（内科学专业论文）内质网居民糖蛋白kdelc1克隆表达及初步功能研究.pdf

叭y 1 呲7 帆8 眦吣7 吣1 叭0 l l 7 1 1 材料与方法一6 4 结果6 5 讨论6 8 结 念6 9 小结与展望一7 0 参考文献7l 综述7 3 致谢8 7 原创性声明8 8 内质网居民糖蛋白k d e l c1 克隆表达及初步功能研究 研究生：王兴翠 专业：内科学 导师：马丽霞教授 中文摘要 目的 1 构建糖基转移酶k d e l c l 新基因的原核表达载体，诱导融合蛋白表 达，并对其进行纯化，制备融合蛋白多克隆抗体。 2 明确该糖基转移酶在肝细胞内的表达定位及组织分布。 3 探讨k d e l c l 表达变化对h e p g 2 细胞周期可能的调节作用。 4 探讨内质网应激过程中该蛋白表达变化特征。 5 探讨该蛋白在肝细胞损伤中的调节作用。 、 方法 1 克隆、表达k d e l c l 融合蛋白。 应用逆转录聚合酶链反应( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r ，r t - p c r ) 技术， 以人肝母细胞瘤细胞系( h e p g 2 细胞) 为模板提取总r n a ，反转录e d n a ， 扩增目的基因k d e l c l 的全长c d s ，并将其克隆至p g e m t - e a s y 载体，测 序验证。随后将k d e l c l 全长片段插入原核表达载体p e t - 3 2 a ( + ) 中，转 化大肠杆菌e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) ，i p t g 诱导融合蛋白表达，分别通过聚丙烯 酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 法和免疫印迹( w e s t e r nb l o t ) 法，分析验证融 合蛋白表达的特异性。随后大量诱导该蛋白表达，利用亲和层析法对表达蛋 白进行纯化。 2 制备k d e l c l 的多克隆抗体。 以纯化的融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔，获得多克隆抗体。同时 以免疫前后的兔血清作为一抗，利用w e s t e r nb l o t 技术和e l i s a 方法对多克 隆抗体进行特异性分析和效价检测。 3 构建k d e l c l 细胞内定位载体。 扩增k d e l c l 全长c d s ，将全长片段插入至绿色荧光蛋白真核表达载体 p e g f p c 1 中，分别用双酶切、测序进行鉴定，从而构建k d e l c l 与绿色荧 光蛋白基因真核共表达质粒p e g f p c 1 k d e l c l 。随后利用已构建的内质网 1 居 利 4 利用上述制备成功的k d e l c l 多克隆抗体，采用免疫组织化学技术，观 察分析k d e l cl 在肝脏、肺、肾脏、脾脏、胃、乳腺、淋巴结、直肠组织中 的分布特征。 5 构建、筛选k d e l c l 干扰质粒。 委托i n v e n t r o g e n 公司，构建k d e l c l 干扰质粒。将多对k d e l c l 干扰 质粒转染h e p g 2 细胞，4 8 小时后收获细胞，提取总r n a 并逆转录，通过实 、时荧光定量p c r ( r e a l t i m ep c r ) 技术筛选出有效序列( p c d n a 6 2 g w e m g f pm i r k d e l c ls h r n a ) 。 6 分析k d e l c l 表达变化对细胞周期的影响。 分别利用p e g f p c1 - k d e l c1 和p c d n a 6 2 一g w e m g f p m i r k d e l c 1 s h r n a 载体，转染h e p g 2 细胞，调节k d e l c l 的表达，利用流式细胞仪分 析k d e l c l 高表达和低表达对细胞周期的影响。 7 初步探讨k d e l c l 在内质网应激中的作用。 利用衣霉素刺激h e p g 2 细胞，建立细胞内质网应激模型。分别利用 w e s t e r nb l o t 、r e a l t i m ep c r 法，检测内质网应激过程中k d e l c l 蛋白水平 和m r n a 水平的表达变化情况。 8 初步探讨k d e l c l 在临床肝损伤中的作用。 收集临床肝功能异常血清标本及正常对照血清标本，利用e l i s a 技术包 被酶标板，采用上述制备的k d e l c l 多克隆抗体，分析该蛋白在肝损伤过程 中可能的变化情况。 结果 1 成功获得k d e l c l 融合蛋白。 人肝母细胞瘤细胞系h e p g 2 经l o 小牛血清d m e m 培养3 6 h 后，t r i z o l 法从h e p g 2 细胞中提取总r n a 。经r t - p c r 扩增获得h e p g 2 细胞c d n a 。 成功构建k d e l c l 的原核表达载体p e t 3 2 a ( + ) k d e l c l ，转化大肠杆菌 e c o l ib l 2 1 表达菌，经多次实验验证，确认终浓度为l m m o l l 的i p t g 、3 0 、 4 h 可诱导表达出k d e l c l 融合蛋白，经s d s p a g e 和w e s t e r nb l o t 检测确认。 2 2 成功获得k d e l c l 的多克隆抗体。 利用亲和层析柱，使用终浓度为l0 m m 咪唑的结合缓冲液，依次加5 0 ， 1 0 0 终浓度为15 0 r a m 的咪唑结合缓冲液，5 0 ，l0 0 的5 0 0 mm 眯唑结合 缓冲液洗脱层析柱，得到k d e l c l 的融合蛋白，经w e s t e r nb l o t 、s d s p a g e 验证。将所得k d e l c l 融合蛋白免疫新西兰大白兔5 次，取其血清，使用蛋 白a 琼脂糖层析柱纯化k d e l c l 多克隆抗体，经w e s t e r nb l o t 检测证明该抗 体有较好的特异性。 3 成功构建k d e l c l 的细胞内定位载体。 。分别构建真核表达质粒p e g f p c 1 k d e l c l 、p e r f p c a l r r t i c u l i n n l ， 经双酶切、测序鉴定后，共转染h e p g 2 细胞。激光共聚焦显示p e g f p c 1 k d e l c l 与内质网居民蛋白e a l r e t i c u l i n 存在共定位现象。 4 初步了解k d e l c l 在组织中的分布特征。 利用免疫组织化学技术发现，k d e l c l 高表达于肝组织，弱表达于其他 组织。胃、直肠以及喉组织较少表达；弱表达于肾小管，肾小球及系膜组织 表达较弱。肺组织中度表达；淋巴结及脾脏高表达，主要表达于生发中心周 围较成熟的淋巴细胞。 5 成功构建、筛选出k d e l c l 的干扰质粒。 通过实时荧光定量p c r ( r e a l t i m ep c r ) 技术成功筛选出s h r n a 干扰质 粒p c d n a 6 2 一g w e m g f p m i 卜k d e l c 1s h r n a ( p c d n a 6 2 一k d e l c1s h r n a ) 。 6 k d e l c l 的表达变化参与调节细胞周期。 流式细胞仪结果显示k d e l c l 表达质粒p e g f p c 1 k d e l c l 转染后的 h e p g 2 细胞s 期显著显著增加；而转染k d e l c lr n a 干扰质粒p c d n a 6 2 k d e lc 1 r n a i 1 后s 期显著降低。 7 k d e l c i 与内质网应激有关。 在衣霉素诱导的内质网应激过程中，k d e l c l 在蛋白水平和m r n a 水平 表达基本一致，不同浓度的药物组之间蛋白表达无明显变化，但与非药物组 相比，k d e l c l 的表达有较高程度的上调。 8 k d e l c l 与临床肝损伤有关 通过e l i s a 技术分析，结果表明k d e l c l 蛋白在肝功能异常组较正常 组表达明显增高。 3 结论 1 k d e l c l 原核表达融合蛋白分子量7 5k d a ，免疫动物制备的k e d l c l 的蛋白多克隆抗体具有较高的k e d l c l 结合活性。 2 k e d l c l 与内质网居民蛋白e a l r e t i c u l i n 蛋白存在共定位关系，提示 k e d l c l 定位于内质网。 3 k e d l c l 在肝脏、肺、肾脏、脾脏、胃、乳腺、淋巴结、直肠组织 中均有表达。 4 k e d l c l 参与调控细胞周期，高表达促进细胞增殖，低表达抑制细 胞增殖。 5 衣霉素诱导的内质网应激对该蛋白表达有明显影响，提示该蛋白可能 与内质网应激有关。 6 k d e l c l 蛋白可能诱导肝损伤发生。 关键词糖蛋白，内质网应激，克隆表达，r n a 干扰，细胞周期 4 c l o n i n ge x p r e s s i o na n df u n c t i o n a la n a l y s i so f ae n d o p l a s m i e r e t i c u l u mr e s i d e n tg l y p r o t e i n ，k d e l c1 g r a d u a t es t u d e n t ：x i n g c u iw a n g s p e c i a l i t y ： m e d i c i n e s u p e r a d v i s o r ：p r o f l i x i am a a bs t r a c t 0 b j e c t i v e 1 e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o nk d e l c 1a n dp r e p a r a t i o nt h ep o l y c l o n a l a n t i b o d yo fk d e l c 1 2 d e t e r m i n et h el o a c a t i o no fk d e l c li nt i s s u e sa n dc e l l s 3 a n a l y s i st h ee f f e c to fk d e l c 1o nt h ec e l lc y l eo fh e p g 2c e l l s 4 d e m o n s t r a t et h ec h a r a c t e r so fk d e l c 1e x p r e s s i o nd u r i n ge n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s s 5 e x p l o r et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nk d e l c 1a n dh e p a t i cc e l l si n j u r y m e t h o d s 1 e x p r e s st h ef u s i o np r o t e i n o fk d e l c l t h eg e n eo fk d e l c1i sa m p l i f i e df r o mh e p g 2e d n a ，w h i c hi sc l o n e di n t o p e t 3 2 a t h ef u s i o np r o t e i n ，k d e l c 1 ，i se x p r e s s e di nb l 2 1a n dp u r i f e d ，w h i c h i sc o n f i r m e db ys d s p a g ea n dw e s t e r nb l o t 2 p r e p a r ek d e l c ip o l y c l o n a la n t i b o d y k d e l c 1 p o l y c l o n a la n t i b o d yi sp r e p a r e d f r o mi m m u n e dn e wz e a l a n d r a b b i t s ，w h i c hi sd e t e r m i n e db yw e s t e r nb l o ta n de l i s a 3 d e t e r m i nt h el o c a t i o no fk d e l c li nh e p g 2c e l l s p e g f p k d e l c 1a n dp e r f p c a l r r t i c u l i n n1p l a s m i da r ec o n s t r u c t e da n d t r a n s f e c t e di n t oh e p g 2c e l l s t h el o c a t i o no fk d e l c 1i nh e p g 2c e l l si si m a g e d b yc o n f o c a lm i c r o s c o p e 4 a n a l y z et h ec h a r a c t e ro fk d e l c l l o c a t i o ni nt i s s u e s t h em e t h o do fi m m u n o h i s t o c h e m i s t r yi su s e dt od e m o n s t r a t et h el o c a t i o n o fk d e l c1i nt i s s u e s 5 c o n s t r u c ta n ds e l e c tt h es h r n ap l a s m i d so fk d e l c l e n t r u s ti n v e n t r o g e nc o r p o r a t i o nt oc o n s t r u c tt h ek d e l c 1s h r n ap l a s m i d s k d e l c1s h r n a p l a s m i d sa r et r a n s f e c t e di n t oh e p g 2c e l l sf o r4 8h r s r e a l t i m e p c rm e t h o di su s e dt os e l e c tt h eh i g h e s te f f e c t i v ek d e l c 1s h r n a ( p c d n a 6 5 p l a s m i d sa r es e p a r a t e l yt r a n s f e c t e d i n t oh e p g 2c e l l s t h ee f f e c to fu pa n d d o w n r e g u l a t e dk d e l c 1o nt h ec e l lc y c l e so fh e p g 2c e l l sa r ed e t e r m i n e db y f a c m 7 d i s c u s st h ef u n c t i o no fk d e l c li nt h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s h e p g 2c e l l sa r et r e a t e dw i t ht u n i c a m y c i na n dt h ec h a r a c t e r so fk d e l c l e x p r e s s i o nd u r i n ge n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s sa r ei l l u s t r a t e d t h ek d e l c 1 m r n al e v e la n dp r o t e i nl e v e li ne n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s p r o c e s sa r e a n a l y z e d 8 d i s c u s st h ef u n c t i o no fk d e l c li nt h ec l i n i c a ll i v e rd a m a g e t h es e r u m so fl i v e rf u n c t i o n a b n o r m a la n dn o r m a lp e r s o n sa r ec o l l e c t e d k d e l c1 p o l y a n t i b o d yi sb e d d e di nt h ee l i s ap l a t e sa n dt h ec h a r a c t e r so f k d e l c1e x p r e s s i o ni sa n a l y z e db ye l i s am e t h o d s r e s u l t s 1 o b t a i nk d e l c lf u s i o np r o t e i ns u c c e s s f u l l y s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c tt h ep l a s m i do fp e t 3 2 a - k d e l c 1a n de x p r e s si t s f u s i o np r o t e i nw h i c ha r ec o n f i r m e db ys d s - p a g ea n dw e s t e r nb l o t 2 o b t a i nk d e l cip o l y c l o n a la n t i b o d ys u c c e s s f u l i b yt h ea f f i n i t yp u r i f i c a t i o nm e t h o d s ，k d e l c 1f u s i o np r o t e i ni so b t a i n e d t h ep u r i f i e dk d e l c1f u s i o np r o t e i ni m m u n e sn e wz e a l a n dw h i t er a b b i tf o r5 t i m e s p o l y c l o n a la n t i b o d yo fk d e l c 1 i so b t a i n e df r o mi m m u n e dr a b b i t s s e r u m w e s t e r nb l o tr e s u l t ss h o wt h ea n t i b o d yh a sg o o ds p e c i f i c i t y 3 k d e l c ll o c a t e si ne n d o p l a s m i cr e t i c u l u m t h ep l a s m i d so fp e g f p - c1 - k d e l c1a n dp e r f p - c a l r r t i c u l i n n1w e r e c o n s t r u c t e d ，w h i c hw e r et r a n s f e c t e di n t oh e p g 2c e l l s t h ei m a g e so fc o n f o c a l m i c r o s c o p ei n d i c a t et h a tk d e l c 1l o c a t e si ne n d o p l a s m i cr e t i c u l u m 4 k d e l c le x p r e s si nd i f f e r e n tt i s s u e s i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yr e s u l t ss u g g e s tt h a tk d e l c 1i se x p r e s s e di nl i v e r ， s t o m a c h ，s p l e e n ，k i d n e y ，r e c t u m ，g a l a c t o p h o r e ，a n a t o m y ，l u n gt i s s u e s k d e l c 1 i sh i g h l ye x p r e s s e di nl i v e r ，b u tw e a k l yi no t h e ro r g a n i z a t i o n s 5 c o n s t r u c ta n ds c r e e nk d e l c ls h r n a s e l e c tt h em o s te f f e c t i v ek d e l c1s h r n a ( p c d n a 6 2 k d e l c1s h r n a ) 6 6 t h ek d e l c le x p r e s s i o na f f e c t sc e l lc y c l e f l o wc y t o m e t e rr e s u l t ss h o wt h a tu p r e g u l a t e dk d e l c 1c o u l di n c u d u c e c e l l p r o l i f e r a t i o n h o w e v e r ，d o w n r e g u l a t e d k d e l c1c o u l di n h i b i tc e l l p r o l i f e r a t i o n 7 k d e l c li sr e l a t e dt oe n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s k d e l c 1 e x p r e s s i o ni s i n c r e a s e di nt u n i c a m y c i n t r e a t e dg r o u pc o m p a r e d w i t ht h ec o n t r o lg r o u p 8 k d e l c li sr e l a t e dt oc l i n i c a ll i v e rd a m a g e e l i s ad a t a sd e m o n s t r a t et h a tk d e l c 1i su p r e g u l a t e di nl i v e rf u n c t i o n a b n o r m a lg r o u pc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p d i s c u s s i o n t h em o l e c u l a rw e i g h to fk d e l c1f u s i o np r o t e i ni sa b o u t7 5k d a t h e p o l y c l o n a la n t i b o d yo fk d e l c 1h a st h eg o o db i n d i n ga c i t i v i t yw i t hk d e l c 1 f u s i o np r o t e i n 1 k d e l c1i sl o c a t e di ne n d o p l a s m i er e t i c u l u m 2 i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yr e s u l t ss u g g e s tt h a tk d e l c 1i se x p r e s s e di nl i v e r ， s t o m a c h ，s p l e e n ，k i d n e y ，r e c t u m ，g a l a c t o p h o r e ，a n a t o m y ，l u n gt i s s u e s 3 t h eu p r e g u l a t e de x p r e s s i o no fk d e l c 1i n d u c e sc e l l p r o l i f e r a t i o n h o w e v e r ，d o w n r e g u l a t e de x p r e s s i o no fk d e l c 1i n h i b i t sc e l lp o l i f e r a t i o n 4 k d e l c1i sr e l a t e dw i t he n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s 5 k d e l c1m a yi n d u c el i v e ri n ju r y k e yw o r d sg l y p r o t e i n ，e n d o p l a s m i cr e t i c u l u ms t r e s s ，c l o n e ，r n ai n t e r f e r e n c e ， c e l lc y c l e 7 英文缩写英文全称 a m p a p b p b s a d e p c d m s 0 e b 符号说明 a m p i c i l l i n a m m o n i u mp e r s u l f a t e b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n d i e t h lp y r o c a r b o n a t e d i m e t h y ls u l f o x i d e e t h i d i u mb r o m i d e 中文全称 氨苄青霉素 过硫酸铵 碱基对 牛血清白蛋白 焦磷酸二乙酯 二甲基亚砜 溴化乙锭 e d t a e h y l e n e n d i n i r 。l 。e t r a a c e i c 乙二氨四乙酸e d t a 乙二氮必厶酸 a c i d e l i s a f b s h b v h c v i p t g o d p b s r n a s e r n a i i m p c r s d s e n z y m e - l i n k e d i m m u n 。s 。r b e m 酶联免疫吸附实验 a s s a y 。 f e t a lb o v i n es e r u m胎牛血清 h e p a t i t i sbv i r u s乙型肝炎病毒 h e p a t i t i scv i r u s i s o p r o p y l t h i - b - d g a l a t o s i d e o p t i c a ld e n s i t y p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e r i b o n u c l e a s e r n ai n t e r f e r e n c e 丙型肝炎病毒 异丙基硫代一p - d 一半乳糖苷 光密度 磷酸盐缓冲液 核糖核酸酶 r n a 干扰 r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r逆转录聚合酶链反应 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠 t e m e d t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e u p ru n f o l dp r o t e i nr e s p o n s e 8 n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺 未折叠蛋白质反应 主要仪器设备 仪器名称型号公司 p c r 扩增仪 分析天平 空气浴振荡器 高速台式离心机 t y p h o o n t r i o 凝胶成像系统 紫外光栅分光光度计 稳压稳流型电泳仪 低温高速离心机 纯水仪 制冰机 低温高速离心机 涡旋振荡器 激光共聚焦显微镜 台式真空泵 p h 计 超声破碎仪 a k t ap u r i f i e r 多功能低温离心机 倒置显微镜 核酸蛋白含量测定仪 数显培养摇床 酶标仪 制冰机 c 0 2 培养箱 p t c 一2 0 0 b i o r a d 公司 m p 5 0 0 b上海的天平仪器厂 h z q c哈尔滨的东联电子公司 5 417 r美国的i e c 公司 美国的g e 公司 2 0 0 0 d台湾的a l p h a 公司 d u 6 4 0美国的b e c k m a n 公司 d y y - i i i - 8 b 北京的六一仪器厂 t d 5 i i湖南的仪器离心机厂 c l a s s i c德国的p a l l 公司 f 1 5 0 1美国的s c o t s m a n 公司 2 1 r 美国的b e c k m a n 公司 w h - 8 6 1 太仓市仪器厂 德国的z e i s s 公司 z k 一8 0 1上海的浦江仪器厂 6 2 6 美国的o r i o n 公司 v c x l 3 0 p b 美国s o n i c s u p c 一1 0 0美国的g e 公司 3 k 1 5 s i g m a 公司 c l x 41 - a 3 2 p ho l y m p u s 公司 6 131德国e p p e n d o r f 公司 q y c 一2 0 0上海福马 m k 3t h e r m o f m 5 0 北京长流 h f 9 0 h e a lf o r c e 9 】l “1 一 刖舌 内质网是细胞内的一个高度动态的细胞器，处于持续的运动与结构变化 之中，在细胞代谢中参与很多关键性作用：包括蛋白质合成，折叠，穿行， 钙离子稳态控制及脂质合成。不仅对糖蛋白的细胞内穿行具有关键性作 用，也决定细胞膜通道蛋白在细胞表面的分布心1 ，以及病毒包膜蛋白，如乙 型肝炎病毒表面蛋白的组装及分泌。因蛋白折叠质量控制异常，或内质 网应激导致的细胞凋亡更被认为与肿瘤的发生有关，而干预内质网应激已经 成为肿瘤药物的一个重要靶点心1 。 慢性h b v 感染过程中，p r e s 突变被认为与肝癌的发生有关。而p r e s 突 变导致肝癌的机制尚不明了。已知p r e s 突变可以导致内质网应激及氧化应 激性损伤被认为与肝癌的发生有关1 。内质网是h b v 包膜蛋白糖基化修饰及 组装的关键细胞区室，p r e s 区突变导致内质网应激的一个显著的特征是内质 网呈毛玻璃样改变。内质网应激导致的d n a 氧化性损伤与基因组的稳定性下 降与肝癌的发生密切相关1 。 作为内质网应激的适应性反应，首先诱导蛋白质未折叠反应。未折叠或 折叠错误的蛋白质会积聚子内质网内，上调内质网伴侣分子的表达，籍此恢 复细胞内环境的稳态。但严重或持久的内质网应激反应将会诱导细胞凋亡。 尽管内质网应激诱导细胞凋亡的可能信号途径推测与线粒体依赖和非依赖 机制有关，但对酵母细胞内质网应激及未折叠蛋白反应的观察表明，至少3 0 0 多个基因与内质网应激及凋亡上游信号传导有关( 详见综述部分) 。哪些u p r 相关基因介导了h b v 诱导的内质网应激无疑将是未来h b v 相关肝癌发病分子 生物学机制研究的主要方向之一。 既往我们在对h b v 致病机制研究过程中发现，乙型肝炎病毒表面大蛋白 转染h e p g 2 细胞后，其基因芯片分析结果显示k d e l c i 表达显著上调，推测 该蛋白可能与h b v 感染导致肝细胞内质网应激有关。本研究旨在体外克隆表 达该蛋白，制备其多克隆抗体，明确该基因在肝细胞内表达定位及组织分布 特征，并对该蛋白在内质网应激过程中表达变化规律，临床肝损伤过程中的 体内变化特征进行初步观察。 1 0 第一部分：k d e l c 前言 糖蛋白是由寡糖和多肽链共价修饰连接而形成的一类具有重要生理功 能的蛋白质。蛋白质中的糖链在维持蛋白质稳定，抵抗蛋白水解酶，阻止抗 体识别方面具有重要作用。机体绝大多数膜蛋白及分泌蛋白为糖基化修饰蛋 白，糖基化修饰蛋白约占细胞总蛋白半数以上伟6 1 。内质网约3 0 多种膜结合 蛋白，另外尚有3 0 多种蛋白位于内质网腔。内质网是细胞内蛋白质折叠及 二硫键形成唯一的细胞区室盯1 。显然，目前多数内质网蛋白功能已经基本明 确，而k d e l c l 是目前为数不多功能尚未知的内质网蛋白之一。 既往我们在对h b v 致病机制研究过程中发现，乙型肝炎病毒表面大蛋 白转染h e p g 2 细胞后，其基因芯片分析结果显示k d e l c l 表达显著上调， 推测该蛋白可能与h b v 感染导致肝细胞损伤的发病机制有关。本研究旨在 体外克隆表达该蛋白，并对其功能进行初步研究。 材料和方法 1 材料 1 1 试剂 1 1 1 主要试剂 玻璃奶回收试剂盒购于威格拉斯公司，逆转录试剂盒购于t a k a r a 公司， 鼠抗一h i s 单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠i g g 购于北京中杉生物 公司，化学发光底物购于p i e r c e 公司，蛋白分析试剂盒购于s i g m a 公司，h i s t r a p f f5 亲和层析柱及n i n t a 树脂购于美国g e 公司，c a t e l i s a 检测试 剂盒购自r o c h e 公司，b c a t m p r o t e i na s s a yk i t 、弗氏不完全佐剂，弗氏完全 佐剂购于s i g m a 公司，鼠抗一h i s 的单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 i g g 、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔i g g 、d a b 显色剂购于北京中杉生物公 司，化学发光底物购于p i e r c e 公司，考马斯亮蓝( c b b ) 购自s i g m a 公司， p v d f 膜( 0 4 5 “m ) 购自m i l l i p o r e 公司，t m b 过氧化物酶底物系统购于k p l 公司，封闭蛋白干粉购于b d 公司，t w e e n 2 0 购于s o l a r b i o 公司。 1 1 2 t 具酶 e c o ri 、h i n di i i 、k a p n l 等限制性内切酶，无d n a 酶的r n a 酶购于t a k a r a 公司，t 4d n a 连接酶购于p r o m e g a 公司，p c r 使用得t a q 酶购于鼎国生物公 司。 1 1 3 核酸分子量标准 d l 2 0 0 0d n am a r k e r 购于t a k a r a 公司。 1 1 4 化学试剂 琼脂糖购于上海y i t o 公司，胎牛血清购于h y c l o n e 公司，d e p c 试剂、t r i z o l 试剂购于i n v i t r o g e n 公司，d m e m 培养基、丙烯酰胺、n 、n 一亚甲双丙烯酰胺 及i p t g 购- 于p r o m e g a 公司，酵母提取物购于o x i o d 公司，d n t p 购于t a k a r a 公司，氨苄西林购于华北制药有限公司，胰酶为本室配制及保存。脱脂奶粉 购于鼎国生物科技有限公司，其他试剂均为使用的国产分析纯，胎牛血清 ( f b s ) 购于h y c l o n e 公司，重组血管紧张素i i 、d m e m 培养基、丙烯酰胺、 n 、n 亚甲双丙烯酰胺、牛血清白蛋白( b s a ) 购于p r o m e g a 公司。 1 2 菌株、细胞系及实验动物 e c o l id h 5 a ，e c o l ib l 2 l 和肝母瘤细胞系h e p g 2 均为本室己保存，新西 1 兰大白兔购于北京大学医学实验动物饲养中心。 1 3 质粒 p g e m t e a s y ，p e t 一3 2 a ( + ) ，p m d l 8 - t 质粒均来自于本室已保存。 1 4 引物合成及测序 寡核苷酸引物合成由北京的奥科生物公司完成，测序由上海博尚生物公 司及北京的奥科生物公司完成。 1 5 主要溶液配置 ( 1 ) d m e m 培养液 成份剂量 d m e m 干粉剂 1 0 o g 碳酸氢钠3 7 9 青霉素 1 0 0 u m l 链霉素 l o o u m l 混匀后，调节p h 值至7 3 7 4 间，加去离子水定容至l0 0 0 m l ，配制后使 用o 2 2g m 的微型滤器过滤，然后分装，保存于一2 0 c 冰箱内，使用之前加入 终浓度为1 0 的胎牛血清。 ( 2 ) 0 1mp b s 成份剂量 k c l 0 2 9 k h 2 p 0 4 o 2 9 n a 2 h p 0 4 。12 h 2 0 2 9 9 n a c i 8 0 9 混匀后，调节p h 值至7 3 7 4 间，去离子水定容至1 0 0 0 m l 。 ( 3 ) 胰酶消化液 成份剂量 p b s 1 0 0 m l 胰酶o 2 5 9 混匀后，使用0 2 2l a m 微型滤器过滤，o 0 4 9e d t a 加入到1 0 0 m l 三蒸水 中混匀高压灭菌，将上述液体等体积混合后保存于4 。c 备用。 ( 4 ) s d s p a g e1 2 分离胶 成份剂量 水 3 3 m l 3 0 丙烯酰胺4 0 m l 1 5 mt r i s h c l ( p h 8 8 ) 2 5 m l 1 0 s d s0 1 m l 1 0 过硫酸铵0 1 m l t e m e d 0 0 0 4 m l ( 5 ) s d s p a g e5 浓缩胶 成份剂量 水 2 1m l 3 0 丙烯酰胺 o 5 m l l m t r i s h c i ( p h 6 8 ) 0 3 8 m l 1o s d s 0 0 3 m l 1 0 过硫酸铵 0 0 3 m l t e m e d 0 0 0 3 m l ( 6 ) s d s p a g e 电泳缓冲液 ( 1 0 0 0 m 1 ) 成份 、 剂量 t r i s b a s e 3 0 9 甘氨酸 1 4 4 9 s d s 1 0 9 ( 7 ) w e s t e r nb l o t 转移缓冲液( 1 0 0 0 m 1 ) 成份剂量 t r i s b a s e 5 8 2 9 甘氨酸 2 9 3 9 s d s o 3 7 5 9 ( 8 ) t b s t( 1 0 0 0 m 1 ) 成份剂量 t r i s b a s e ( p h 8 0 ) 1 0m l n a c i 8 8g t w e e n2 0 0 5m l 1 4 ( 9 ) 湿菌液( 6 0 m 1 ) 成份 lmt r i s b a s e o 5 me d t a 剂量 1 2m l 6 0 0r t l ( 10 )洗涤液( 15 0 m 1 ) 成份 剂量 0 5 m 尿素 4 5g 1 mt r i s b a s e 3m l 0 5 me d t a 1 5m l 2 mn a c l 1 5m l 1 0 t r i t o n 1 5 m l ( 1 1 )结合缓冲液( 10 0 m 1 ) 成份剂量 2 0 m m o l ln a 3 p 0 40 7 6 9 、 5 0 0m m o l ln a c l 2 9 2 9 ( 1 2 )质谱用液 成份 剂量 1 mn h 4 h c 0 3 ：o 8 9n h 4 h c 0 3 + 1 0 m lh 2 0 1 0 m l 6 0 c h 3 c n 0 i t f a ：3 0 m lc h 3 c n + 2 0 m lh 2 0 + 5 u l t f a 5 0 m l 5 0 c h 3 c n 5 0 h 2 0 ：l m lc h 3 c n + l m l h 2 0 2 m l 3 0 c h 3 c n 10 0 m mn h 4 h c 0 3 ：o 6 m lc h 3