（免疫学专业论文）cd4t细胞内三磷酸腺苷浓度与肾移植术后免疫状态关系的研究.pdf

硕士学位论文 l-l-，ibi919。3ii c d 4 + t 细胞内三磷酸腺苷浓度与肾移植术 后免疫状态关系的研究 硕士研究生：张长征 指导老师：陈政良 摘要 在器官移植领域，虽然目前移植技术已基本攻克，但是排斥反应仍然是移 植医生和病人面临的最大问题，也是移植物长期存活的最大障碍。术后长期或 终身服用免疫抑制剂足预防排斥反应的主要手段，所以必须进行移植术后免疫 状态的监测。 目前免疫状态的监测主要包括受体全身情况的评估、移植肾功能状态的测 定、移植物组织病理学的检查、免疫抑制剂的血药浓度监测及受体免疫系统的 评估等几个方面。受体全身情况的评估和移植。肾功能状态的改变具有非特异性， 感染等其他并发症也可能导致上述情况的发生，因此只能作为调整免疫用药的 参考。移植物组织穿刺病理学检查无疑是判定排斥存在与否的最准确方法，但 是肾穿刺活检是一种有创性检查，可能发生穿刺相关并发症，不易反复监测。 免疫抑制剂血药浓度的监测是目前评估免疫状态、调整临床用药的主要依据， 在预防和治疗急性排斥反应中发挥了重要的作用。但由于个体药代动力学的差 异和影响免疫功能因素的复杂性，许多病人仍难以完全避免排斥反应的发生。 淋巴细胞计数、淋巴细胞亚群c d 3 、c d 4 、c d 8 细胞比例是评估受体免疫状态简 单而实用的方法，但是淋巴细胞计数无特异性。因此，必需进行t 细胞各种亚 型的分析，才能有助于判定免疫状态，预示急性排斥反应的发生。目前主要存 在的问题是没有一个定量的指标能确定细胞因子浓度升高到何种水平时与排斥 的发生有关。而且细胞因子通过网络彼此互相影响，水平波动较大。 中文摘要 器官移植的排斥反应主要是细胞免疫，起关键作用的细胞是c d 4 + t 细胞。大 多免疫抑制检测和免疫抑制治疗都是以c d 4 + t 细胞作为主要研究目标。免疫细胞 的功能直接或间接依赖于细胞内a t p 的能量供应，所以测定细胞内a t p 的浓度 可以反映免疫细胞的功能状态。三磷酸腺苷生物发光法( a t p - c v a ) 是一种敏感性 很高的进行a t p 定量分析的方法，其基本原理是在a t p 的参与下，虫荧光素酶 催化它的小分子底物虫荧光素氧化，将化学能转化为可见光，用照度计测 得的相关光单位( r l u ) 与a t p 浓度呈线性关系，通过标准曲线可以得出检验样本 中的a t p 浓度。 本课题应用a t p - c v a 法检测植物血凝素( p h a ) 刺激后c d 4 + t 细胞内a t p 的浓 度来反映免疫细胞功能。通过对肾移植病人的细胞免疫( c m i ) 功能进行动态监 测，观察肾移植患者术前和术后4 周及发生急性排斥反应、巨细胞病毒性肺炎 时及治疗后的细胞免疫功能状态，了解移植患者术后免疫状态的变化情况及在 预示排斥反应、巨细胞病毒性肺炎中的作用。本课题旨在探讨a t p e v a 法在临 床应用的可行性及其在评估肾移植术后免疫状态、指导临床用药、预示急性排 斥反应、巨细胞病毒性肺炎和实施个体化免疫治疗中的作用。 【目的】 1 探讨a t p - c v a 法检测。肾移植术后患者免疫状态在临床应用中的可行性。 2 采用a t p - c v a 法动态监测肾移植患者c d 4 + t 细胞经p h a 刺激后a t p 值的变 化趋势，了解肾移植术后患者的细胞免疫功能状态。 3 通过a t p - c v a 法动态监测。肾移植患者发生急性排斥反应、巨细胞病毒性 肺炎时及治疗后的细胞免疫功能状态，了解移植患者术后免疫状态的变化情况 及在预示排斥反应、巨细胞病毒性肺炎中的作用。 【方法】 1 a t p 标准曲线的制定 1 1 取a t p 标准品l m g ，用r m p i - 1 6 4 0 培养基稀释成系列浓度1 0 6 、1 0 5 、1 0 4 、 1 0 乱、1 0 2 、1 0 、l n g m l ； 1 2 稀释后的a t p 与i m m u k n o w n - c y l e x 荧光试剂混合后，用照度计检测产 硕士学位论文 生的荧光； 1 3a t p 值与r l u 取l g ，制定标准曲线。 2 细胞免疫功能监测 采用a t p - c v a 法对3 0 例正常健康人群和9 0 例肾移植手术病人( 术前和术后 1 、2 、3 、4 周) 的全血样本进行免疫细胞功能检测。发生急性排斥和巨细胞病毒 性的病人进行治疗前后的监测。具体检测步骤如下： 2 1 稀释的全血样本放在9 6 微孔板中与p h a - l 孵育1 5 一1 8 小时； 2 2 应用带有抗c d 4 单克隆抗体的磁珠分离c d 4 + t 细胞： 2 3i m m u k n o w u - c y l e x 荧光试剂与分离的细胞混合，使细胞裂解释放出a t p 并与试剂中的虫荧光素、荧光素酶发生反应； 2 4 照度计检测产生的荧光，对照a t p 标准曲线得出a t p 的浓度。 【结果】 1 当a t p 浓度在1 0 0 - 1 0 4 n g m l 之间时，与r l u 呈直线关系。直线方程为 y = o 7 5 x + 2 3 7 ( r = o 9 9 4 5 2 ) ； 2 1 通过4 周的连续随访，3 0 例志愿者的c d 4 + t 淋巴细胞a t p 水平较为稳 定，卜4 周分别为：( 4 3 7 2 5 5 6 1 6 ) n g m l 、( 4 0 2 3 8 6 4 0 9 ) n g m l 、( 4 3 6 9 5 6 7 0 5 7 ) n g m l 、( 4 4 3 8 4 8 2 2 5 ) n g m l 。四周的a t p 值经方差分析，组间差 异无统计学意义( p o 0 5 ) ，将数据9 0 置信区间检测分析认为正常人群的c d 4 + t 淋巴细胞a t p 水平为3 2 0 n g m l 一5 2 0 n g m l 。 2 2 通过年龄进行分组分析，以联合国世界卫生组织年龄段划分：4 4 岁为 年龄分层标准，超过4 4 岁的健康者为4 人，随访4 周的c d 4 + t 淋巴细胞a t p 水平为 ( 3 8 9 3 9 1 1 1 0 ) n g m l ，其余为小于4 4 岁者随访4 周的c d 4 + t 淋巴细胞a t p 水平为 ( 4 3 6 3 7 3 6 0 5 ) n g m l 。两年龄组进行w i l c o x o n 秩和检验，其差异有统计学意 义( k o 0 5 ) 。 2 3 通过性别进行分组分析，其中男性健康者1 9 人，随访4 周的c d 4 + t 淋巴 i i i 后l 周，治疗后2 周a t p 水平分别为：术前( 4 5 6 2 1 1 0 2 0 6 ) n g m l ，术后第一 周( 1 8 4 0 9 4 2 6 3 ) n g m l ；急性排斥出现时( 3 0 8 8 1 6 9 4 3 ) n g m l ；治疗后 i n ( 2 3 5 3 5 2 3 2 2 ) n g m l ；治疗后2 周( 2 5 8 3 6 3 4 7 6 ) n g m l 。急性排斥出 现时a t p 水升高，但仍低于术前水平，经配对t 检验，t = 1 1 2 1p ( o 0 0 0 1 ，其急性 排斥出现时的a t p 值与术前a t p 值的差异有统计学意义；随急性排斥逆转，a t p 水 平逐渐下降，2 周时仍高于术后1 周水平，经配对t 检验，t 一3 o l ，p = - o 0 2 3 7 ( p ( o 0 5 ) ，其治疗后2 周与术后1 周差异有统计学意义。 5 1 8 例发生肺部感染受者确诊时c d 4 + t 细胞a t p 浓度下降( 8 9 1 3 8 8 5 ) n g m l ，低于术后1 周水平( 9 5 8 4 1 2 3 8 ) n g m l ，经配对t 检验，t = 6 5 4 ， 尸 0 0 0 0 1 ，其差异有统计学意义；明显低于术前水平( 3 8 1 4 2 1 0 1 3 2 ) n g m l ， 经配对t 检验，t = 1 2 5 4 ，p o 0 0 0 1 ，其差异有统计学意义，病情加重时下降更 加明显；治疗好转后( 治疗后1 周) a t p 浓度有所回升( 9 2 9 1 8 9 7 ) n g m l ，2 周后a t p 浓度( 9 6 7 4 8 6 0 ) n g m l ，但仍低于术前水平，经配对t 检验，t = 1 2 1 2 ， p o 0 0 0 1 ，其差异有统计学意义；采用抗体诱导组与未使用的移植组患者在感染 发生后及经治疗随访中的每个检测时期相比，c d 4 + t 细胞a t p 水平均较低，经t 检验，其差异有统计学意义。 i v 硕士学位论文 【结论】 1 应用a t p - c v a 法检测肾移植患者术后的细胞免疫功能状态，简便、有效， 可以为临床检测预防器官排异反应及预防免疫相关性感染提供新的理论思路。 2 a t p - c v a 法检测的a t p 值在急性排斥反应发生时有上升的趋势，在并发 巨细胞病毒性肺炎时有下降的趋势，对急性排斥反应及巨细胞病毒性肺炎的发 生可能有一定的预示作用。 3 对移植患者应用a t p - c v a 法常规监测，有利于快速判定细胞免疫状态， 实施个体化免疫治疗。 关键词 肾移植免疫c d 4 t 淋巴细胞三磷酸腺苷排异反应巨细胞病毒感染 v 硕士学位论文 t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e na t p c o n c e n t r a t i o ni nc d 4 + tc e l l sa n di m m u n e s t a t ea f t e rh u m a n k i d n e yt r a n s p l a n t a t i o n n a m e ：z h a n gc h a n g z h e n g s u p e r v i s o r ：c h e nz h e n g l i a n g a b s t r a c t a c u t ec e l l u l a rr e j e c t i o n ( a c r ) a f t e ro r g a nt r a n s p l a n t a t i o ni st h em o s ti m p o r t a n t p r o b l e mf o r t h er e c i p i e n t sa n da l s oi st h eo b s t a c l et ot h e l o n g s u r v i v a l i m m u n o s u p p r e s s a n t sa f t e rt r a n s p l a n t a t i o n f o rl i f et i m ea r et h em a i n m e t h o d st o o v e r c o m et h i sp r o b l e m s oi ti si m p o r t a n tt om o n i t o rt h ei m m u n o s u p p r e s s i v es t a t eo f t h ep a t i e n ta f t e ro r g a nt r a n s p l a n t a t i o n c u r r e n t l y , t h e m e t h o d so f m o n i t o r i n gi m m u n o s u p p r e s s i v e s t a t ea f t e ro r g a n t r a n s p l a n t a t i o n i n c l u d e sa p p r a i s a lo fg e n e r a l s t a t e ，r e n a lf u n c t i o n ，p a t h o l o g i c a l e x a m i n a t i o no f g r a f t ，t h e c o n c e n t r a t i o no f i m m u n o s u p p r e s s a n t s a n d i m m u n o s u p p r e s s i v es t a t eo fr e c i p i e n t s g e n e r a ls t a t eo fr e c i p i e n t sa n dr e n a lf u n c t i o n a r en o ts p e c i a la n dt h es a m ec h a n g ec a nb eo b s e r v e dw h e ni n f e c t i o na n do t h e r c o m p l i c a t i o no c c u r r e d p a t h o l o g i c a l e x a m i n a t i o no fg r a f ti st h e g o l d c r i t e r i at o d e t e r m i n ew h e t h e ra c r p r e s e n t so rn o t ，b u ti ti sat r a u m a t i ce x a m i n a t i o na n ds o m e r e l a t e dc o m p l i c a t i o n sm a yo c c u r t h ec o n c e n t r a t i o no fi m m u n o s u p p r e s s a n t si s f o u n d a t i o nt o a p p r a i s ei m m u n o t o l e r a n c ea n da d j u s tc l i n i c a lm e d i c a t i o n h o w e v e r , a c ro c c u r r e d i n e v i t a b l y i n m a n yp m i e m sb e c a u s eo fi n d i v i d u a l d i f f e r e n c eo f p h a r m a c o k i n e t i c s l y m p h o c y t ec o u n ta n dt h ep r o p o r t i o no fl y m p h o c y t es u b s e ta r e e a s ya n df e a s i b l em e t h o d st oa p p r a i s ei m m u n o s u p p r e s s i v es t a t e t h e d e t e c to f c y t o k i n e ，s u c ha si l - 2 ，i l - 4 ，i l 一6 ，i l - 8 ，f a sl ，t n f , i f n ，i c a m 一1a r eu s e f u lt o d i a g n o s ea c r a f t e ro r g a nt r a n s p l a n t a t i o n , aq u a n t i t a t i v ei n d e xo fc y t o k i n ei sn o t a b s t r a c t a v a i l a b l et od e t e r m i n ew h e t h e ra c r p r e s e n to rn o t c d 4p o s i t i v etl y m p h o c y t ep l a y sa l li m p o r t a n tr o l e i na c ra f t e ro r g a n t r a n s p l a n t a t i o na n di st a r g e to fi m m u n o s u p p r e s s i v et h e r a p y t h ef u n c t i o no fi m m u n e c e l l d e p e n d s o nt h ea t ps u p p l yd i r e c t l yo ri n d i r e c t l y , s od e t e c t i o no ft h e c o n c e n t r a t i o no fa t pc a nr e f l e c tt h ef u n c t i o no fi m m u n o c y t e s a t p - c v am e t h o di s a nh i g h l ys e n s i t i v em e t h o dt od e t e c ta t pq u a n t i t a t i v e l y f u n d a m e n t a lp r i n c i p l ei s w i t ht h ep r e s e n c eo fa t el u c i f e r a s ec a t a l y z e sl u c i f e r i n ea n df l u o r e s c e n c ei sd e t e c t e d b yf l u o r o m e t e r l i n e a rr e l a t i o ne x i s t sb e t w e e nt h ev a l u eo ff l u o r e s c e n c ea n da t p c o n c e n t r a t i o n ，t h ea t pc o n c e n t r a t i o no fs a m p l ec a nb ec a l c u l a t e dt h r o u g hs t a n d a r d c u r v e i nt h i ss t u d y ，a t p c v aw a su s e dt om e a s u r et h ei n t r a c e l l u l a ra t pc o n c e n t r a t i o n o fc d 4p o s i t i v etc e l ls t i m u l a t e db yp h at or e f l e c tt h ei m m u n ef u n c t i o n r e n a l r e c i p i e n t sw e r ea s s y e dt h ei m m u n es t a t eu s i n ga t p c v ap r ea n dp o s tt r a n s p l a n t t h e o b j e c t o ft h i s s t u d y i st of u r t h e r e x p l o r e ar a t i o n a l s u p p o r t i n g t i t r a t i o no f i m m u n o s u p p r e s s i v et h e r a p y ，p r e d i c tt h eo c c u r r e n c eo fr e j e c t i o n ；s oa st or e d u c et h e r i s ko fr e n a lr e c i p i e n t ss u f f e r i n gf r o md r u gt o x i c i t ye f f e c t ，o p p o r t u n i s t i ci n f e c t i o na n d c a n c e ra n di m p r o v et h e i rl i v i n gq u a l i t ya n ds u r v i v a l i no u rs t u d y , a t p - c v aw a su s e dt om e a s u r et h ep o s t - r e n a lt r a n s p l a n ti m m u n e f u n c t i o n d i l u t e dw h o l eb l o o ds a m p l e sw e r ep l a c e di n9 6w e l lm i c r o t i t e rp l a t e sa n d i n c u b a t e dw i t ht h e p h y t o h e m a g g l u t i n i n l ( p h a - l 1 f o r15 - 18h o u r s a f t e r t h e i n c u b a t i o n ，c d 4 + tc e l l sw e r ei m m u n o s e l e c t e du s i n gm o n o c l o n a la n t i b o d y ( m c a b ) - c o a t e dm a g n e t i cp a r t i c l e sa n dl y s e dt or e l e a s ei n t r a c e l l u l a ra t er e l e a s e da t pw a s d e t e c t e d u s i n gf i r e f l y l u c i f e r i n l u c i f e r a s es y s t e ma n dq u a n t i f i e d u s i n ga na t p c a l i b r a t i o nc u r v e b e f o r eu s i n gt h i sa s s a yt ot e s tt h es a m p l e s ，t h ea t pc a l i b r a t i o nc u l v em u s tb e d e t e r m i n e df i r s t l y t h ea t ps t a n d a r ds u b s t a n c ew e r ed i l u t e dw i t hn u t r i e n ti n t of i v e r c o n c e n t r a t i o n s ：1 、10 ，10 0 ，10 0 0a n d10 0 0 0 n g r r d 2 0 0 u lo fe a c hd i l u t e ds t a n d a r d s p e c i m e nw a sd i s p e n s e d i n t ot h r e ew e l l sa f t e rm i x e dw i t ht h es a m ev o l u m e c e l l t i t e r - g l o m sl u o r e s c e n tr e a g e n t r e l a t i v el i g h tu n i t ( r l u ) w e r em e a s u r e db y l u m i n o m e t e rw i t h i na nh o u ra f t e rm i x t u r e a t pc a l i b r a t i o nc o n c e n t r a t i o n sv s r l u 硕士学位论文 v a l u e sw e r ep l o t t e do nal o g l o gs c a l e ，a n dl i n e a rr e g r e s s i o na n a l y s i sg e n e r a t e da c a l i b r a t i o nc u r v e t h e r ew a sag o o dl i n e rr e l a t i o nw h e na t pc o n c e n t r a t i o n sv a r i e d f r o m ln g m lt ol0 0 0 0 n g m l ，y = o 7 5 x + 2 3 7 ( t h e c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tr = 0 9 9 4 5 2 ) t h e s ed a t ac o n f i r m e dt h a tt h ea s s a yc o u l db eu s e dt om e a s u r et h ei m m u n e f u n c t i o nb e c a u s et h er e l e a s e di n t r a c e l l u l a ra t pc o u l db eq u a n t i f i e du s i n gt h ea t p c a l i b r a t i o nc u r v e a t pc o n c e n t r a t i o n si nc d 4 + tc e l l so ft h er e c i p i e n t su n d e r g o i n g r e n a l t r a n s p l a n t a t i o nw e r e ( 3 9 8 1 7 士1 0 8 2 1 ) n g m lb e f o r eo p e r a t i o n ，s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a n n o r m a lv o l u n t e e r s ( 4 3 7 2 5 士5 6 1 6 ) n g m l ，( p 0 0 5 ) ，r e a c h e dt h el o w e s ti nt h ef i r s t w e e ka f t e ro p e r a t i o n ，e s p e c i a l l yi nt h er e c i p i e n t ss u b j e c tt oa n t i b o d y i n d u c i n g t h e r a p y ，t h e ni n c r e a s e ds l o w l yo nt h ep o s t - o p e r a t i o nw e e k2 ，b u ts t i l ls i g n i f i c a n t l y l o w e rt h a np r e - o p e r a t i o nb yt h ef o u r t hw e e k ( 3 2 9 6 4 士6 7 5 7 ) n g i t l l ( p 0 0 5 ) ，t h e nd e c r e a s e ds l o w l y w i t he f f e c t i v et r e a t m e n ta f t e rt w o w e e k s ( 2 5 8 3 6 士3 4 7 6 ) n g m l ，s t i l lh i g h e rt h a nt h a to ft h ef i r s tw e e ka f t e ro p e r a t i o n ( 18 4 0 9 士4 2 6 3 ) n g m l ( p 0 0 5 ) i n18 p a t i e n t sw i t hc y t o m e g a l o v i r a lp n e u m o n i a ，t h el e v e lo fa t p d e c r e a s e d ( 8 9 13 士8 8 5 ) n g m l ，a n dw a ss l i g h t l y l o w e rt h a nt h a to ft h ef i r s tw e e ka f t e ro p e r a t i o n ( 9 5 8 4 士1 2 3 8 ) n g m l ，t h e r ew a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ( 尸 o 0 0 0 1 ) ，s i g n i f i c a n t l y l o w e rt h a np r e o p e r a t i o n ( 3 8 1 4 2 士1 0 1 3 2 ) n g m l ( 氏0 0 0 0 1 ) ，d e c r e a s e de s p e c i a l l y w h e np a t h o g e n e t i cc o n d i t i o nw a sa g g r a v a t e d ，t h e ni n c r e a s e ds l o w l yw i t he f f e c t i v e t r e a t m e n t ，s t i l ll o w e rt h a np r e - o p e r a t i o ni nt h es e c o n dw e e ka f t e ro p e r a t i o n ( 9 6 7 4 士8 6 0 ) n g m l ( p 0 0 5 ) i nc o n c l u s i o n ，m o n i t o r i n gt h ei m m u n ef u n c t i o np o s tr e n a lt r a n s p l a n t a t i o nb y a t p b i o l u m i n e s c e n c ea s s a yi no u rs t u d yp r o v e dt h a ti tc a nb eu s e dt om e a s u r et h e c m if u n c t i o np o s t - r e n a lt r a n s p l a n t a t i o n p e r h a p st h ei m p o r t a n to b s e r v a t i o nf r o mt h i s a b s t r a c t t r a i li st h a tt h el e v e lo ft a c r o l i m u sb yi m m u n o a s s a yo fw h o l eb l o o di sn o tc o r r e l a t e d w i t ht h ed e g r e eo fb i o l o g i c a li m m u n o s u p p r e s i o na sm e a s u r e db yt h ep h a i n d u c e d a t pl e v e l s ，t h i se m p h a s i z et h ei m p o r t a n c eo fh a v i n gaf u n c t i o n a lr e a d o u tt h eg l o b a l i m m u n o s u r p r e s s i o n m a y b eu s i n gt h i sa s s a yt om e a s u r et h ei m m u n ef u n c t i o no fr e n a l r e c i p i e n t sa n dm o n i t o r i n gt h ed r u gl e v e l si nb l o o dc a na c h i e v eab e t t e rr a t i o n a l s u p p o r t i n gi n d i v i d u a l i z e dt i t r a t i o no fi m m u n o s u p p r e s s i v et h e r a p y k e y w o r d s k i d n e yt r a n s p l a n t a t i o n ：i m m u n i z a t i o n ；c d 4 + tl y m p h o c y t e s ；a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ；r e j e c t i o nr e a c t i o n ：c y t o m e g a l o v i r u s ；i n f e c t i o n i v i 1 1 6 6 7 8 9 的研究 1 1 1 1 2 材料与方法1 2 3 结果1 5 4 讨论2 0 参考文献2 3 第三章c d 4 + t 细胞内三磷酸腺苷浓度与肾移植术后急性排斥关系的研究2 7 1 一般资料2 7 2 材料与方法2 7 3 结果3 0 4 讨论3 2 参考文献3 3 第四章c d 4 + t 细胞内三磷酸腺苷浓度与肾移植术后巨细胞病毒性肺炎关系的 研究3 5 1 一般资料3 5 2 材料与方法3 5 3 结果3 9 目录 4 讨论4 2 参考文献4 3 全文小结4 5 缩略词表4 6 攻读学位期间成果。4 7 致谢4 8 学位论文原创性声明4 9 统计学证明5 0 硕士学位论文 前言 器官移植是2 0 世纪后半叶医学领域中的一大进展。1 9 5 4 年世界上首次成功 地进行了孪生双胞胎之间的肾脏移植。由此拉开了世界范围内对于肾脏移植研 究的序幕，肾脏移植已经成为终末期肾病唯一有效的治疗方式。随着强力新型 免疫抑制剂的问世、有效保存液的开发、器官移植相关技术与处理逐渐进入成 熟阶段。根据美国器官共享联合网络( t h eu n i t e dn e t w o r kf o ro r g a n s h a r i n g ，u n o s ) 的统计数据显示：2 0 0 3 年美国共进行了肾移植共1 万5 千余例 。我国肾移植工作正处于飞速发展阶段，截至2 0 0 9 年1 月1 日为止我国进行 了超过5 0 0 0 0 余例肾移植乜1 。目前国外报道的尸体。肾移植的移植肾1 年存活率已 经达到了8 8 4 ，5 年存活率为6 5 5 ；而活体肾移植的移植肾的1 年存活率为 9 4 5 ，5 年存活率已经达到了7 8 6 口1 。为避免移植术后急性排斥反应的发生， 绝大部分移植受体需要长期或终身服用免疫抑制药物。然而，长期的随访发现 肾移植术后器官功能丧失与免疫抑制剂相关的并发症如感染，心血管疾病，复 发性疾病和新生肿瘤等密切相关，而术后慢性排斥反应只占晚期器官功能丧失 和受体死亡的一小部分。近年来，随着新一代免疫抑制剂的研发以及临床应用 已使全世界范围内的肾移植术后超急性，急性以及慢性排斥反应发生率明显下 降。但由于该类药物的免疫抑制能力更强，免疫过度发生率却亦逐年上升h 吲。 因此，正确评估移植术后的免疫状态，合理调整免疫抑制剂的用量，实施个体 化免疫抑制治疗，成为当前移植领域研究的热点。 环抱霉素和他克莫司是肾移植术后常用的免疫抑制剂“1 ，临床应用时采用单 克隆抗体检测方法测定药物浓度，并根据检测结果调整给药剂量。由于个体药 代动力学的差异和检测方法的不同，测定的血药浓度不一定与药物的剂量直接 相关1 7 1 0 而且，手术、麻醉、失血、移植后时间、移植器官的类型以及药物的 相互作用都会影响到细胞免疫功能状态，所以检测的血药浓度与实际免疫抑制 剂的疗效也相应受到影响8 1 ，到目前为止，还没有一种方法能够把这些复杂因 前言 素都考虑进去，准确评估移植后受体的实际免疫状态。 为了能够以最低的药物剂量，维持有效的免疫抑制剂浓度，广大移植工作者 一直致力于发现一种更好的监测移植术后免疫状态的方法，并进行了不懈的探 索。目前临床应用的方法有外周血t 细胞亚群、细胞因子、细胞粘附因子、含 供者基因的微嵌合体的测定、群体反应性抗体( p r a ) 水平监测、移植物细针抽吸 细胞的免疫学检查、特异或非特异性淋巴细胞体外混合培养反应以及基因芯片 技术的应用等。但是，由于这些免疫指标监测目前仍存在不少问题，如价格较 贵和监测程序繁琐等缺点9 1 ，因而在临床应用上受到一定的影响，仍不能替代 血药浓度监测作为调整免疫抑制药物的依据。 研究发现，免疫细胞的功能直接或间接依赖于细胞内a t p 的能量供应“们， 早在1 9 8 3 年，m o y e r 和h e n d e r s o n u l 提出内源性a t p 的数量可以反映细胞的活 性度。2 0 0 0 年s o t t o n g 等n ，提出应用多种抗原刺激淋巴细胞的微培养方法， 通过三磷酸腺苷生物发光法测定刺激后细胞内的a t p 的浓度来反应免疫细胞的 功能。三磷酸腺苷生物发光法( a t p - c v a ) 是a t p 定量检测的一种方法，其基本原 理是在a t p 的参与下，虫荧光素酶催化它的小分子底物一虫荧光素氧化，将化 学能转化为可见光，所产生的生物荧光可以很容易地被带有光电倍增管的检测 器测定。s o t t o n g 认为该方法适用于传染病、疫苗疗效、移植耐受和肿瘤治疗反 应的监测。此后，这种方法被广泛地应用于人群中免疫抑制状态的评估。在监 测h i v 的治疗中发现可以较早的反应出免疫功能状态的变化，效果优于病毒负 荷和c d 4 数目的检测n 2 1 随着人们对正确评估移植术后免疫功能状态重要性认识的不断深入，移植工 作者开始尝试应用a t p - c v a 法来评估患者的细胞免疫状态，探讨其在指导临床 免疫用药和实施个体化免疫治疗中的作用。由于环孢霉素和他克莫司都把c d 4 + t 细胞作为靶细胞，通过减少i l - 2 的转录来抑制t 细胞的激活，作用的关键环节 在于抑制t 细胞线粒体的呼吸链，而呼吸链反应的主要能量就是细胞内的a t p 【”。 这表明a t p - c v a 法在评估移植患者的免疫状态方面具有是有一定的针对性。2 0 0 3 年k o w a l s k i 1 钉报道了多个中心应用这种方法检测正常健康人群和移植后病人免 2 硕士学位论文 疫状态的结果：明显健康的成人对照组( n = 1 5 5 ) 刺激后a t p 平均水平为4 3 2 n g m l ； 移植患者( n = 1 2 7 ) 的平均水平为2 8 2 n g m l ，较健康人低1 5 0n g m l ，有显著差异。 9 2 的移植患者刺激后的a t p 水平低于5 2 5n g m l ，9 4 的明显健康的成人刺激后 a t p 水平高于2 2 5 n g m l 。据此将任何时刻患者的免疫反应状态界定为低( 4 2 2 5 n g m 1 ) ，中等( 2 2 6 5 2 4 n g m 1 ) ，强( 5 2 5 n g m 1 ) ，三个反应状态。 最为理想的情况是：临床医师根据患者整体的免疫情况，将免疫抑制药物 的使用剂量维持在一个既不发生排异反应，又不会导致患者免疫水平过分低下 的水平。因此目前对于患者免疫水平的检测成为肾移植术后的重要问题。目前 常用的免疫指标主要包括：细胞因子、细胞毒效应分子、c d 分子、趋化因子、 转移体内延迟免疫反应、血浆药物浓度等等n 引。然而这些方法亦存在问题，要 么由于不同个体对于免疫药物的敏感性不同而导致血药浓度往往不能准确的反 应患者实际的机体免疫水平，要么由于方法繁琐，费时，不易于在临床上广泛 推广，要么敏感性和或特异性不甚理想。总之目前尚未存在一种公认的最为有 效的检测方法及指标。 c s a 和f k 5 0 6 是目前临床上肾移植受体术后最为主要的免疫抑制剂。其主要 的作用机制为：通过抑制白细胞介素2 的转录达到对c d 4 + t 淋巴细胞功能的抑制作 用，在预防和治疗排斥反应时c d 4 + t 淋巴细胞成为其主要的靶细胞n 。c d 4 + t 淋巴 细胞做为重要的免疫细胞，起到了对机体进行自体免疫的主要作用。因此目前 肾移植术后免疫检