（内科学专业论文）血管内皮生长因子在急性肺损伤中动态变化以及激素干预效果的研究.pdf

目录 i | ! l l l i ! l | i | l i l | f i i l i ! i f ! i l l l 0 y 19 0 0 5 3 1 中文摘要l 英文摘要4 研究论文血管内皮生长因子在急性肺损伤中动态变化以及激素干预效果 的研究 前言8刖舌8 材料与方法8 结果1 4 附图1 7 附表2 4 讨论i ，2 8 结论3 3 参考文献3 3 综述v e g f 及v e g f r 在急性肺损伤中作用的研究3 6 致谢4 4 个人简历4 5 中文摘要 血管内皮生长因子在急性肺损伤中动态变化以及激素 干预效果的研究 摘要 目的：探讨血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a l 舯叭hf a c t o r ， v e g f ) 在急性肺损伤中( a c u t el u n gi n i u 吼a l i ) 的动态变化和地塞米松的 干预效果，为临床合理应用糖皮质激素治疗不同诱因引起的a l i a i s 提供理论依据。 方法：将1 1 2 只清洁雄性s d 大鼠按随机数字表法分为1 4 组，尾静 脉注射生理盐水1 m l 对照组、尾静脉注射脂多糖( l p s8 m g l ( g ) 2 h 、4 h 、6 h 模型组、气管内滴入大肠杆菌标准菌株悬液( e c o l i3 m l l ( g ) 1 2 h 、2 4 h 、 3 6 h 模型组，n s + d e x 组及l p s2 h + d e x 组、4 h + d e x 组、6 h + d e x 组、 e c 0 1 i 1 2 h + d e x 组、2 4 h + d e x 组、3 6 h + d e x 干预组，每组8 只。干预组在 造模结束后立即腹腔内注射地塞米松2 m g l ( g 。造模结束后于各时间点 1 0 水合氯醛腹腔注射麻醉( 3 m l l ( g ) ，固定在手术台上。股动脉放血， 收集血液，离心( 3 0 0 0 印m ，4 ，1 0 m i n ) ，吸取上清，分装，8 0 保存， 用于进行v e g f 测定，开胸处死动物，暴露肺组织，止血钳夹闭右主支 气管后，将右肺完整切除，取右肺上叶肺组织用于湿干重比检测，取右肺 中叶肺组织用1 0 中性福尔马林溶液固定，留做病理及免疫组织化学检 查。分离出气管，经气管插管行左肺支气管肺泡灌洗，取支气管肺泡灌洗 液( b a l f ) ，离心( 1 2 0 0 印m ，4 ，1 0 m i n ) ，上清液分装，8 0 保存，用 于蛋白含量及v e g f 的测定。细胞沉淀悬浮于2 0 0 微升生理盐水中，进 行白细胞计数，同时观察地塞米松对上述指标的影响。 结果：( 1 ) 肺组织病理形态学：光镜下观察脂多糖2 小时后开始出现 肺血管充血，炎症细胞的浸润，肺间质水肿，4 小时出现典型a l i 的表现： 透明膜形成，6 小时与4 小时病理半定量评分比较无统计学差异；在气管内 滴入大肠杆菌1 2 小时后，发现大量炎症细胞浸润、气道上皮细胞的脱落， 肺泡水肿，2 4 小时出现肺泡上皮细胞空泡化，坏死，细胞增殖，大量纤维 蛋白的渗出，透明膜形成，部分肺实变。3 6 小时较2 4 小时病理半定量评分 无统计学差异。给予激素干预后，l p s 模型在2 小时、4 小时、6 小时可见 中文摘要 浸润的炎症细胞减少，蛋白渗出较少，病理半定量评分也相应减少；e c o l i 模型在2 4 小时、3 6 小时出现肺泡水肿减轻，炎症细胞浸润及透明膜减少， 病理半定量评分也相应减少。 ( 2 ) b a l f 中细胞总数、蛋白含量和肺组织w 他的变化：在l p s 模型 中b a l f 中细胞计数随着时间的延长，肺泡灌洗液中细胞计数明显增多， 给予激素后肺泡灌洗液中细胞计数明显下降；肺泡灌洗液中蛋白4 小时达 高峰，6 小时开始下降，激素干预组同比相应下降；湿干比，在l p s 组2 小 时较对照组明显升高，但随着时间的推移，未出现统计学意义的进一步增 加，激素干预组同比相应下降；在e c o l i 模型中肺泡灌洗液中细胞计数， 肺泡灌洗液中蛋白，湿干比，随着时间的延长，未出现统计学意义的增加， 1 2 小时、2 4 小时与3 6 小时比较无统计学意义，给予激素后2 4 小时、3 6 小时 均明显下降。 ( 3 ) 血清和b a l f 中v e g f 含量的变化：血清中v e g f 在l p s 模型中2 小时明显高于对照组，6 小时达高峰；在e c o l i 模型中1 2 小时明显高于对照 组，随着时间延长而增多，但无统计学意义，激素干预在两模型组血清 v e g f 未呈现显著差异，b a l f 中v e g f 在l p s 模型中2 小时明显高于对照 组，随着时间延长逐渐增加；在e c o l i 模型中1 2 小时明显高于对照组，随 着时间延长，逐渐增多；激素干预后两模型b a l f 中v e g f 均下降。 ( 4 ) v e g f 在肺组织表达的变化：v e g f 阳性细胞百分比在l p s 模型 中2 小时明显低于对照组，4 小时出现升高，并高于对照组，6 小时明显 高于4 小时，激素干预组各时间点均下降；在e c o l i 模型1 2 小时明显高 于对照组，随着时间延长表达增多，给予激素后下降；阳性目标积分光密 度值在l p s 模型中2 小时明显低于对照组，随着时间延长增多，但6 小 时才达对照水平，给予激素后明显下降，在e c o l i 模型1 2 小时明显高于 对照组，随着时间延长表达增多，给予激素后下降。 ( 5 ) 直线相关分析显示：e c o l i 组v e g f 阳性率与肺泡灌洗液中细胞 计数、阳性目标积分光密度值呈显著正相关与血清中v e g f 呈负相关；l p s 组b a l f 中v e g f 与肺泡灌洗液中细胞计数、病理评分、b a l f 中v e g f 阳性率、阳性目标积分光密度值呈显著正相关与血清中v e g f 呈负相关。 结论： l 成功的复制了气道内注入大肠杆菌混悬液导致的内源性急性肺损 中文摘要 伤模型和尾静脉注射l p s 导致的外源性急性肺损伤模型。 2l p s 诱导急性肺损伤早期肺组织v e g f 表达下降，随着时间的延 长表达升高，血清和肺泡灌洗液中v e g f 表达升高：e c o l i 诱导急性肺损伤 肺组织和肺泡灌洗液中v e g f 随着时间延长表达升高。 3 地塞米松能够降低肺组织和肺泡灌洗液中v e g f 的表达，在早期减 轻肺水肿，在晚期抑制上皮细胞的产生。 关键词：急性肺损伤；急性呼吸窘迫综合症；大肠杆菌；脂多糖；血 管内皮生长因子；糖皮质激素 英文摘要 - _ - _ - _ 一_ 一 t h e s t l l d y0 fd y n a m i cc h a n g e so fv e g fi na c u t e l u n gi n ju r ya n dt h ee f f e c to fg l u c o c o r t i c o i do ni t a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oe x p l o 豫t h ed y l l 锄i cc h a n g e so f v e g fi na c u t el u n gi n j u 巧 a n ds i g n 湎c a n c eo fd e x a m e t h a s o n e t r e a t n ：1 e n t ，f o rc l i n i c a lt r e a t m e n to f g l u c o c o n i c o i dp r 0 v i d eat h e o r e t i c a lb a s i si n d u c e db yd i 腩r e n ti n c e n t i v e sa u a r d s m e t h o d s ：o n eh u n d r e da n d 俩e l v em a l ec l e a n d e g r e es p r a g u e d a w l e y r a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t 0f o u r t e e ng r o u p s b yi n t r a v e n o u si n je c t i o no f p h y s i o l o g i c a ls a l i n e1i n l 硒c o n 仃0 1g r o u p ；n ee ) 【p 甜m e n tb yi n t r a v e n o u s i 巧e c t i o no fl i p o p o l y s a c c h a r i d e ( l p s8 m g l 【g ) f o rt 、oh o u r s ，f o u rh o u r s ，s i x h o u r sa n dt r a c h e a li n s t i l l a t i o no fe s c h e r i c h i ac o l i ( e c o l i3m l l ( g ) f o rt w e l v e h o u r s ，t w e n t y f o u rh o u r s ，m i r t y - s i xh o u r s 弱a l im o d e l sw e r ed u p l i c a t e d ： n s + d e xg r o u p ，l p s + d e xf o rt 、o h o u r s ，f o u rh o u r s ，s i xh o u r sg r o u p ， e c o l i + d e x 内rt v v 。e l v eh o u r s ，t w e n t y - f o u r h o u r s ，t h i r t y s i xh o u r sg r o u p 舔 i n t e r v e n t i o ng r o u p s w i t he i g h ta n i m a l sf o re a c hg r o u p ：t h eg l u c o c o r t i c o i d i n t e r v e n t l o ng r o u p sw e r ei n t r a p e r i t o n e a li 巧e c t i o nd e x ( 2 m g l ( g ) i m m e d i a t e l y a 最e rr 印l i c a t i n gm o d e l s a r e rb e i n gd u p l i c a t e da td i 任：r e n tt i m ep o i n t s ，m e a n i m a l sw e r e锄a e s t h e t i z e d b yi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n 1o c h l o r a j h y d r a t e ( 3 m l k g ) a j l dt h e ns e tt h e mo nt h eo p e r a t i n gt a b l e d 删na n dc o l l e c t e d b l o o d b yp u n c t u r i n gt h ef e m o r a la n e r 弘c e n t r i 如g e d ( 3 0 0 0 印m ，4 ，1o m i n ) a 1 1 d d r a ws e m m t h e ns t o r e dt h e ms 印a r a t e l yu n c l e r 8 0 f o rm t u r cc 叭o k i n e v e g fd e t e m l i n a t i o n t h ea 1 1 i m a lw e r es a c r i f i c e db yt h o r a c o t o m ye x p o s e d l u n gt i s s u e ，a r e rt h ec l a m po f f t h ed g h tm a i nb r o n c h u s ，t h ec 0 m p l e t er e m o v m o ft h er i g h tl u n g ，r i g h tu p p e rl o b el u n gt i s s u et a l 【e i lf o rw 嘶w e i g h tr a t i o t e s t i n g ，t a k e nr i g h tm i d d l el o b el u n gt i s s u ei n1o n e u t r a lf o m l a l i nf i x e df o r 如t u r ec h e m i c a le x 锄i n a t i o no f p a t h o l o g ya i l di l i l i n u n o h i s t o c h e m i s t m i s o l a t e dt r a c h e a ，a 仃a c h e ac a t h e t e rw a su s e df o rb r o n c h o a l v e l o a rl a v a g ei nl e r l u n g b a l fw e r ec o h e c t e da n d c e n t 矗血g e d ( 1 2 0 0 印m ， 4 ，l o m i n ) h a dt y p i c a lp e r f o n n a n c eo fa c u t el u n gi n j u r y h y a l i n em e m b 啪ef o m l a t i o n ， s i xh o u r sa n df o u rh o u r s p a t h o l o g i c a ls e m i q u a n t i t a t i v e s c o r cw a sn o s i g n i f i c a n td i 任e r e n c e ；i n s t i l l a t i o ne c o l ii n t ot h et r a c h e af o rt w e l v eh o u r s i t f o u n da1 a 玛en u m b e ro fi n f l a m m a t o 巧c e l l si n f i l t r a t i o n ，s h e d d i n go fa i r w a y 印i t h e l i a lc e l l s ，a l v e o l a re d e m a ；a tt w e n t y - f o u rh o u r s ，i tf o u n dt h a ta l v e o l a r 印i t h e l i a lc e l l s 印p e a r e dv a c u 0 1 i z a t i o n ，n e c i o s i s ，c e l lp i o l i f e r a t i o n ，al a r g e n u m b e ro f6 b r i ne x u d a t i o n ，h y a l i n em e m b r a l l ef o m a t i o n ，p a no ft h el u n g t i s s u e c o n s o l i d a t i o n t 协e n t 弘f o u rh o u r sa n dt h i r t y s i xh o u r sp a t h o l o g i c a l s e m i 。q u a n t i t a t i v e s c o r ew e r en o s i g i l i f i c a n td i f f e r e n c e ；a r e rg i v e l l d e x a m e t h a s o n e ，l p sg r o u pi nt w oh o u r s ，f o u rh o u r s ，s i xh o u r sa p p e a r e dt l l e i n f i l t r a t i o no f i n f l 锄m a t o r yc e l l s ， p r d t e i n l e a k a g e ，p a t h o l o g i c m s e m i 。q u 锄i t a t i v e s c o r ed e c r e a s e dm a nc o r r e s p o n d i n g n o n s t e r o i d 乎o u p ； e c o l ig r o u pa p p e a r e di nt w e n t y - f o u rh o u r s ，m i r 吵s i xh o u r sa l v e o l a re d e m a ， i n n a m m a t o 巧 c e n i n f i l t r a t i o n h y 甜i n e m e m b r a n e 龇l d p a t l l o l o 西c a l s e m i 。q u a n t i t a t i v es c o r ed e c r e a s e d 岫c o n s p o n d i n gn o n - s t e r o i dg r o u p ( 2 ) b a l f t o t a lc e l l s ，p r o t e i nl e v e l sa n d t h el u n gw 仍c h a n g e s ：i nt h el p s m o d e lw i t ht i m e ，t h ec e l lc o u n ti nb a l fw 弱s i 鲥f i c a n t l yi n c r e a s e d a r e r g l u c o c o r t i c o i dg i v e n ，t h ec e nc o u n ti nb a l fw a s s i g n i f i c 踟1 t l yd e c r e a s e d a t f o u rh o u r sm ep r o t e i ni nb a l fp e a k e d ，a ts i xh o u r sb e g a nt 0 d e c r e a s e ，a c o n s p o n d i n gd e c l i n ei ng l u c o c o n i c o i di n t e r y e n t i o ng r o u p ；t h el u n gw i ) i n t h el p st w oh o u r sg r o u pw 懿s i g n i f i c a n t l yh i 曲e rt h a nt l l ec 0 n t r o lg r o u p ，b u t a st i m eg o e so n ，i td i dn o t 印p e a rs t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n tm r t h e ri n c r e a s e c o r r e s p o n d i n gd e c l i n ei ng l u c o c o r t i c o i di n t e r v e n t i o ng r o u p ；i i l 也ee c o l i m o d e lc e uc o u n t ，p r o t e i ni nb a l f ，也el u n gw di n c r e a s e dw i t ht i m e ，b u ti t 5 英文摘要 d i dn o t 印p e a u rs t i a t i s t i c a l l ys i g n i f i c 锄m n h e ri n c r e a s e a r e r g i v e n g l u c o c o n i c o i di n t e r v e n t i o nt w e n t y - f o u rh o u r sa n dt h i r t y s i xh o u r s ，t h et l l r e e i n d i c a t o r sw e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dt h a l lc o 骶s p o n d i n gn o n s t e r o i dg r o u p ( 3 ) v e g fl e v e l si ns e m ma n db a l f ：i nt h el p sm o d e l ，t h es e m m v e g fw 硒s i g i l m c a n t l yh i 曲e rt h a nc o n 仃o lg r o u pa tt 、oh o u r s ，p e a k e da ts i x h o u r s ；i nt h ee c o l im o d e l t h es e m mv e g fw a ss i 印i f i c a n t l yh i 曲e rt h a nm e c o n t r o lg r o u pa tt w e l v eh o u r s a st i m ep r o l o n g i n gn os t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t i n c r e a s em r t h e m o r e a r e r g i v e ng l u c o c o r t i c o i di n t e r v e n t i o nt h es e m mv e g f i n 铆om o d e l sh a dn os i 弘i f i c a n td i 行e r e n c et h a nn o n s t e r o i d ；i nt h el p s m o d e l ，t h eb a l fv e g fw 弱s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a i lc o n t r o lg r o u pa tt w o h o u r s ，w i t ht i m ei n c r e a s e d ； i nt 1 1 ee c o l im o d e lt h eb a l fv e g fw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a i lc o n t r o lg r o u pa tt w e l v eh o u r s ，a st i m ei n c r e a s e d ， a r e rg i v e n9 1 u c o c o n i c o i di n t e r y e n t i o nt l l eb a l f v e g fi nt 、v om o d e l sw e 坞 d e c l e a s e dt h a nc o l l r i o s p o n d i n gn o n s t e i o i dg r o u p ( 4 ) t h ev e g fe x p r e s s i o nc h a i l g e si nl u n gt i s s u e ：t 1 1 ep o s i t i v er a t eo f v e g fa t 似oh o u r si nt h el p sm o d e lw 雒s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a j lt h ec o n t r o l g r o u p ，i n c r e a s e da tf o u rh o u r sa n di tw a sh i g h e rt h a nm ec o n t r o lg r o u p ，a ts i x h o u r si tw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rm a na tf o u r h o u r s ；t h eg l u c o c o r t i c o i d i n t e r v e n t i o n g r o u pw e r ed e c r e a s e da t m l 石i n ep o i n t sm a nc o n e s p o n d i n g n o n - s t e r o i dg r o u p ；i nt h ee c o l im o d e lt h ep o s i t i v er a t eo fv e g fw 硒 s i g n i f i c a i l t l yh i g h e rt h 锄c o n t r o lg r o u pa t 撕e l v eh o u r s ，a st i m ei n c r e 於e d a r e rg l u c o c o r t i c o i di n t e e i l t i o ni t 、栅 d e c r e a s e dt h 觚 c o 鹏s p o n d i n g n o n s t e r o i dg r o u p ；i n t e g r a l0 p t i c a ld e n s 埘o f p o s i t i v et a r g e tv a l u ei nt h el p s 似oh o u r sm o d e lw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h 孤t h ec o n t r o lg r o u p ，w i t ht i m e i n c r e a s e d b u ta ts i xh o u r sr e a c h e dt ot h ec o n t r o l l e v e l ，a r e rg i v e n g l u c o c o n i c o i dt h e yw e r es i g i l i f i c a n t l yd e c r e a s e d ；i i lt 1 1 ee c o l im o d e lt h e i n t e g r a lo p t i c a ld e n s i t yo fp o s i t i v et a r g e tv a l u ew a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h 趾 c o n t r o l g r o u p a t铆e l v e h o u r s ， 雒t i m ei n c r e 弱e d ，a r e rg l u c o c o r t i c o i d i n t e e n t i o nt h e yw e r ed e c r e a s e dt h a n c o r r e s p o n d i n gn o n s t e r o i dg r o u p ( 5 ) l i n e a rc o n l a t i o n 锄a l y s i ss h o w e d ：髓er e l a t i o n s h i pb e 觚e e nt h e p o s i t i v er a t eo fv e g f ，c e l lc o u n ti nb a l fa n dm ei m e g r a lo p t i c a ld e n s i t yi n 6 英文摘要 e c o l i g r o u p ，t h el i n e a rc o 盯e l a t i o na n a l y s i ss h o w e das i g n i f i c a n tp o s i t i v e c o r r e l a t i o n 锄ds e m mv e ( 迈w 硒n e g a t i v e l yc o r r e l a t e d ；t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nb a l fv e g f c e uc o u n ti nb a l f p a t h o l o g i c a ls c o r e ，t h ep o s i t i v e r a t eo fv e g fa n d p o s i t i v et a 玛e ti n t e g r a t e do p t i c a ld e n s i t yi nl p sg r o u p ，t h e l i n e a rc o r r e l a t i o na n a l y s i ss h o w e das i g m f i c a n tp o s i t i v ec o n e l a t i o na n ds e m m v e g fw a sn e g a t i v e l yc o n e l a t e d c o n c l u s i t i o n s ： 1 s u s p e n s i o ne s c h e r i c h i ac o l ii n t ot h et m c h e as u c c e s s 如l l yd u p l i c a t e d a 砌) s pr e s u l t i n g 疔o mp n e u m o n i aa n di n t r a v e n o u si n j e c t i o no fe x o g e n o u s l p ss u c c e s s 允1 1 y ( 1 u p l i c a t e da r d s e x p 2l p si n d u c e da c u t e1 u n gi 1 1 j u i yd e c l e a s e de x p r e s s i o no fv e g f i n1 u n g t i s s u e ，i n c r e a s e dw i t ht i m e ，t h es e m ma r l db a l fv e g fe x p r e s s i o nw e r e i n c r e a s e d ；e c o l ii n d u c e da c u t el u n g 嫡u 叮i nt h el u n gt i s s u ea n db a l f 1r p ，、t ve u re x p r e s s l o nw a s1 n c r e 邪e dw l t nt l m e 3t h eo v e r e x p r e s s i o no fv e g fi na c u t e1 u n gi n j u p 矾i c i p a t e di nt h e d e v e l o p m e n to fa c u t el u n gi n j u r y g l u c o c o n i c o i db yr e d u c i n gt h ee x p r e s s i o n o fv e g f r e d u c e dp u l m o n a 秽e d e m ai nt h ee a 订y ；i nt h el a t ei n h i b i t i o no f 印i t h e l i a lc e l l si nc u l m r e 1 ( e yw o r d s ：a c u t el u n g 竭u 秽；a c u t er e s p i r a t o 巧d i s t r e s ss y l l d r o m e ； e s c h 丽c h i ac o l i ；l i p o p o l y s a c c h 撕d e ；p n e u m o n i a ；v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t h f a c t o r ；g l u c o c o r t i c o i d ；p u l m o n a r ye d e m a 7 研究论文 血管内皮生长因子在肺内外源性肺损伤中动态变化 以及激素干预效果的研究 - 屿- l 莉置 急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u 珂，a l i ) 急性呼吸窘迫综合征( a c u t e r e s p i r a t o 眄d i s t r e s ss y l l d r o m e ，a i m s ) 是指由心源性以外的各种肺内、外 致病因素所引起的原发性和继发性肺损伤，以肺泡上皮损伤和毛细血管通 透性增加所致弥漫性肺泡肺水肿及透明膜的形成为主要病理特征【1 1 ，以呼 吸窘迫和严重低氧血症为主要临床表现的呼吸衰竭，是目前危重症医学领 域的治疗难点之一，也是重症医学的重要课题。目前缺乏针对发病机理有 效的治疗措施，死亡率仍高达3 5 6 5 。肺毛细血管内皮细胞损伤是其重 要环节之一，目前发现血管内皮损伤过程中的肺水蓄积及清除障碍与发病 密切相关。血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o 叭hf a c t o r ，v e g f ) 是作用于内皮下血管的重要的血管调节因子，它通过与内皮上的特异受体 结合，可发挥增加微血管通透性、促进内皮细胞增殖、分化、诱导血管生 成等多种功能【2 】。近年研究显示v e g f 在急性肺损伤的不同阶段、不同原 因所起的作用不同。因此本研究通过建立两种肺内外源性急性肺损伤模型 观察v e g f 的动态变化，及糖皮质激素干预效果，为今后针对不同患者制 定个性化的治疗方案提供理论依据，进一步改善g c s 临床应用的效果。 材料与方法 l 材料 1 1 实验动物 健康雄性s p r a g u ed a w l e y ( s d ) 大鼠1 1 2 只，体重2 5 0 一3 0 0 9 ，购自河北 医科大学动物中心，i i 级。供标准日粮和无菌饮用水，自由饮食，大鼠饲 料购自河北医科大学动物中心，室温2 5 士3 ，日照时间1 2 小时，观察3 天后用于试验。 1 2 主要试剂及配置方法 1 2 1 主要试剂 研究论文 5 0 的戊二醛 水合氯醛 地塞米松磷酸钠注射液 大肠杆菌脂多糖 大肠杆菌混悬液( 5 o 1 0 9 个危1 l ) 考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒 v e g f 兔抗i g g 多克隆抗体 d a b 显色剂 v e g f e l i s a 试剂盒 1 2 2 主要试剂配制 1 2 2 1 l o 水合氯醛 天津市永大化学试剂开发中心 天津市永大化学试剂开发中心 郑州卓峰制药厂 s i 肿a 公司 河北医科大学微生物室 南京建成生物公司 武汉博士德生物工程有限公司 武汉博士德生物工程有限公司 武汉博士德生物工程有限公司 取1 0 9 水合氯醛，倒入洁净的容量瓶内，加生理盐水1 0 0 m l 。 1 2 2 2 白细胞稀释液 取2 m l 冰醋酸，加入9 8 m l 蒸馏水，配成2 的冰醋酸溶液。 1 2 2 3l o 中性福尔马林溶液 取甲醛( 3 7 ) l o o m l ，无水磷酸氢二钠6 5 9 ，磷酸二氢钠4 o g ，加入 蒸馏水9 0 0 m l 。 1 2 2 4d a b 显色液 1 0 m lo 1 i n o l l p b s ( p h 7 4 ) 加入5 m gd a b ( 二氨基联苯胺) ，溶解后过 滤，再加入o 1 i n l1 h 2 0 2 ，即用即配。 1 2 2 5o 1 d e p c 取2 0 0 p l d e p c ，加入2 0 0 i i l l 蒸馏水，充分混匀，3 7 过夜后再高压 处理。 1 3 仪器 f a l 0 0 4 型电子天平上海精科天平 光学显微镜日本o l y i 】叩u s 公司 g z x 9 2 4 6 m b e 电热恒温上海博迅实业有限公司 鼓风干燥箱 电热恒温水浴箱北京市方照明电器工程公司 超低温保存箱青岛海尔 4 冰箱青岛海尔 研究论文 a n k et d l 5 0 0 0 b 离心机上海安亭科学仪器厂 p b 2 l 型p h 计德国塞多利斯 t u 1 8 0 0 型紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司 n i k o n 尼康光镜显微照相机日本株式会社尼康 l e i c ai w 2 1 2 5 石蜡切片机莱卡上海分公司 m o t i c 6 o 数码医学图象分析系统厦门麦克奥迪仪器仪 移液器、染色缸、湿盒等北京中山有限公司 酶联免疫检测仪( m 硒)芬兰雷勃 恒温振荡器( s h a b )常州国华 半自动生化仪( h u m a l y z e r 2 0 0 0 )德国豪迈 全自动洗板机( 8 1 2 )美国 2 方法 2 1 分组 将1 1 2 只清洁雄性s d 大鼠按随机数字表法分为1 4 组，尾静脉注射 生理盐水对照组、尾静脉注射l p s 2 h 、4 h 、6 h 模型组、气管内滴入大肠 杆菌1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 模型组，及对应各时间点地塞米松干预组，每组8 只。 2 2 动物模型复制 2 2 1 正常对照组模型的制备 动物称重1 0 水合氯醛( 3m l k g ) 腹腔注射麻醉，仰卧位固定动物， 尾静脉注射生理盐水1m l 。我们预实验证实尾静脉注射n s 与气管内滴入 n s 病理变化无明显差异 2 2 2l p s 模型的制备 动物称重后1 0 水合氯醛( 3 m 狄g ) 腹腔注射麻醉，仰卧位固定动物， 尾静脉注射l p s ( 8 m g 瓜g ) 。 2 2 3e c 0 1 i 模型的制备 动物称重后l o 水合氯醛( 3 m l k g ) 腹腔注射麻醉，仰卧位固定动物， 无菌条件下，行颈前正中切口，长约l c m ，暴露气管后，将大肠杆菌混悬 液( 3 m l 埏) 平均分为4 次，2 0m i n 内经过气管插管分别采取仰卧位、 左侧卧位、右侧卧位、俯卧位，注入气管【2 】。每次注药完毕后，保持其体位 约两分钟，随后缝合创口。 1_-_-_-_j_-_1llllii_-_j_1llj_lll，j1llllli 研究论文 2 2 4 药物干预 激素干预组于模型复制后立即腹腔内注射地塞米松( 2 m g 瓜g ) 2 3 取材 造模结束后于各时间点，将动物以1 0 水合氯醛( 3 m l i ( g ) 腹腔注射 麻醉，固定在手术台上。股动脉穿刺采血，收集血液，离心( 3 0 0 0 印m ，4 ， 1 0 m i n ) ，吸取上清，分装，8 0 保存，用于细胞因子测定。开胸处死动 物，心脏穿刺放血，游离暴露肺组织，止血钳夹闭右主支气管后，将右肺 完整切除，取右肺上叶肺组织用于湿干重比检测，取右肺中叶肺组织用 1 0 中性福尔马林溶液固定，留做病理及免疫组织化学检查。分离出气管， 做倒“t 字型切口，行气管插管并固定，用4 无菌生理盐水5 m l 进行左 肺灌洗，2 0 3 0 秒后缓慢抽出，反复抽吸3 次，回收全部灌洗液，经两层 纱布过滤，离心( 1 2 0 0 印m ，4 ，1 0 m i n ) ，细胞沉淀用于细胞计数检测， 上清液分装，8 0 保存，用于蛋白含量及细胞因子测定。 2 4 指标测定 2 4 1 肺湿干重比( w d ) 的测定 将右肺上叶肺组织表面水分用滤纸吸干测湿重后，置于烤箱( 9 0 ， 2 4 h ) ，烤至恒重，取出称干重，计算w 仍。 2 4 2 支气管肺泡灌洗液( b r o n c h o a l v e l o a rl a v a g ef l u i d ，b a l f ) 中细胞计数 将支气管肺泡灌洗液离心后所得的细胞沉淀混匀于2 0 0 u l 生理盐水 中，取2 0 山悬液放入e p 管中，再向e p 管中加入3 8 0 山2 冰醋酸，吹打 混匀，吸出2 0 山用计数板在光学显微镜下分别计数五个大方格的细胞个 数，然后计算细胞总数。 2 4 3 支气管肺泡