（作物遗传育种专业论文）转bar基因小麦的抗性检测及其相关综合性状的研究.pdf

中文摘要 本研究主要从b a r 基因的抗性检测和转h a ，基因对小麦农艺性状的影响两 个方面进行研究，主要研究结果如下： 1外源基因的导入 本研究对基因枪法获得的转b a r 基因小麦t 、r 代及回交法获得回交后代 b c 】、b c 2 进行p p t 抗性检测、p a t 酶活性检测、g s 酶活性检测及d n a 分子检 0 n , j ，证实转基因株系及回交后代均己导入b a r 基因。这一结果表明对于一些已经 获得转基因材料的目的基因，通过回交将目标基因转育到其它品种，不失为一条 简便快捷的有效途径。因此，将回交转育法与基因枪法、农杆菌介导法和花粉管 通道法等直接转化方法相结合，可大大加快转基因目标性状小麦新品种的选育， 发挥转基因小麦在育种上的利用价值。 2 抗性检测 采用种子萌发生测法和苗期生测法进行p p t 抗性鉴定表明，抗性植株表现出 不同程度的抗性，而敏感植株明显受到抑制。 p c r 分子检测结果表明，抗性株系扩增出长度约为5 7 1 b p 的特异片段，而阴 性对照却无任何条带，说明外源b a r 基因己进入受体植株。 g s 酶活性检测发现，用草丁膦处理过的非抗性小麦，植株叶片g s 酶显著下 降，叶片失水，植株死亡；而转b a r 基因小麦g s 酶活性在显著下降后又在短时 间内逐渐恢复至正常水平。 p a t 酶活性测定结果表明，在基因枪法转化获得的转b a r 基因小麦植株中， p a t 酶活性较高；在回交育种法获得的回交一代、二代植株中，部分植株检测出 一定的酶活，而部分植株未检测出酶活。 3 对叶绿素含量的影响 本研究发现，用草丁膦处理后，抗性植株叶片的叶绿素含量与未喷施草丁膦 的对照的叶绿素含量无明显差异，敏感植株叶片g s 酶活性发生下降，叶绿素含 量也显著下降，与对照差异显著。说明革丁膦明显影响非抗性小麦叶片叶绿素的 含量，但对抗性品种的叶绿素含量没有影响。 4b a r 基因的抗性遗传 本实验对转基因株系t 。、r 代的b a r 基因遗传进行了观察，结果表明，b a r 基因遗传符合3 ：1 的分离比率；而回交后代符合l ：l 的分离规律。说明通过回 交可以方便地将b a r 基因转育到其它小麦品种中去。 5 转b a r 基因对小麦农艺性状的影响 本实验用回交转育法将b a r 基因转入当地小麦品种，并结合早代选择，经2 次回交后，其b c 2 的农艺性状与对照相比，已无明显差异。但基因枪法转b a r 基因t 2 代的农艺性状较对照略差。因此，分子育种与回交育种相结合，并在早 代进行选择，可较早获得具有理想性状的植株，为新品种的快速选育奠定基础。 关键词：小麦，b a r 基因，p p t 抗性，p a t 酶，农艺性状 h a b s t r a c t t h i sp a p e rm a i n l yf o c u so nt h er e s e a r c ho fb a rg e n e sr e s i s t a n c et op p ta n d h o wt r a n s g e n eo fb a ra f f e c t st h ea g r i c u l t u r a lc h a r a c t e r i s t i co ft r a n s g e n i cw h e a t m a i nr e s u l t sa sf o l l o w i n g ： i n t r o d u c i n gb a rg e n ei n t ow h e a t i nt h i sp a p e r , l i n e so f w h e a tc o n t a i n i n gb a rg e n ew e r eo b t a i n e df r o mb o m b a r d e d t r a n s f o r m a t i o na n dt h es e x u a lt r a n s f e ro ft h et r a n s g e n e i nc r o s s i n ge x p e r i m e n t s ，t h e t r a n s g e n i cl i n e sl 3 4a n dl 2 8w h i c hc o n t a i n sb a rg e n ew e r ec r o s s e dw i t hd i f f e r e n t n o n t r a n s g e n i cf e m a l e s - w a n m a i 4 8a n dy a n g m a i 8 7 1 5 8 ，a n dt h e np r o g e n yo f b c 2w e r e s c r e e n e db yp p tr e s i s t a n c ed e t e c ta n dp c ra n a l y s i s t h i si n d i c a t e st h a ti ti sp o s s i b l e t ot r a n s f o r mt r a n s g e n es u c c e s s f u l l yv i as e x u a lw a yi m on o n t r a n s g e n i cg e n o t y p e s ， t h e r e f o r e ，i tw i l ls h o r t e nt h ep e r i o do fw h e a tb r e e d i n gi ft h es e x u a lt r a n s f e ro ft h e t r a n s g e n em e t h o d ( s t t m ) i sa p p l i e dc o m b i n e dw i t hm o l e c u l a rb r e e d i n gm e t h o d s ， s u c ha sb o m b a r d e dt r a n s f o r m a t i o na n da g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n p p tr e s i s t a n e ed e t e c t t ou n d e r s t a n dp p tr e s i s t a n c eo fa a n s g e n i cl i n e s ，s o m ea n a l y s i sm e t h o d sa n d r e s i s t a n c ep a r a m e t e r sw e r ea d o p t e d i nt h i sr e s e a r c h ，s e e db i o a s s a ym e t h o dw a s a p p l i e db e c a u s eo fi t sa d v a n t a g e ，s u c h b ss h o r t e rp e r i o d ，l o w e rc o s tm a ds i m p l e r m a n i p u l a t i o n g sa c t i v i t yi nl e a fd e c r e a s e de v i d e n t l ya f t e rp p tt r e a t m e n t f u r t h e r m o r e ，w a t e r l o s tf r o mt h el e a fo fs a m p l e s g sa c t i v i t yo ft r a n s g e n i cl i n e sa l s or e d u c e dr e m a r k a b l y w h e nt h e yw e r et r e a t e dw i t hp p t b u ti tr e s t o r e di ns h o r tt i m e i ts u g g e s t st h a tt o x i c f f y o f p p tc o u l db ee l i m i n a t e db yp a tw h i c hi sp r o d u c to f b a rg e n e p a ta c t i v i t ya s s a yi n d i c a t e dt h a tt h el i n e st r a n s f o r m e db yb o m b a r dh a dh i g h e r 1 1 1 p a ta c t i v i t yt h a nt h o s el i n e so b t a i n e df r o ms t t m a m o n gt h ep r o g e n yb c j ，b c 2 o b t a i n e df r o ms t t m ，s o m el i n e sh a dn op a ta c t i v i t y t h er e a s o nm a yc o n t r i b u t et o t h es e p a r a t i o no f b a rg e n ei np l a n t s e f f e c t so fp p to nc h l o r o p h y l lc o n t e n ti nt h el e a v e so fw h e a t a f t e rw e a t m e mw i t hp p t ，c h l o r o p h y l lc o n t e n to ft h ec o n t r o ld e c r e a s e dd u et o r e d u c e dg sa c t i v i t yi nl e a f , b u tt r a n s g e n i cl i n e s h a ds m a l lc h a n g e s t h i sc o n f i r m s t h a tp p tc a ns t r o n g l yl i m i tt h es y n t h e s i so fc h l o r o p l a s t s e n s i t i v i t yt op p to fp l a n t m a y b ec a u s e db yf a i l e ds y n t h e s i sc h l o r o p h y l li np l a n ta f t e rt r e a t m e n tw i t hp p t r e s i s t a n c eh e r e d i t yo fb a rg e n e o b s e r v a t i o no fb a rg e n e sh e r e d i t yc h a r a c t e r i s t i cw a sp e r f o r m e d s e p a r a t i o no f b a rg e n ei nb c la n db c 2o b t a i n e df r o mt h es t t ma c c o r d e dt om e n d e l sl a w so f i n h e r i t a n c e ，i ts h o w st h a tt r a n s g e n eo f b a rc a nb ee a s i l yi n t r o d u c e di n t oo t h e rv a r i e t i e s o f w h e a tb ys t t m a g r i c u l t u r a lc h a r a c t e r i s t i co fw h e a t t r a n s f o r m e dw i t hb a rg e n e t h er e s u l t so f t h i se x p e r i m e n ts h o w e dt h a ta g r i c u l t u r a lc h a r a c t e r i s t i co f b c 2h a dn o r e m a n a b l ed i f f e r e n c ec o m p a r i s o nt ot h a to fc o n t r o l ，b u tt 1a g r i c u l t u r a lc h a r a c t e r i s t i c w a si n f e r i o rt oc o n t r o l s i ts u g g e s t st h a tt h ep e r i o do f b r e e d i n gc o u l db es h o r t e n e db y a p p l i c a t i o no f m o l e c u l a rb r e e d i n gm e t h o d sc o m b i n e dw i t hs t t m k e yw o r d s ：w h e a t ，b a rg e n e ，p p tr e s i s t a n c e ，p a t ，a g r i c u l t u r a lc h a r a c t e r i s t i c i v 独铋性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取彳寻的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注帮致谢的地方外，论文中不包含其他 人邑经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获褥安徽农业大学或其它教窿机构 的掌位或证书而使用过的材料。与我一目工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了裴确的说明并表示了谢意。 研究生签名 时间：狲，6 年胄g - 嚣 关于论文使用授权的说明 本人完金了解安徽农、韭大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保嘲送交论文的复印件和磁趱，允许论文被查阅和借阙，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位谂文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 傺密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生袋名 第一导师签名 一垒妈一 ：潍 7 、 i i 对闻：内g 年6 月歹曰 时间： 年月r 强 转b a r 基因小麦的抗性检测及其相关综合性状的研究 1 文献综述 以转基因植物研究、开发、应用为标志的新农业技术革命正轰轰烈烈地在全球展 丌，转基因大豆、玉米、棉花和油菜已进入大规模商业化应用阶段。就转基因性状而 占，面积最大的是抗除草剂转基因作物，其次是抗虫转基因作物。 通过化学方法来控制杂草已成为现代化农业不可缺少的一部分，除草剂的年产量 己居农药之首，据估计美国每年用在除草剂上的费用大约是5 0 亿美元。由于除草剂作 用机理是影响植物生理生化过程，如光合作用、氨基酸的合成等，所以除草剂在消灭 杂草的同时也对作物具有伤害作用，这就限制了除草剂的应用。因此，抗除草剂作物 的筛选和培育具有重要的意义。 11 抗除草剂基因工程的技术策略 以往解决除草剂对作物伤害问题主要是：( 1 ) 应用对作物伤害小的除草剂和施用 方法；( 2 ) 通过杂交育种，把和栽培作物亲缘关系近的野生植物对除草剂抗性的基因 引入到栽培品种。由于作物栽培种和近缘种通常不具备有抗除草剂的特性，这种育种 方法存在局限性。 随着生物技术的发展，目前，用基因工程的方法有目的地培育抗除草剂作物已成 为人们控制杂草的主要方法，即用基因工程的方法分离得到抗某一种除草剂的基因， 并人为地将它构建到合适的表达载体上，导入到作物中，培育出抗某种除草剂的转基 因作物。由于编码除草剂的基因为单拷贝基因，因而使以上方法成为可能并在实际中 得以应用。 近1 0 余年来，随着对除草荆作用机制的深入了解以及基因分离转化技术的迅速发 展，植物抗除草剂基因工程取得了较大的成功，欧美等发达国家已经开发出并商品化 了一些抗除草剂的作物品种。 目前，抗除草剂基因工程主要采取两种策略： 1 1 1 修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感或过量表达，作物吸收除草剂 后仍能进行正常代谢作用。 草甘膦( g 1 y p h o s a t e ) 是一种非选择性，广谱的高效、低毒有机膦除草剂。它特异 性地抑制植物和微生物芳香族氨基酸( 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸) 合成途径中5 一烯 醇丙酮酸莽草酸一3 一磷酸合酶( 5 - e n o l p y r u v y l s h i k i m a t e 一3 一p h o s p h a t es y n t h a s e ，e p s p s ) 的活性，导致芳香族氨基酸缺乏，莽草酸积累，最终导致细胞死亡。1 9 8 5 年c a r n a i 等“”首先从鼠伤寒沙门氏菌中筛选出了抗草甘膦的突变菌株，随后分离出突变基因 ( a r o a 基因) ，并将此突变的a r o a 基因转入烟草细胞获得第一个抗草甘膦转基因作物。 后来f i l l a t t i 等。”将此基因转入番茄，获得转基因番茄。1 9 8 6 年s h a h 等“1 培育并筛选 出具有对草甘膦抗性的矮牵牛细胞系m p 4 一g ，能超量产生e p s p s 合成酶，并分离出 e p s p s 合成酶基因，转入矮牵牛属的叶圆片获得转化愈伤组织，其e p s p s 合成酶的 活性提高了4 0 倍。目前己获得抗草甘膦的烟草“、矮牵牛“1 、番茄啊、大豆”、小 麦“1 等。 磺酰脲类除草剂和眯唑酮类除草剂，都是通过抑制支链氨基酸( 缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸) 合成中乙酰乳酸合酶( a c e t o l a c t a t es y n t h a s e ，a l s ) 来表现除草剂的作用。 1 9 8 8 年，h a u g h n 等。1 通过转基因手段已将拟南芥植株的a l s 的突变基因引入烟草， 这一转基因植物产生了对除草剂的抗性。对抗绿磺隆转基因作物研究也较多。“1 ， 我国学者李国圣等“”“3 3 将拟南芥的a l s 基因导入玉米，已进入田间试验。 1 1 2 引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其降解或解毒。 草丁膦( p h o s p h i n o t h r i c i n ，p p t ) 是非选择性的广谱除草剂b a s r a 和草铵膦 ( g l u f o s i n a t e a m m o n i u m ) 的活性成分。草丁膦除草作用机理是抑制植物的氨基酸生 物合成酶一谷氨酰胺合成酶( g s ) ，g s 可以解除硝酸盐还原、氨基酸降解及呼吸中释 放出的氨的毒性。虽然革丁膦抑制细菌、植物及哺乳动物的g s ，但它不能进入哺乳 动物的血液和脑组织，因此草丁膦对哺乳动物是安全的“。乙酰c o h 转移酶( a c e t y l c o at r a n s f e r a s e ) 催化草丁膦的自由氨基乙酰化，从而使除草剂草丁膦失活。1 9 8 7 年 t h o m p s o n 等“”从链霉菌( s t r e p t o m y c e s h y g r o s c o p i c i u s ) 分离出b a r 基因6 1 5 b p ，编 码草丁膦乙酰c o a 转移酶( p a t ) 。另外来自s t r e p t o m y c e sv i i i d o c h r o m o g e n e s 的p a t 誊 基因约1 3 k b ，编码p a t 的基因在其中的b g l l i s s t i i 片段上“。两种基因产物有相似 的催化能力，氨基酸序列8 6 同源。p a t 表达量占总可溶性蛋白的0 0 0 0 1 时足以 使植物产生抗草丁膦抗性。目前已经将b a r 基因转入多种作物如烟草“、番茄”、马 铃薯：、水稻 ”3 、小麦等。 溴苯腈( b r o m o x y d l ) 是除草剂b u c u - i l 的活性成分，抑制光系统i i 电子传递，它对 于生长素2 ，4 一d 不能控制的杂草特别有效。从土壤细菌臭鼻杆菌( k e b s i e h 盘0 z a c l 7 3 c ) 中分离出溴苯腈降解基因b x n ，编码腈水解酶，该酶把溴苯腈转变为无活性产物3 ，5 一 二溴一4 一羟基苯甲酸。”。另外，g o x 基因编码的草甘膦氧化还原酶，能把草甘膦降 解成无毒成分”“。师9 a 基因，编码2 ，4 一d 单氧化酶，能将2 ，4 - d 降解为非光合毒性 的2 ，4 一二氯苯酚”，也在选育抗性作物中获得成功表达。 一般认为，引入外源酶使除草剂失活的策略比靶位点突变的策略优越。因为靶标 酶或靶标蛋白质的过量产生会给作物造成代谢负担，对作物的生长和产量不利，而且 靶酶的改变，其异构酶的活性通常会降低，甚至对转基因作物有害。外源酶的引入负 效应要小，并且降解系统产生的对除草剂的抗性专一性强、效率高。 1 2 抗除草剂基因工程的应用 作物抗除草剂基因工程有以下两个方面的重要用途， ( 1 ) 利用抗除草剂基因作为遗传转化的筛选标记基因，将某一抗除草剂基因 与某一目的基因( 如抗病、抗虫基因，改善作物品质的基因等) 串连构建到同一载体上， 转化体会表达抗除草剂的特性，在转化初期只要在培养基中加入一定量的除草剂，就 会杀死非转化体； ( 2 ) 抗除草剂基因工程的另一个重要用途就是分离抗某一种或几种除草剂的 基因，将其导入目的作物中，培育出抗除草剂转基因作物，降低作物对某类除草剂的 敏感性，拓宽一些重要的常规除草剂的使用范围。 1 2 1 利用抗除草剂基因作为遗传转化的筛选标记基因的研究 在没有克隆抗除草剂基因以前，人们一直采用一些对抗生素具有抗性的基因作为 报告基因，如c a t 、g e n t 、b l e o 、b i a s 、a a t 、s t r l 、s p e 、h y g 、n p t 等。随着分子生物 3 学的不断发展，抗性基因不断被克隆，而且呈现多元化的趋势，科学家陆续克隆出一 些更有应用价值的基因，包括抗除草剂基因、抗虫基因、抗病基因、抗逆基因及改良 作物品质的基因等。以前广泛采用的报告基因因为对抗生素具有抗性，成本高昂，而 逐渐被成本低、相对更加安全的除草剂抗性基因而代替。 1 211 基本原理 其基本原理是将抗除草剂基因与目的基因紧密连锁，共同导入到作物中，转化体 若表现出对除草剂的抗性，说明抗除草剂基因整合到作物基因组中，也削接说明目的 基因也整合到作物基因组中。对转化体的筛选有两种方法：在分化和再生培养基中加 入一定浓度的除草剂，凡是能在这种培养基中再生的植株是抗除草剂的，待转化体生 长到一定程度，喷施除草剂，观察转化株的药害发生情况，能够正常生长的即为转化 植株。由于作物对除草剂的敏感性十分容易分辨，这种方法也较简单。因此，用抗除 草剂基因作为筛选标记基因简单、明了、方便，当转基因后代发生分离时，喷施除草 剂可以除掉非转基因植株或假杂种，从而使抗除草荆基因在植物基因工程中得到广泛 的应用。6 堪因是迄今为止用得最多的一个抗除草剂选择标记基因，已成功地用于 小麦“”。1 、水稻”“3 、玉米。“、大麦啪3 、油菜1 等作物的转化。 1 2 1 2 在作物杂种优势中的应用 利用杂种优势是提高作物产量与质量最为有效的途径之一。用基因工程方法创造 出的雄性不育系材料，若转化基因不是单基因纯合显性表现时，则其与保持系的杂交 后代发生分离现象，一些植株雄性不育，些则雄性可育，如何解决雄性不育材料后 代雄性不育的一致性是使之应用于生产的关键环节。如将抗除草剂基因与不育系基因 构建在一起，一并导入植株，由于转基因植株中不育基因与抗除草剂基因的紧密连锁， 二者同时存在，同时消失，因此，通过使用除草剂可以有选择地杀死雄性可育植株， 使雄性不育植株保留下来。李胜国儿3 ”、彭仁旺、曹光诚m m 7 1 等将抗除草剂基因b x n 或b a r 与雄性不育基因t a 2 9 b a r n a s e 联在一起，构建到植物表达载体上，导入作物， 实现了这些作物转基因雄性不育材料的保持。 4 1 2 1 3 在杂交水稻制种和快速检测杂种纯度上的应用 将抗除草剂基因转移到恢复系中，培育出带有纯合抗性基因的恢复系，这样在制 种过程中产生的假杂种，就可以通过使用除草剂除去。 我国学者继m a r i a n i 。”“” 手艮道之后，将抗除草剂基因与雄性不育基因紧密连锁， 创造了雄性不育转基因材料的保持方法。目前在这方面研究的进展也很快，已经把两 者的嵌合基因导入到多种作物中，分别获得了抗除草剂的转基因雄性不育烟草。“i 、油 菜。1 、芝麻和小麦”1 。其中较为突出的是黄大年。”研究小组的抗除草剂转基因水稻， 用基因枪法将合有抗除草剂基因6 a ，的质粒导入到两系法杂交水稻的恢复系或三系法 杂交中的父本上，使恢复系获得抗除草剂基因，具备抗除草剂特性，再用所得到的转 基因恢复系与三系不育系或二系不育系杂交，生产杂交水稻种子。 将配制的杂交稻种播种后，苗期喷施b a s t a ，4 天后可鉴定出假杂种和真杂种。根 据对b a s t a 的抗敏性比例可计算出制种纯度( ) ，同时将不含有6 甜基因的假杂种杀 死，而保证制种纯度。整个过程仅需4 天，大大缩短鉴定种子纯度的时间。 通过抗除草剂基因工程彻底解决了我国水稻生产中的两大难题：( 1 ) 解决了直播 稻田的革害问题；( 2 ) 杂交稻制种的纯度达到百分之百，并使纯度鉴定时间大大缩短。 从而加快了两系杂交稻的大面积推广应用，具有不可估计的社会效益。 1 22 将抗除草剂基因导入作物中培育抗除草剂作物 转基因植物自2 0 世纪8 0 年代开始研究，如何将转基因技术应用于小麦、水稻、 玉米等农作物一直是人们努力的目标之一。抗除草剂转基因作物的研究主要集中于美 国各大农药公司或与有关的遗传单位合作研究开发，因为通过对除草剂作物品种的研 究，一方面扩大公司除草剂的销售，另一方面又可出售种子。目前国外转基因抗除草 剂作物商品化的有：抗草甘膦的大豆、玉米、棉花、油菜、向日葵、甜菜，抗草丁膦 的大豆、玉米、棉花、油菜、甜菜、水稻，抗咪唑啉酮的玉米、油菜、甜菜、水稻， 抗磺酰脲类的大豆、棉花，抗拿扑净玉米，抗溴苯腈的棉花、烟草“3 3 。 我国在抗除草剂基因工程方面的研究起始于8 0 年代，由中科院遗传所与中国农业 科学院作物所合作，获得转基因抗阿特拉滓大豆，这是我国获得的最早的转基因抗除 草剂作物“。到目前为止，我国从事抗除草剂基因工程研究的单位有多家，涉及到的 5 抗除草剂基因有抗阿特拉滓基因( p s b a ) 、抗b a s t a 基因( b a r ) ( b a s t a 是h 。e c h s t 公司的 专利产品) 、抗溴苯腈基因( 6 训和抗2 ，4 一d 基因( t f d a ) 。目前已获得的抗除草剂转基 因作物有：抗b a s r a 水稻、小麦“”3 、抗2 ，4 一d 棉花”、抗阿特拉滓大豆”】羊抗溴苯腈 油菜”、小麦”。 1 3 转b a r 基因小麦的研究 在禾谷类作物中，由于小麦原生质体培养困难，因此小麦相对于其它作物( 如水 稻、玉米、甘蔗等) 表现出滞后性，直到1 9 9 2 年v a s i l 等“才首次报道了抗除草剂转 基因小麦植株的再生。近1 0 年来，国内外学者进行了大量的研究，建立了多种小麦 遗传转化系统。如原生质体法”“、电激法。、子房注射法5 “、花粉管通道法。“、激 光微束穿刺法”4 及碳化硅纤维法”3 3 等，但到目前为止基因枪法在小麦的转化上是应用 最广泛的。随着组织培养、基因表达系统、转化方法的进步，以及抗除草剂基因的发 现和分离，抗除草剂小麦转基因己取得了较大的发展。近年来，转b a r 基因小麦的研 究主要集中在转化方法和转化体系的研究上，基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道 法是将外源基因导入小麦的主要途径。目前，运用基因枪法”。”“、农杆菌介导法。、 电激法”“等都己获得了转6 甜基因小麦植株。然而，由于这些方法的转化效率较低， 且转基因种多为国外或省外品种，其直接利用存在较大局限性。此外，在转b a r 基因 小麦后代的农艺、品质等综合性状的研究方面报道很少。 对于那些已经获得目的基因的转基因材料而言，用回交法将其中的目标基因转育 到其他品种，不失为获得具有转基因目标性状的小麦新品种的一条简便快捷的途径。 若将回交转育法与基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法等直接转化法相结台，可 大大加快具有转b a r 基因目标性状的小麦新品种的选育进程，发挥转基因小麦在育种 上的利用价值。 1 3 1 草丁膦的作用机理 草丁膦( p h o s p h i n o t h r i c i n ，p p t ) ，化学名称为( r s ) 一2 - 氨基一4 一( 羟基甲基氧膦 基) 丁酸铵，其靶标酶是谷氨酰胺合成酶( g s ) 。谷氨酰胺合成酶在植物的氮代谢过 程中起作用，它是植物一个重要的解毒酶，可解除由硝酸盐还原、氨基酸降解及光呼 吸中释放出的铵的毒性。草丁膦抑制g s 的结果，可以导致植物体内氮代谢紊乱，铵 的过量积累，叶绿体解体，从而光合作用受抑制，最终导致植物死亡”( 图卜1 ) 。 萆丁膦( p p t ) 潮 谷氮酸+ a ，孺 抑 制 谷氨酰胺合成酶( c 瓣) 谷氮酰胺+ a 酮戊二酸+ n a d p h + h + 谷氨酝胺 a d p + p i 谷氮酸合戒酶 a - 谷氮酸+ n a d p + 图卜1 草丁膦( p h o s p h i n o t h r i c i n ，p p t ) 对生物氮代谢的作用机制 13 2b a r 基因的抗眭机理 从吸水链霉菌( s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s ) 克隆的b a r 基因被普遍用于转基因 作物的报告基因，该基因为6 1 5b p ，编码膦丝菌素乙酰转移酶( p a t ) ，p a t 由1 8 3 个氨基酸组成，可以催化乙酰c o a 分子转移到p p t 分子的游离氨基上，使p p t 乙酰 化，乙酰化的p p t 失去对g s 的抑制，从而起到了对p p t 解毒作用口”( 图1 - 2 ) ，因而 导入b a r 基因的植物表现出对除草剂p p t 的抗性。抗草丁膦的另一种基因是来自s v i r i d o c h r o m o g e n e s 的p a t 基因，p a t 基因为1 3 1 2b p ，编码的p a t 在p a t 基因的b g 1 1 一s s t i i 片段上。这2 种基因的产物有相似的催化能力，d n a 序列分析具有8 6 同源。 h 一事一n i - h c o o m 瞬他赘靛嗣 i h 鹪曲i 搬斑讯 与瞰 一f = 0 q 黾 眦 秘 鞋r n h a c 】a 渊 艺靛麟化麦赞醺 a e 篇y j - p i 协印越蚰i r i c i 矗 图1 - 2b a r 及p a t 基因产物膦化麦黄酮乙酰转移酶的催化反应 o 钟套妊 m 1 33b a r 基因检测方法的研究 根据国内外十几年的研究，目前认为转基因植物的证据应有以下几点：要有严 格的对照( 包括阳性和阴性对照) ；转化当代要提供外源基因整合和表达的分子生 物学证据，物理证据( s o u t h e r n 杂交、n o r t h e r n 杂交和w e s t e r n 杂交等) 与表型证据( 酶 活性分析和其他) ；提供外源基因控制的表型性状证据( 如抗虫、抗病等) 根据 浚植物的繁殖方式( 有性繁殖还是无性繁殖) 提供遗传证据。一般来说，检测外源基 因是否转化成功，首先是对报告基因的检测，检测报告基因可用简单的生化方法或免 疫学方法。 b a r 基因作为一种常用的报告基因，检测方法较多，如生测法、p c r 检测法、生 化测定法等。 13 31 生测法 生测法包括种子萌发生测法、叶片悬浮生测法、整株生测法等。其中种子萌发生 测法具有明显的优势旧3 。和其它生测方法比较，种子萌发生测法具有简便、成本低等 优点。如叶片悬浮生测法或整株生测需要等到种子萌发、出萤之后才能进行检测，周 期长。种子萌发生测法不需培养植株，周期短。但生测法均只能从基因表达水平来确 定是否具有抗铵草膦能力，而不能确定导入何种基因。 133 2p o r 检测法 p c r 是在体外快速特异地扩增目的基因d n a 片段的有效方法。能在几小时内使p g 水平的起始物达i u n g 乃至ug 水平，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后很 容易观察，不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的些顺序。这项技术可用于转化 后b a r 基因的鉴定和植物基因组的分析哺9 3 。应用p c r 法检测易出现假阳性，可用 s o u t h e r n 杂交进一步验证。 1 3 3 3s o u t h e r n 杂交 s o u t h e r n 杂交是将经酶切d n a 转移到杂交膜上与探针杂交的技术。利用s o u t h e r n 杂交，可以确定外源基因在植物中的组织结构、外源d n a 整合的位置及拷贝数、转基因 植株f 。世代外源基因的稳定性。s o u t h e r n 杂交可清除操作过程中的污染( 如d n a 分离及 植物d n a 分离过程中的交叉污染) ，以及转化愈伤胞间质粒残留所引起的假阳性信号， 准确度高。但s o u t h e r n 杂交程序复杂，成本高，且对实验技术条件要求较高。 需要指出的是，从理论上讲分子检测与抗p p t 筛选结果应统一，但实验中一些p c r 扩增及s o u t h e r n 杂交均呈阳性的植株在p p t 检测却不具有抗性：相反有些p p t 检测表现 好的植株s o u t h e r n 杂交却呈阴性”。这种不一致的结果是由于转入基因沉默，或者是 表达不强，而造成不抗除草剂昵? 还是小麦本身已含有与导入基因同源性很高的d n a 片段而使p c r 及s o u t h e r n 杂交呈阳性? 这是使基因转育工作者感到困惑的难题。 1 334 生化测定法 p p t 乙酰转移酶( p a t ) 是由6 日，基因编码的，可使上游游离的氨基乙酰化，乙酰化 的p p t 对g s 不再有控制作用，从而失去对植物的毒害。抗除草剂基因作为目的基因在植 物中得到了广泛的应用。由于6 a 蠖因具有明显的筛选作用，且检测方法灵敏，可用作 报告基因。j u nc a o “”在水稻上通过检测p a t 活性，对转6 a 堪因植株进行筛选，取得了 理想的效果。 134 转b a r 基因作物的抗性遗传特点 c o o l y 等。”对b a r 基因的遗传分析结果表明，大部分转b a r 基因水稻后代呈3 ：1 分离，表现为1 对显性主基因的遗传；少数转基因水稻后代呈1 ：1 或1 5 ：l 不规则分 离。朱冰等”调查了转b a r 基因植株的抗感表现，发现后代植株抗感分离比例不符合 孟德尔遗传分离规律：张祥喜等”在对水稻抗除草剂b a r 基因的研究中，大部分株系 的抗感分离比例符合3 ：1 的分离规律，但也有少量的l ：1 、2 几5 ：3 、5 ：l 的抗感分 离情况，在中、高世代中还获得了抗性稳定的抗除草剂的株系，其中有7 5 9 的抗性 稳定株系自交下一代抗性没有分离，其中有2 4 1 的株系发生了3 ：1 的抗感分离。 1 3 5b a r 基因对农艺性状的影响 黎桓庆【5 9 】等指出，b a r 基因嵌入哪条染色体以及哪条染色体的哪条区段是随机发 生的，由于插入位点不同，因而引起的效应不同，它的产量水平以及对抗性的表达水 平也不同。使用转b a r 基因品种同常规品种进行杂交培育品种时，由于b a r 基因的插 9 入染色体的位点不同，将会对杂交后代农艺性状、活性氧清除系统、光合指标、品赝 性状等产生重要影响。o a r d ”o3 等研究了转b a r 基因对水稻农艺性状的影响。结果表明 在不施用除草剂的情况下，转基因株系与原品种在抽穗期，植株高度稻谷产量上有显 著的差别。遗传背景对b a r 基因的表达有一定的影响，转基因的品种与原品种相比， 少数品系接近或达到原品种的产量水平，个别品系甚至比原品种增产，但大部分品系 与原品种相比都有不同程度的减产。另据富吴伟、李秋平等的研究表明“：在高世代 转基因植株与供体亲本比较，株高及单株谷重降低，千粒穗粒较为稳定。 1 4b a r 基因的安全性 由于转基因技术的应用和发展，人们已成功培育出抗草丁膦转基因作物，这使得 草丁膦用于作物田间除草成为可能。草丁膦具有活性高、杀草谱广、土壤活性低等特 点，所以草丁膦具有广阔的应用前景。 林毅口0 研究表明，在天然异交情况下，转b a r 基因小麦中的6 打基因向其近缘杂 草联合山羊草中的转化几率极低。但在人工杂交时转移率较高。 b a r 基因编码的p a t 与已知的1 2 0 多种人体过敏蛋白无同源性。此外，除草剂草 丁膦在土壤中易被土壤微生物快速分解。半衰期只有2 3 天。革丁膦的活性成分也不 能通过血脑屏障，并在肾中很快被清除，因此对哺乳动物无毒性”。草丁膦是在美国 环保局食品质量保护法实行后注册的第一种新产品，也就是说抗除草剂转基因作物对 人类食用安全。 1 0 2 引言 小麦是我国主要的粮食作物。近年来随杂交育种技术的应用，小麦的产量得到不 断的提高，品质也得到极大的改良。但目前仍有一些因素制约小麦生产，特别是罔间 杂草与小麦争取阳光、水分及养料是造成小麦产量下降的主要因素。现通过转基因技 术培育抗除草剂小麦，为这一问题的解决提供了一种有效的方法：在麦用施用除草剂 可以有效灭杀杂革，但对抗除草剂转基因小麦则没有影响或影响较小，从而达到增产 的目的。 目前研究最多的抗除草剂基因主要是抗草丁膦b a r 基因。草丁膦( 商业名有： l i b e r t y 、b a s r a 等) 是一种高效低毒的广谱除草剂，能经济有效地杀除所有杂草， 接触土壤后被微生物分解，无残留，对后无影响，操作简便安全。它的有效成分为膦 丝菌素( p h o s p h i n o t h r i c i n ，简称p p t ) ，是谷氨酰氨合成酶( g s ) 的一种强力抑制 剂。而g s 是植物体内唯一能降解氨毒的酶，它能除去硝酸盐还原、氨基酸降解和光 呼吸作用释放的氨。因此，抑制g s 酶活性会导致氨积累，结果引起植物中毒死亡1 。 目前从土壤吸水链霉菌( s t r e p t o r y c e s h y g r o s c o p y c u s ) 分离出b a r 基因，它具有膦 丝菌素乙酰转移酶( p h o s p h i n o t h r i c i na c e t y t r a n s f f e r a s e ，简称p a t ) 编码，p a t 使膦丝菌素的自由氨基乙酰化，致使p p t 丧失毒性“。现已通过生物技术将b a r 基因 导入多种作物如烟草1 、番茄m 、马铃薯。、水稻。引叫咄3 “3 1 、小麦”等。此外， b a r 基因在基因工程中还经常被作为筛选标记”3 。 对转b a r 基因小麦的研究，近年来，主要集中在转化方法和转化体系的研究上。 运用基因枪法m 帅“、农杆菌介导法蛳1 、电激法睇1 等都已获得了转b a r 基因小麦植株。 本实验室运用基因枪法将b a r 基因转入安徽主栽小麦品种扬麦8 7 1 5 8 和皖麦4 8 中， 于2 0 0 4 年成功获得4 株转基因苗。 目前，基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法是将外源基因导入小麦的主要途 径，但这些方法的转化效率较低，且转基因种多为国外或省外品种，其直接利用存在 较大局限性。此外，对转b a r 基因小麦后代的农艺、品质等综合性状的研究较少，转 b a r 基因小麦的抗性检测手段比较单一，也主要是运用p p t 涂叶法和p c r 检测法，关 于其抗性酶( p a t 酶) 的活性检测方面报道较少。 因此，本试验一方面通过对已获得的基因枪转6 a r 基因小麦及自交后代进行抗性 检测和农艺性状比较研究，希望获得性状优良的转基因植株；另一方面将转基因育种 与回交育种相结合，把抗除草剂基因b a r 导入到安徽小麦优良种中，在回交早代采取 各种手段进行抗性检测，在较高世代进行农艺性状的相关分析，以便获得农艺性状良 好、产量品质优越的抗性品种，为充分利用6 a ，基因在小麦育种上的价值，加快安徽 的转b a r 基因小麦的高产优质育种工作提供理论与实践依据。 3 材料与方法 小麦品种扬麦8 7 1 聃和皖麦4 8 ( 原代号为皖麦4 8 ，2 0 0 2 年通过安徽省审定，2 0 0 4 年通过国家审定) ，种子由安徽农业大学农学院提供 利用基因枪转化法将妇，基因转入扬麦8 7 1 5 8 和皖麦4 8 获得的转b a r 基因小麦 植株的t ，、r 代 含b a r 基因的小麦品种n o n 9 8 、n o n 9 4 回交后代：b e l ( n o n 9 4 x 皖麦4 8 2 ) ，b e l ( n o n 9 8 x 扬麦8 7 1 5 8 2 ) b c 2 ( n o n 9 4 x 皖麦4 8 3 ) ，b c 2 ( n o n 9 8 扬麦8 7 1 5 8 3 ) 除草剂p p t ( 商品名g l u f o s i n a t e - a m m o n i u m ) ，购自德国s i g m a 公司 小麦叶片p a t 酶提取缓冲液：2 5 m m o l lt r i s c l h ( p h7 5 ) ，im m o l le d t a ，0 0 8 m g m ll e u p e t i n e ，0 0 8m g m lp m s