ad e o x y m o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核陂p hp o w e ro fh y d r o g e np h 值；酸碱度；氧离了指数mm a s s质量vv o l u m e体积dd a y天hh o u r小时ss e c o n d秒r p mr o i l sp e rm i n u t e每分钟转速e be _ t h i d i u mb r o m i d e溴化乙啶p ip r o p i d i u mi o d i d e碘化丙啶m 1 t3 ( 4 ，5 一d i m e t h y l t h i a z o l - 2 - y 0 - 2 ，5 - d i p h e n y l t e t r a z o l i u nb r o m i d e噻唑蓝t b et r i sb o r a t ee d l ab u f f e rt r i s 硼酸缓冲液p c rp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链反应h e p e sn - 2 - h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - n - 2 e t h a n e s u l f o n i ca c i dn 2 羟乙基哌嗪n - 2 乙磺酸t l ct h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y薄层层析v东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。研究生签名：盔越：导师签名：电塑堕码期：综述综述海洋微生物抗肿瘤活性物质研究进展及抗肿瘤作用机理一、国内外海洋微生物抗肿瘤活性物质研究进展海洋微生物由于其生存环境的复杂性，形成了独特的代谢途径，其次生代谢物通常具有极人的多样性、复杂性和高生物活性。已报道的生物活性主要包括抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制、酶及酶抑制、维生素、毒素等，其中抗肿瘤活性已经成为当今天然产物研究的热点【l l 。1 国外海洋微生物抗肿瘤活性物质的研究概况微生物药物是天然药物极为重要的组成部分，其中常见的微生物抗肿瘤药物有2 0 多种，包括柔红霉索、阿霉素、博来霉素、丝裂霉素、放线菌素d 等。这些微生物药物主要来源于陆栖微生物的代谢产物，但随着研究的不断的深入，从陆栖微生物中找剑新的活性物质的儿率越来越小。另外，由于患者长期的服刖这儿种药物，对该类药物产生了不同不同程度的耐药性和抗药性1 2 j 。在海洋生态系统中，海洋微生物不论种类还是数肇，都i i 有绝对的优势。以海洋微生物为资源，来开发海洋药物，儿乎避免了以海洋动植物为资源来开发海洋约物所存在的一系列不利因素l j l 。1 9 6 6 年b u r k h o l d e r 等从波多黎各海域分离得到了食嗅假单胞菌( p s e u d o m o n a sb r o m o t i l i s ) ，该菌株能够产生含嗅吡咯类抗生素硝吡咯菌素( p y r o l n i t r i n ) ，这标志着从海洋微生物代谢产物中寻找新型抗肿瘤约物就成为药物研究开发的热点1 4 l 。2 0 世纪7 0 年代以后，海洋微生物的研究进入了加速发展时期，欧美日本等发达国家在海洋微生物的研究中一直处于领先水平。2 0 0 2 年，日本f u r u m a i 掣5 j 发现来自小单胞菌t p a 0 4 6 8 发酵液的醌环类抗生素k o s i n o s t a t i n ，对2 1 种人类癌细胞具有抑制作h j l c 5 0 小于0 1 “m ，而它和阿克拉霉素a 对人的d n a 拓扑异构酶的i c 5 0 分别为1 - 3 0 p m和3 1 0 p m ，该抗生素对白血病u 9 3 7 细胞的毒性i c s o 为0 0 9 1 i _ t g m l ，与阿克拉霉素a 相当。2 0 0 3 年，b o t o s 掣6 j 从一株海洋蓝细菌( n o s t o c e l l i p s o s p o r u m ) 分离到一个由1 0 1 个氨基酸组成的抗h i v 蛋白c y a n o v i r i n n ( c v n ) ，能阻断h i v 对宿主细胞的黏附和入侵。c v n 对不同株h i v 均有显著的抑制活性，如对h i v - 1 ( 8 9 6 ) ( 以p b l 为攻击细胞) 的e c 5 0 为0 0 0 73 p m o i l ，对h i v i ( i i i b ) ( 以m t - 2 为攻击细胞) 的e c 5 0 为0 0 0 0i 6 1 a m o l l ，对h i v 一1 ( 8 9 6 ) ( 以m o m o 为攻击细胞) 的e c 5 0 为0 0 3 68 1 x m o l l ，对h i v - 1 ( m n ) 的e c 5 0 为0 0 0 23 p m o l l ，对h i v 1 ( r f ) ( 以c e m s s 为攻击细胞) 的e c s o 为0 0 0 0l i t m o l l 。基冈j ：程制备的c v - n 作为局部用药制剂己进入i i i l l 期临床研究。2 0 0 4 年，m i t c h e l l 掣7 j 从米自_ 丁海底沉积物的链霉菌s t r e p t o m y c e sa u r e o v e r t i c i l l a t u sf n p s 0 0 1 5 8 3 ) 中分离得剑一种2 2 个原子的大环内酰胺a u r e o v e r t i c i i l a c t a m ，对多种肿瘤细胞有细胞毒性。f u c h a ol i 等1 8 jt 2 0 0 5 年从海洋放线菌s t r e p t o m y c e ss p 中分离到化合物c h i n i k o m y c i na 币l i c h i n i k o m y c i nb 。c h i n i k o m y c i na 在体外对肾癌、黑色素瘤和乳腺癌具有选择性抑制作用，i c 5 0 分别为4 0 2 p g m l 、4 1 5 p g m l和2 4i 嵋，m l 。c h i n i k o m y c i nb 在体外对乳腺癌有抑制作用，i c 5 0 = 3 0 4 p g m l 。2 0 0 5 年，k a n e ok a n o h 等 9 1 报道了从海洋高温放线菌t h e r m o a c t i n o m y c e ss p y m 3 2 2 5 1 中分离得剑具有抗肿瘤活性的天然产物m e c h e r c h a r m y c i na 和m e c h e r c h a r m y c i nb 。同年，m a l d o n a d ol a 等i lo l 从新分离剑的海洋放线菌s a l i n i s p o r at r o p i c a 中分离出一种新的抗肿瘤活性天然产物s a l i n o s p o r a m i d ea 洲p i 0 0 5 2 ) 。s a l i n o s p o r a m i d ea 能激活蛋白酶体抑制剂，诱导骨髓瘤细胞凋亡，作用机制和已批准上市的抗肿瘤药物硼替佐米( b o r t e z o m i b ) 相同。可导致细胞死亡。2 0 0 6 年，f e n i c a l f 李1 12 】从链霉菌属m a r 2 种分离到到了一类多烯类多聚乙酰衍生物m a r i n o m y c i n s ，它们对某些肿瘤细胞具有明显的抑制作用。美国n s i 进行的体外活性实验显示，m a r i n o m y c i n sa 对8 种肿瘤细胞中的6 种有极强的抑制活性，其中对s k - m e l 2 5 的抑制作用最为明显。2 0 0 6 年6 月，k r a l ja 等【b 】报道了从地中海绿藻分离的真菌e m e r i c e l l an i d u l a n sv a t a c r i s t a t a 中获得的两个具有较强细胞毒活性的新化合物a r u g o s i n sg 和h ，i c 5 0 = 5 5 1 x g m l 。是同年，c u e t om 等i l4 j 从海洋真菌a s p e r g i l l u ss p 中分离得至l j t r o p o l a e t o n e s a d ，其中t r o p o l a e t o n e sa c 在体外对肿瘤细胞株h c t 一1 1 6 的i c 5 0 分别为1 3 2 1 嶝j m l 、1 0 9 p g m l 和1 3 9 1 蝗, m l 。东南大学硕1 ：学位论文经过多年的研究与开发，目前已投入市场应用的海洋药物有抗病毒药物阿糖腺督( v i d a r a b i n e a m a ) ( 1 )和抗癌药物阿糖胞苷( c y t a r a b i n e a r ac x 2 ) 等。迄今为止，国际上有二十余种海洋大然产物或其衍生物止在临床研究阶段，多为抗癌药物( 表1 ) 【1 5 】。表l 目前处于临床试验期的抗肿瘤海洋药物名称来源化学类型临床试验( 期)e c t e i n a s c i d i n7 4 3e c t e i n a s c i d i a生物碱i i i新伐司他( n e o v a s t a t )鲨鱼流浸膏i i i苔鲜抑素i ( b r y o s t a t i ni )b u g u l an e r i t i n a人环内酯hl x6 5 1海洋天然产物的衍生物肽l il u 1 0 3 7 9 3海洋天然产物的衍生物肽t z t 10 2 7海洋天然产物的衍生物肽i ia p l i d i n ea p l i d i u ma l b i c a n s肽i ik a h a l a l i d efe y l s i ar u f e s c e n s b r y o p s i ss p 肽i ih t i 2 8 6c y mb a s t e l l as p 肽l i角娑胺( s q u a l a m i n e )s q u a l u sa c a n t h i a s甾醇i ie 7 3 8 9l i s s o d e n d o r y xs p 大环内酯l ie s - 2 8 5s p i s u l ap o l y n y m a生物碱id i s c o d e r m o l i d ed i s c o d e r m i ad i s s o l u t a聚内酯in v p - l a q 8 2 4海洋天然产物的衍生物生物碱ik r n 7 0 0 0a g e l a sm a u r i t i a n u s生物碱i2 国外海洋微生物抗肿瘤活性物质的研究概况我国地处太平洋两北部，人陆海岸线长达1 80 0 0 多公里，渤海、黄海、东海、南海四个海区面积4 7 0多万平方公里。海域跨越温、亚热、热带三个气候带，海洋生物物种、生态类型和群落结构等方面均有显著的多样性特点i i 川。我国海洋药物研究历史悠久，神农本草经、海药本草、本草纲目和本草纲目拾遗都有海洋药物的记载。中药火辞典( 1 9 7 7 ) 载药57 6 7 种，其中海洋药物1 4 4 种。1 9 9 3 年出版的中国海洋药物辞典收录海洋生物l6 0 0 条，其中，海洋动物药物l4 3 1 条，海洋藻类药物1 2 5 条，其他4 4 条1 1 7 1o 但是在近代海洋研究方面我国起步却相对较晚，也比较薄弱，这几年也在加紧追赶步伐，1 9 9 6 年，科技部娃：式启动了海洋“8 6 3 ”计划，目前己形成上海、青岛、厦门、广州4 个海洋生物技术和海洋药物研究中心1 1 引，海洋约物的研究中抗肿瘤药物的研制与开发成为重中之重。2 0 0 3 年，曾伟等1 1 9 1 从海洋放线菌n 3 5 0 的脂溶性发酵产物中纯化并鉴定了4 个化合物，分别为反式一l3 二十二碳单烯酰胺、7 ，4 _ 二羟基异黄酮、6 。甲氧基7 ，4 二羟基异黄酮及b 一胡萝卜甙。其中，前二种物质具有抗肿瘤活性，抑制人白血病细胞h l 6 0 生长的i d 5 0 分别为7 峙，c m 3 ，2 8 r t g c m 3 ，1 9 p g c m 3 ，抑制入门腔上皮癌k b 细胞生长的i d 5 0 分别为1 5 p g e m 3 ，8 1 l 唱c m 3 ，5 2 1 x g c m 3 ，这些化合物均首次在海洋放线菌中得剑分离。2 0 0 4 年，穆军掣2 0 1 首次从中国东海一株嗜盐的海洋放线菌x d 2 0 菌株中分离至1 j 2 个体生物碱类化合物c p a 季i i c p b ，具有抗炙菌穗l 细胞毒活性。同年，曲叛颜1 2 l 】等利用细胞周期抑割为抗舯瘤活性指标，从其海洋来源的放线菌3 2 9 5 代谢产物中分离得到1 个具有抗种瘤活性的化合物l ，结构鉴定为邻苯二甲酸- 二j 醋。2综述化合物i 对小鼠乳腺癌温敏碍 j t s f t 2 1 0 细胞具有g o g 1 期细胞周期抑制作用。李德海1 2 2 j 等在2 0 0 5 年进行海洋微生物抗肿瘤活性的筛选过程中，从1 10 1 4 的发酵产物分离得到2 5 个化合物，包括五个元环内酯类化合物，8 个酚类衍生物和1 3 个环二肽，采h j s r b 法测定了1 3 个环二二肽的体外抗肿瘤活性，其中环_ 二肽lo d 1 5 p g m l 时有较强的体外抗肿瘤活性，1 、3 、4 、8 、9 、1 2 具有弱的体外抗肿瘤活性，同时发现这些环- 二肽的体外抗肿瘤作用在5 1 0 0 u g m l 范围内不具有浓度依赖性，其它化合物朱表现出体外抗肿瘤活性。2 0 0 5 年，商红强【2 3 】等从采自北极的海泥、海水样品中共分离得到1 0 1 株低温细菌，采用小鼠温敏型乳腺癌t s f t 2 1 0 细胞株和纸片扩散法对其进行了抗肿瘤和抑菌活性筛选，得剑抗肿瘤活性细菌1 株，抑菌活性菌株8 株。于健等f 2 4 l 也在2 0 0 5 年报道了从青岛胶州湾海域海泥样品中分离到黄直丝链霉菌s t r e p t o m y c e sf l a v o r e c t u sz 4 2 0 0 7 ，发现其发酵物化合物i 为新的细胞周期抑制剂，能抑制细胞周期，诱导细胞凋亡。2 0 0 7 年，杨瑞丽等1 2 5 1 采用m t t 法对9 6 株海洋放线菌、细菌、真菌的发酵液进行细胞毒活性的筛选，结果显示1 3 的放线菌和3 的细菌发酵液具有细胞毒活性。其中放线菌a c m a 0 0 6 具有显著细胞毒活性，能够抑制人宫颁癌细胞( h e l a ) 、人肝癌细胞( 7 7 2 1 、h e p g 2 ) 、人大肠癌细胞( l o v o ) 、小鼠骨髓瘤细胞( s p 2 0 )等肿瘤细胞的生长。进一步用d n al a d d e r 电泳分析和荧光染色法观察到放线t 籀a c m a 0 0 6 发酵液能明显诱导肿瘤细胞凋亡。吴少杰等1 2 6 1 从海洋放线菌m 5 1 8 q b 分离到1 个新结构化合物- 甲酰胺基星形孢菌素( n - c a r b o x a m i d o s t a u r o s p o r i n e x i c ) ，以及两个同类型已知化合物星形孢菌素( s t a u r o s p o r i n e x l a ) 暑l l n - 甲酰基星形孢菌素( n - f o r m y l - s t a u r o s p o r i n e ) ( 1 b ) 。为了鳃新化合物的生物活性，对3 7 株人类肿瘤细胞和9 种受试微生物细胞株进行了抑制活性筛选，发现化合物l c 具有强烈的抗肿瘤活性，对3 7 株肿瘤细胞的平均抑制浓度i c 5 0 ，i c 7 0 和i c o o 分别为0 0 1 6 、0 1 7 1 和2 3 5 2 1 a g m l 。其活性强于专利化合物l b 。通过测定发现，分离剑的三种孢菌素类化合物都具有较好的抗微藻活性。李冬等1 2 7 1 采j h j 流式细胞术筛选手段，从海洋样品中分离出放线菌h 2 0 0 3 菌株，其发酵液的乙酸乙酯提取物对小鼠乳腺癌细胞t s f t 2 1 0 显示出明显的坏死性细胞毒活性，采用活性跟踪的分离方法，经多次硅胶枉色谱、凝胶枉色谱及高效液相色谱分离，从菌株h 2 0 0 3 发酵液中分离得到了7 个环二肽化合物。其中化合物l 通过s r b 法测试表现出弱的抗肿瘤活性。我国海洋微生物抗肿瘤活性物质的研究虽然起步较晚，但丰富的海洋资源是一个优势，而且国内科研人员近几年来也在海洋生物研究领域取得了非常显著的成就，尤其是近凡年来我国科学家陆续发现了一批新型抗肿瘤药物i l7 1 ，为癌症的治疗做出了巨人的贡献。二、海洋生物活性物质抗肿瘤作用机理近年来，人们应用多种筛选方法，从海洋天然产物中筛选出约3 0 0 0 种具有抗肿瘤活性的新化合物，并对多种海洋抗肿瘤活性物质进行了临床试验。这些海洋微生物来源的抗肿瘤活性物质绝人多数具有独特的化学结构，其抗肿瘤作用机理亦簟多样性。1 干扰肿瘤细胞有丝分裂和微管聚合而直接杀伤肿瘤细胞微管是真核生物细胞骨架的主要成分之一，它在细胞的有丝分裂中起极其重要作用。而微管的功能依赖了：微管蛋向二聚体动态地结合与分离而处于一种装配与去装配的动态平衡之中，抗微管物质正是抑制了这种动态平衡而干扰微管的功能，从而导致细胞有丝分裂中止，抑制细胞分裂与增殖。研究表明，许多海洋生物活性物质可以通过阻f i = 微管聚合或阻i = 微管解聚而影响细胞分裂，如海绵提取物d i s c o m d e r m o l i d e 、软珊瑚提取物s a r c o d i c t y i n s _ 乖【l e l e u t h e r o b i n s 、海兔提取物d o l a s t a t i n1 0 、含珠藻类中的c r y p t o p h y c i n2 1 以及海鞘提取物e c t e i n a s c i d i n7 4 3 可作用丁纺锤体微管蛋白，抑制肿瘤细胞分裂。海洋微生物中有些通过抑制微管聚合，使纺锤体不能形成，从而使细胞分裂停止在有丝分裂中期：有些通过促进微管聚合，抑制微管解聚。使有丝分裂中- i ：。最终通过抑制微管活性而抑制肿瘤细胞的分裂与增殖，从而达到抗肿瘤的效果。但这些物质是通过哪些机制干扰微管活性尚未完全清楚，有待迸一步深入研究。2 抑制拓补异构酶或端粒酶活性拓补异构酶由丁能将d n a 超螺旋解开以利于d n a 复制，因而以该酶为靶位点的抗肿瘤新药的筛选已引3东南人学硕l ：学位论文起j - 泛关注。如海洋提取物a s c i d i d e m i n 可抑制细胞拓补异构酶i i 的活性，对多种肿瘤细胞具有明显的细胞毒作用。端粒酶是r n a 依赖性的d n a 聚合酶，主要存在丁永生化细胞和8 5 恶性肿瘤中，与细胞永生化有关，端粒酶抑制剂能抑制恶性肿瘤细胞端粒酶的活性，如海藻提取物可抑制人向血病m o l t - 4 细胞端粒酶活性，冈此端粒酶抑制剂可能成为治疗肿瘤