（内科学专业论文）cebpα基因突变对急性髓系白血病aml临床预后影响.pdf

目录嬲鼎必 fy 19 0 1 。芝斟若。 中文摘要1 英文摘要3 研究论文c e b pq 基因突变对急性髓系白血病( a m l ) 临床预后影响 前言6刖舌 。 材料与方法6 结果 1 2 附图16 附表 ”2 1 讨论31 结论3 3 参考文献3 4 综述急性髓系白血病中c e b pq 突变检测与作用机制研究进展3 7 致谢51 个人简历5 2 中文摘要 c e b p a 基因突变对 急性髓系白血病( a m l ) 临床预后影响 摘要 研究背景：a m l 的发病基础一般认为是由多因素诱导基因突变导致 细胞增殖、分化和细胞凋亡途径发生改变的结果。作为c e b p ( c c a a t e n h a n c e rb i n d i n gp r o t e i n ，c e b p ) 家族成员之一的髓系转录因子c c a a t 增强子结合蛋白a ( c e b p a ) 是髓系祖细胞增殖与分化过程中一个重要 的转录因子，c e b p a 在a m l 造血干细胞增殖与分化进程中扮演着极为 重要的角色，最新公布的w h o 白血病分类标准强调在初诊评估时就应对 a m l 患者骨髓样本进行c e b p a 突变以及与之预后相关的f l t 3 和n p m l 基因突变分析。c e b p a 已成为a m l 重要的预后参考指标之一，可能成 为新的治疗靶点，其功能的破坏、丧失常与a m l 的发生有关，恢复c e b p o l 表达可以作为诱导分化治疗手段。研究表明，a m l 患者c e b p a 基因突 变主要为n 端移码突变和c 端b z i p 区域结构性突变，这种突变的存在对 提高患者的e f s 、o s 和r d 具有重要意义。有基因突变与低复发率和高 存活率密切相关，c e b p 0 【突变检测的准确性对于a m l 患者治疗与预后 的风险分级具有重要意义。 。 目的：检测a m l 患者中c e b p a 基因突变情况；比较p c r 直接测序 法和多重p c r 片段法在c e b p a 基因突变检测中的性能；分析c e b p a 突变与患者临床特征之间的关系；观察突变患者和非突变患者接收诱导缓 解治疗后的临床疗效。 方法：首先采用聚合酶链式反应( p c r ) 直接测序法分别检测6 0 例 a m l 患者骨髓样本和1 0 例体检健康志愿者外周血样本。而后用多重p c r 片段分析法再次检测c e b p a 突变a m l 患者的骨髓样本。采用独立样本 t 检验分析c e b p a 突变与患者临床特征之间的关系；采用c h i s q u a r e 检验 分析患者c r 率；用k a p l a n - m e i e r 进行患者生存分析，分析患者的r d 和 o s ；采用l o g r a n k 检验分析突变患者和非突变患者的r d 和o s 之间差异。 结果：p c r 直接测序分析结果表明，6 0 例a m l 患者中的c e b p a 突变患者8 例( 发生率1 3 3 ) ，包括双等位基因突变5 例( 发生率6 2 5 ) ， 中文摘要 单基因突变患者3 例( 发生率3 7 5 ) ，其中仅有1 例出现n - 端移码突 变；多重p c r 片段分析法分析检测8 例c e b p a 突变a m l 患者骨髓 样本，与p c r 直接测序法相比，1 例患者未检测到n 端移码突变，准确 度为9 3 ；有无c e b p a 突变与a m l 患者的性别、年龄、白细胞计 数、骨髓原始细胞数和血小板计数无关，但突变患者的血红蛋白数要高于 非突变患者；本研究尚未发现c d 7 和c e b p a w t 之间的负相关关系， a m l 患者中c e b p a c d 7 + 和c e b p a + c d 7 。并不是交替出现，无统计学意 义( 尸= 0 9 2 6 ) ，6 0 例患者中除了c 厄b p 0 c 。c d 7 + 和c e b p a + c d 7 。类型的患 者还有其它类型的患者，但c e b p a 突变患者中尚未检测到c d 7 + 表达； c e b p e t 基因突变患者的c r 、o s 和r d 较非突变患者要高，但其差异 无统计学意义( 尸值分别为0 5 6 9 、o 1 3 0 和o 51 0 ) ；c e b p a + c d 7 。患 者的c r 率( 8 7 5 ) 和r d ( 9 2 5 ，9 5 c i ：7 7 8 1 0 7 2 ) 要明显高于 c e b p a c d 7 + 的c r 率( 2 5 ) 和r d ( 5 1 8 8 ，9 5 c i ：3 3 2 5 。7 0 5 0 ) ， 两组差异有统计学意义( p 值分别为0 0 1 2 和0 0 0 8 ) 。 结论：本研究表明a m l 患者c e b p a 基因突变发生率约1 3 3 ， 其中双等位基因发生率为6 2 5 ；尽管p c r 直接测序是一种准确度高 的c e b p a 突变检测方法，但综合运用p c r 直接测序法和多重p c r 片段 分析法是未来临床应用的一个趋势；c e b p a 突变的a m l 患者与非突 变患者在性别、年龄、白细胞计数、骨髓原始细胞计数和血小板计数等临 床指标的差异不大；本研究中c e b p a 突变患者和非突变患者的c r 率、o s 和r d 上差异不大，需要进一步观察；c e b p a + c d 7 。可作为 a m l 临床预后良好的指标。 关键词：a m l ；c e b p a ；基因突变检测；预后；c d 7 2 i si na c u t el sl n b a c k g r o u n d ：a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ( a m l ) i su s u a l l yc o n s i d e r e dt o b ei n d u c e d b y m u t a t i o n l e a d i n g t oc e l lu n c o n t r o l l e d p r o l i f e r a t i o n ， d i f f e r e n t i a t i o na n d o ra p o p t o s i sp m h w a yc h a n g e s a sam e m b e ro fc e b p ( c c a a t e n h a n c e rb i n d i n gp r o t e i n ，c e b p ) f a m i l y ，c e b p ai sa ni m p o r t a n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r d u r i n g t h e m y e l o i dp r o g e n i t o r c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d d if f e r e n t i a t i o n c e b p ap l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ep r o c e s so fa m lc e l l p r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o ni nh e m a t o p o i e t i cs t e ms y s t e m t h er e c e n t l y w h oc l a s s i f i c a t i o no fl e u k e m i ae m p h a s i z e so nar o u t i n em m a t i o n a ls c r e e no f c e b p am u t a t i o n s ，a s s o c i a t e df l t 3a n dn p m 1 g e n em u t a t i o n sw i t h i na m l p a t i e n t sb o n em a r r o wf o ri n i t i a ld i a g n o s i s c e b p ah a sb e c o m ea l li m p o r t a n t p r o g n o s t i cr e f e r e n c ei n d i c a t o r ，a n dm a yb ean e wt h e r a p e u t i ct a r g e tf o ra m l p a t i e n t s t h ed e s t r u c t i o no rl o s s e so fc e b p af u n c t i o na r eo f t e na s s o c i a t e d w i t ht h eo c c u r r e n c eo fa m l t h er e t r i e v eo fc e b p ae x p r e s s i o nc a r lb ea t r e a t m e n tf o ri n d u c i n gd i f f e r e n t i a t i o n al a r g en u m b e ro fs t u d i e ss h o wt h a t ， a m l p a t i e n t sw i t hc e b p am u t a t i o n sm a i n l yi n c l u d ef r a m e s h i f tm u t a t i o n si n t h en - t e r m i n a la n dd i s r u p t i o nm u t a t i o n si nt h ec - t e r m i n a lb a s i cl e u c i n ez i p p e r ( b z i p ) r e g i o n t h ep r e s e n c eo fc e b p am u t a t i o n sh a v eb e e nd e s c r i b e da n d d e m o n s t r a t e da ss i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c i n gt h eo u t c o m eo fp a t i e n t s ，s u c ha s e v e n t f r e es u r v i v a l ( e f s ) ，o v e r a l ls u r v i v a l ( o s ) a n dc o m p l e t er e m i s s i o n ( r d ) t h ep a t i e n t sw i t hl o w e rr e l a p s er a t ea n dh i g h e ro sa r ec l o s e l yr e l a t e dt ot h e c e b p am u t a t i o n s t h e r e f o r e ，t h ea c c u r a c yo ft h ec e b p am u t a t i o nd e t e c t i o n h a sa g r e a ts i g n i f i c a n c y f o r t h et r e a t m e n ta n dp r o g n o s i sw i t ht h er i s k c l a s s i f i c a t i o nf o ra m l p a t i e n t s o b j e c t i v e ：d e t e c tc e b p am u t a t i o n si na m lp a t i e n t s ；c o m p a r et h e p e r f o r m a n c e o fd i r e c t s e q u e n c i n gm e t h o da n dm u l t i p l e x - p c rf r a g m e n t a n a l y s i sf o rd e t e c t i n gc e b p am u t a t i o n si np a t i e n t sw i t ha m l ；a n a l y z et h e 3 英文摘要 r e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h e p a t i e n t s w i t hc e b p am u t a t i o n sa n dc l i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ；a n do b s e r v et h ec l i n i c a lo u t c o m eo fc e b p a w ta n dc e b p a m u t a t i o np a t i e n t sw h or e c e i v dr e m i s s i o ni n d u c t i o nt h e r a p y m e t h o d s ：f i r s t l y ，t h ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) d i r e c ts e q u e n c i n g w a su s e dt od e t e c t6 0s a m p l e so fb o n em a r r o wa n d10s a m p l e so fp e r i p h e r a l b l o o d t h e n ，m u l t i p l e x - p e rf r a g m e n ta n a l y s i sm e t h o dw a su s e dt od e t e c tt h e a m lp a t i e n t sw i t hc e b p am u t a t i o n s a g a i n t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n c e b p am u t a t i o n sa n d p a t i e n t c h a r a c t e r i s t i c sw a s a n a l y z e du s i n g i n d e p e n d e n t - s a m p l e s tt e s t c rr a t e c o m p a r i s o n sw e r ep e r f o r m e du s i n g c h i s q u a r et e s t t h ek a p l a n m e i e rm e t h o dw a su s e dt oe s t i m a t ed i s t r i b u t i o n s o fr da n do so fp a t i e n t s d i f f e r e n c e so fr da n do sb e t w e e nt w os u r v i v a l d is t r i b u t i o n sw e r ea n a l y z e du s i n gt h el o g r a n kt e s t r e s ul t s ：p c rd i r e c ts e q u e n c i n gs h o w e d2 2c e b p am u t a t i o n si n8 ( 13 3 ) o f6 0 ，i n c l u d i n g5 ( 6 2 5 ) c a s e sw i 1b i a l l e l i cm u t a t i o n sa n d3 ( 3 7 5 ) c a s e sw i t hs i n g l em u t a t i o n s ，o fw h i c ht h e r ei so n l ylc a s ew i t h n t e r m i n a lf r a m e s h i f fm u t a t i o n ；1c a s ew i t hn t e r m i n a lf r a m e s h i f f m u t a t i o nw a sn o td e t e c t e dw i t hm u l t i p l e x p c rf r a g m e n ta n a l y s i sm e t h o d t h e m e t h o dd e t e c t sc e b p am u t a t i o np e r c e n t a g e so f 9 3 c o m p a r e dw i t ht h ep c r d i r e c ts e q u e n c i n gm e t h o di nt h i ss t u d y ；t h e r ei sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e b e t w e e nt h ec e b p a w ta n dc e b p am u t a n tp a t i e n t si nt e r m so fs e x ，a g e ， b o n em a r r o wb l a s tc e l lc o u n t ，p l a t e l e tc o u n ta n dw h i t eb l o o d c e l l ( w b c ) c o u n t b u tc e b p am u t a n tp a t i e n t sh a v em o r eh e m o g l o b i nt h a nt h ec , r e b p a w t p a t i e n t s ；t h ei n v e r s ec o r r e l a t i o nb e t w e e ne x p r e s s i o no fc e b p o c w ta n d c d 7h a sn o tb e e nd e t e c t e dw i t ht h es a m p l e si nt h i ss t u d y t h e r ea r eo t h e r k i n d sp a t i e n t sb e s i d e sc e b p 盯c d 7 十a n dc e b p a + c d 7 。p a t i e n t sw i t h 6 0 s a m p l e s pv a l u e ( p = 0 9 2 6 ) i sn o tc o n s i d e r e ds t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t b u t c d 7 十i sn o td e t e c t e di nc e b p am u t a n tp a t i e n t s ；c r ，o s ，a n di 国o f c e b p 仪m u t a n tp a t i e n t sa r ea l lh i g h e rt h a nc e b p a - w tp a t i e n t s ，b u tt h e d i f f e r e n c ei sn o ts t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ( 尸v a l u e sa r eo 5 6 9 ，0 1 3 0a n do 51 0 ， r e s p e c t i v e l y ) ；c r ( 8 7 5 ) a n dr d ( 9 2 5 ，9 5 c i ：7 7 8 1 0 7 2 ) o f c e b p 仅十c d 7 。p a t i e n t si ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s eo fc e b p 盯c d 7 + ( c r 4 英文摘要 2 5 a n dr d5 18 8 ，9 5 c i ：3 3 2 5 7 0 5 0 ) ，t h ed i f f e r e n c e so f t h e s et w og r o u p s i ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ( 尸= o 012a n dp = o 0 0 8 ，r e s p e c t i v e l y ) c o n c l u s i o n s ：t h e s er e s u l t ss h o wt h a tm u t a t i o n si nt h et r a n s c r i p t i o n f a c t o rc e b p aa r ef o u n di n13 3 a m lp a t i e n t s ，a n db i a l l e l i cm u t a t i o n s o c c u ri n6 2 5 a m lp a t i e n t s ；( 爹a l t h o u g hp c rd i r e c ts e q u e n c i n gi sah i g h a c c u r a c yd e t e c t i o nm e t h o dt o s c r e e nc e b p am u t a t i o n ，t h ec o m b i n a t i o no f d i r e c ts e q u e n c i n ga n dm u l t i p l e x - p c rf r a g m e n ta n a l y s i sr r l a yb ea no p t i m a l a p p r o a c hf o rd e t e c t i n gt h em u t a t i o n si na m l i nf u t u r ec l i n i c a la p p l i c a t i o n t h e r ei sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h ec e b p q - w ta n dc e b p 0 【 m u t a n tp a t i e n t si nt e r m so fs e x ，a g e ，b o n em a r r o wb l a s tc e l lc o u n t ，p l a t e l e t c o u n ta n dw h i t eb l o o dc e l l ( w b c ) c o u n t ；t h e r eo n l yi sal i t t l ed i f f e r e n c e b e t w e e nt h ec e b p a - w ta n dc e b p am u t a n tp a t i e n t si nt e r m so fc ro s ， a n dr di nt h i s s t u d y ，w h i c h a r es h o u l db ef u r t h e ro b s e r v e d c e b p a + c d 7 c o u l db eu s e da sap r o g n o s t i cm a r k e ro fr e l a t i v e l yf a v o r a b l e o t l t c o m e k e yw o r d s ：a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ；c e b p a ；g e n em u t a t i o nd e t e c t i o n ； p r o g n o s i s ；c d 7 5 研究论文 c e b p a 基因突变对急性髓系白血病( a m l ) 临床预后影响 - 工- 型蔓， 鄹吾 急性髓系白血病n 3 ( a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ，a m l ) 具有增殖过度 和分化阻滞的遗传学特征，表现为一种或多种造血干细胞及祖细胞恶变， 失去正常的增殖、分化及成熟能力，无控制的持续增殖，逐步取代正常造 血骨髓并经血液侵润至全身组织及器官。目前有学者认为，增殖过度和分 化阻滞所累及的相关基因突变的共同作用是引起a m l 发生的主要原因，其 中增殖过度所引起的基因突变主要包括b c r - a b l 、t e l p d g f rb 、c - k i t 等，以持续激活的酪氨酸激酶而影响下游生长因子的方式，使造血系统处 于过度增殖状态；另一类基因的突变可使一些正常情况下维持造血系统分 化的重要转录因子如a m l i - e t o 、p m l - r a rq 等，通过融合基因的形式丧失 分化功能；还有c e b pq ( c c 从t e n h a n c e rb i n d i n gp r o t e i n q ) 和p u 1 等基因以点突变形式存在的突变可诱导粒系分化，使造血细胞分化阻滞。 大量研究表明，作为c e b p ( c c 从t e n h a n c e rb i n d i n gp r o t e i n ， c e b p ) 家族成员之一的髓系转录因子c c a a t 增强子结合蛋白一q 晗9 1 ( c e b pq ，遗传学名称又为c e b p a ) 是髓系祖细胞增殖与分化过程中一 个重要的转录因子，在诱导粒系分化、抑制细胞增殖方面具有重要作用。 近年来，大量研究表明c e b pq 基因的表达水平、破坏和丧失与a m l 的发 生、发展、治疗以及预后密切相关，有望成为a m l 新的治疗靶点。了解 c e b pq 的结构功能、致病机制及检测方法对a m l 的发病、治疗及预后有 重要意义。 本实验探讨a m l 患者中c e b pq 基因突变的发生概率及其突变情况， 为后续c e b pq 基因突变检测以及与临床治疗和预后的进一步研究提供 检测方法和技术支持。 1 材料 1 1 研究对象 材料与方法 6 研究论文 a m l 患者( 初诊病例组g 卜a m l ) ：6 0 例，选自2 0 0 9 年1 0 月至2 0 1 0 年1 0 月在河北医科大学第二附属医院住院就诊的病例，男3 3 例，女2 7 例，年龄1 6 6 5 岁，中位年龄4 3 5 岁。诊断标准参考恶性血液病诊断 与治疗。其中m 。2 例，m ：3 2 例，m 41 0 例，m 51 3 例， m 63 例，如 t a b l ei 所示免疫学分型采用流式细胞术。所有随访至2 0 1 1 年2 月，中 位随访时间6 ( 1 1 5 ) 个月。 正常人( 志愿组g 2 ) ：1 0 例，选自2 0 0 9 年1 0 月至2 0 1 0 年l o 月在河 北医科大学第二附属医院体检中心的1 0 例体检健康正常者，其中男6 例， 女4 例，年龄1 8 4 5 岁，中位年龄3 8 5 岁。 1 2 主要仪器 仪器名称与型号 一2 0 低温冰箱 - 8 0 低温冰箱 4 低温冰箱 低温高速离心机 台式离心机( l a b o f u g e 4 0 0 ) 平板离心机 l x - 1 0 0 手掌型离心机 电子天平a e l 0 0 电泳仪( d y y - i i l 4 型) d n a 扩增仪( p e 4 8 0 ) 紫外透射仪( u v - 2 0 0 0 ) 读胶仪( a 1 p h a i m a g e r 12 0 0 ) 紫外分光光度计t u - 18 0 0 流式细胞仪f a c sc a n t oi i 微量加样器 快速混匀器 电子天平b s 2 3 0 s 超净台 v d - 6 5 0 型桌上式洁净台 高压灭菌锅 产地 日本s a n y o 公司 日本s a n y o 公司 青岛海尔公司 德国h e r a e u s 公司 德国h e r a e u s 公司 白洋离心机厂 江苏海门麒麟医用仪器厂 德国m e t t l e r 公司 北京六一厂 美国p e 公司 上海天能公司 美国s t 公司 北京普析通用仪器公司 美国b d 公司 苏兰t h e r m o 公司 常州国华仪器有限公司 德国s a r t o r i u s 公司 日本s a n y 0 公司 苏州净化设备有限公司 日本s a n y o 公司 7 研究论文 制冰机s i m f 1 2 4 电热恒温干燥箱 一次性塑料离心管 日本s a n y o 公司 黄石恒丰医疗器械有限公司 c o r n i n g ，u s a 1 3 主要试剂 名称产地 g o l d v i e w北京赛百盛公司 d e p c 水美国p r o m e g a 公司 t r i z o l美国g i b c o 公司 随机引物北京赛百盛生物公司 引物北京赛百盛生物公司 t a qd n a 聚合酶北京赛百盛生物公司 d n al a d d e r 北京赛百盛生物公司 琼脂糖美国p r o m e g a 公司 t r is 碱美国p r o m e g a 公司 分析纯e d t a北京化学试剂公司 分析纯硼酸天津化学试剂公司 硅胶模型基因组d n a 提取试剂盒北京赛百盛生物公司 w iz a r dd n ac l e a n - u ps y s t e m 试剂美国p r o m e g a 公司 盒 2 方法 2 1 待测样品制备 6 0 例a m l 初诊患者( g i - a m l ) 骨髓标本及1 0 例正常者( g 2 ) 的外周 血标本，参照d n a 提取试剂盒( 北京赛百盛生物公司) 说明书在无菌条件 下提取基因组d n a 。 2 2d n a 的提取及定量与质量鉴定 ( 1 ) 将1m 1 骨髓液( 或外周血) 1 3 0 0 0r p m 离心2m i n ，小心弃上清( 血 浆) ，收集沉淀； ( 2 ) 加入i 0 0u lt e 缓冲液，振荡混匀，加入1m l g n 结合液，轻柔颠倒 混匀； ( 3 ) 将混合液小心转入离心纯化柱，静置至少3m i n ，13 0 0 0r p m 离心3 0 秒，倒掉收集管中的废液； 研究论文 ( 4 ) 将剩下的混合液也转入离心纯化柱，重复第3 步； ( 5 ) 0 5m l 漂洗液洗2 3 次，1 3 0 0 0r p m 离心3 0s ； ( 6 ) 将漂洗完毕的离心纯化柱再离心1 分钟，彻底去除残留漂洗液； ( 7 ) 将纯化柱套入一个干净的1 5m 1 离心管中，开盖放置2 - 3 分钟使漂 洗液挥发，加入1 0 0l a1 t e 缓冲液于硅胶模上( 不能粘在管壁上) ，静 置2m i n 后1 3 0 0 0r p m 离心1m i n ； ( 8 ) 将洗脱液重又吸入纯化柱中，再次洗脱，即可获得较高产量的d n a 基 因组； ( 9 ) 离心管中收集到的液体即为洗脱下来的d n a 基因组，取2u1 电泳( 1 琼脂糖，1 2 0 v ，2 0 分钟) 检测； 注意l o o m lt e 缓冲液的制备流程为：将l m ll m o l lt r i s - h c l ( p h7 6 ) 和0 2 m l0 5 m o l le d t a ( p h8 0 ) 混匀，补超纯水至1 0 0m l ，高压灭菌， 室温保存。 取总d n a2u1 加蒸馏水至2 0 0u1 ，在紫外分光光度计上用同体积蒸 馏水校零后，用紫外分光光度仪检测其浓度及纯度，a 2 6 0 a 2 8 0 在1 8 - 2 0 之间。所有用于p c r 的d n a 样本的a 2 6 0 a 2 8 0 比值均大于1 8 。 2 3p c r 扩增c e b p a 基因 p c r 直接测序引物设计 引物采用g e n e r u n e r3 0 5 ( h t t p ：w w w g e n e r u n n e r ：t o m ) 软件设计， 通过g e n e b a n k 检索到t a p 2 基因完整的基因组序列，以基因组d n a 为模 板分四段扩增c e b pq 基因，据此设计引物( 详见t a b l e2 ) ，分别可以 得到4 种扩增产物，覆盖c e b pq 基因编码区。可以对c e b pq 中的1 2 0 1 个b p 进行突变检测与分析。值得注意的是，本研究中引物的设计针对 g 卜a m l 和g 2 所有分组的样本进行c e b pq 基因突变检测。表中的引物由 北京赛百盛生物技术有限公司合成。 c e b pq 正常序列可以通过g e n e b a n k 进行查询，目前已有的文献主 要涉及的参考序列有u 3 4 0 7 0 n 、n m _ 0 0 4 3 6 4 2 n 别、n m _ 0 0 4 3 6 4 3 和 x m 一0 0 9 1 8 0 3 , a 3 等，这些序列均能描述人类的c e b pa 序列构成，但其起 始点略有不同，本研究工作选择u 3 4 0 7 0 ( v e r s i o n ：u 3 4 0 7 0 1 ，g i ：1 0 4 1 7 3 2 ， 全长3 3 1 8b p ) 序列。 9 研究论文 p c r 反应体系为2 5 0ul ，包括d n a 2 0l al ，2 xg o t a qg r e e nm a s t e r m i x1 2 5u1 ，l o p m o l l a1 上、下游引物各2 0l a1 ，余用d e p c 水补足至 2 5l j ll 。混匀后快速离心一次。 扩增l 3 片段时，p c r 扩增反应条件为：9 5 。c 预变性5m i n ，1 个循 环；变性9 5 3 0s ，退火6 7 3 0s ，延伸7 2 * c1m i n ，共3 5 个循环； 最后延伸7 2 8m i n ； 扩增4 片段时，p c r 扩增反应条件为：9 5 。c 预变性5m i n ，1 个循环： 变性9 5 3 0s ，退火6 6 4 5 s ，延伸7 2 4 5s ，共3 6 个循环；最 后延伸7 2 1 0m i n 。 p c r 产物的分析：取上述产物2u1 经2 琼脂糖凝胶电泳( 含 g o l d v i e w ) 9 0 v ，4 5 分钟( 电泳缓冲液为0 5xt b e ) ，在紫外灯下观察结 果，并在读胶仪a l p h a i m a g e r l 2 0 0 上进行扫描，在相应位置上显示有条带 者，为有目的基因的表达，反之为没有目的基因的表达。 p c r 多片段快速测序引物设计 多片段方法测序，选择与文献n 相同的引物，如所示，荧光标记的引 物序列引物具体设计详见t a b l e3 ，以待测者的d n a 为模板，分别用以上 3 对荧光标记的引物进行扩增，得到的3 种扩增产物，可以覆盖c e b pq 基因编码区。表中的引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成。 特别注意的是，由于本引物的设计目的是为了证实p c r 多片段快速测 序可能存在不准确的测序结果，因此，考虑到检测成本的问题，本引物设 计主要针对g 1 - a m l 组已检测到突变的患者例样本进行再次c e b pq 基因 突变检测。 p c r 反应体系为2 5 ou1 ，包括d n a 2 0l al ，2 xg o t a qg r e e nm a s t e r m i x1 2 5ul ，l o p m o l l a1 上、下游引物各2 0l al ，余用d e p c 水补足至 2 5u1 。混匀后快速离心一次。 扩增l 2 片段时，p c r 扩增反应条件：9 5 预变性3m i n ，1 个循环； 变性9 5 3 0s ，退火6 8 。c3 0s ，延伸7 2 1m i n ，共3 5 个循环；最 后延伸7 2 1 0m i n 。 扩增3 片段时，p c r 扩增反应条件：9 5 预变性3m i n ；变性9 5 3 0 s ，退火6 5 3 0s ，延伸7 2 4 5s ，共3 5 个循环；最后延伸7 2 1 0 l o 研究论文 2 4c e b p a 基因突变检测 一 相关分析软件和数据库 令 c h r o m a s2 2 3 ( h t t p ：哪t e c h n el y s i u m c o m a u ) g e n e r u n n e r3 0 5 ( h t t p ：w w w g e n e r u n n e r c o m ) 令g e n b a n k 数据库 、c e b p a 基因突变检测 基因突变具体检测步骤如下所示： 第一步用c h r o m a s 软件打开准备分析的a b i 格式文件，并将这些a b i 文件转换成对应的文本格式数据； 第二步将上述文本格式数据拷到g e n er u n n e r 指定工作目录，并保存( 例 如e x a m p l e l s e q ) ，将目的片段序列也拷进去并保存( 例如 t a r g e t l s e q ) ； 第三步单击“m u l t i p l ea 1 i g n m e n tp r o j e c t e 快捷菜单，将上述保存 的e x a m p l e l s e q 和t a r g e t l s e q 导入“s e q u e n c ef i l e si n p r o j e c t ”栏中，单击“o k ”，此时，软件会自动分析序列位置 的匹配情况，可方便地查看碱基突变的位置，从而为分析序列 的突变情况提供直观的展示； 第四步通过c h r o m a s 软件查看对应碱基突变区域的峰图，从而可以判断 是否存在突变以及存在何种类型的突变。值得注意的是，还可 通过双向测序来进一步判断待对比的目的片段是否正确。 g e n b a n k 数据库 g e n b a n k 属于一个序列数据库的国际合作组织，包括e m b l 和d d b j ， 包含7 0 0 0 0 多种生物的核苷酸序列。每条纪录都有编码区( c d s ) 特征的 注释，还包括氨基酸的翻译。同一个序列存在不同的访问号和版本号，因 此，在基因突变分析中需要选择合适的序列。 2 5 治疗方案及疗效判 6 0 例a m l 患者给予常用标准方案诱导缓解治疗：如i a e 方案( i d a l o m g m d ，i v ，d l 一4 ，a r a cl o o m g m ，i v ，q 1 2 ，d l 一7 ，依托泊苷l o o m g m 2 d ，i v ，d 5 7 ) ；d a 方案( d n r4 0m g m 2 d ，i v ，d l 一4 ，a r a c1 0 0m g i n d ，i v ，d l 一7 ) ；h a 方案( a r a - cl o o m g m 2 ，i v ，q 1 2 ，d l 一7 ，高三尖 杉酯碱4m g m 2 d ，i v ，d l 一7 ) 。于c r 后1 2 周，可给予以上诱导方案 研究论文 巩固1 个疗程。 2 6 统计学处理 所有数据应用s p s s1 3 0 统计软件进行分析处理。计数资料进行卡方 检验，两组间差异比较采用t 检验。生存分析应用k a p l a n m e i e r 生存曲 线法，多个样本生存曲线比较采用l o g - r a n k 检验。整体存活率( o s ) 定 义为自诊断到死亡或末次随访日期。缓解持续时间( r d ) 定义为自完全缓 解到第一次复发时间或末次随访日期。所有检验均以p o 0 5 有统计学意 义。 结果 1 基因突变检测结果分析 采用t a b l e2 所示的引物进行检测，f i g 2 为对应第4 个引物的电泳 图。经p c r 直接测序表明，6 0 例a m l 患者中c e b pc i 基因突变患者有8 例，其发生率约为1 3 3 ( 8 6 0 ) ，患者的突变情况如下：t a b l e4 所示， 其中m 11 例，m 24